陳興麟，劉 洋，羅土炎，王昌毓，楊海寧，曾潤穎*

(1.自然資源部第三海洋研究所， 福建 廈門 361005; 2.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所， 福建 福州 350001；3.寧波大學食品與藥學學院， 浙江 寧波 315832)

亞洲是水稻的主要產(chǎn)銷區(qū)，90%水稻生產(chǎn)和87%銷售是在亞洲進行的[1]，中國是世界最大的水稻生產(chǎn)及銷售國[2-3]。福建省是中國龍須菜生產(chǎn)大省，通過施用由龍須菜制備的有機海藻寡糖生物肥，實現(xiàn)福建省主要糧食作物水稻的提質(zhì)增產(chǎn)，對推進福建省農(nóng)藥化肥零增長、減少農(nóng)村面源污染有著重要意義。李娟等[4]通過832個水稻田間肥效試驗，制定了福建省水稻氮磷鉀施肥限量標準。在有限施用氮磷鉀肥的條件下，通過將寡糖作為增效劑，進一步提升作物的產(chǎn)量，實現(xiàn)可持續(xù)耕作有重要意義[5]。吳家強等[6]發(fā)現(xiàn)施用海藻肥能加快水稻生長幅度，增強抗病性，增加株高，從而提高產(chǎn)量，增產(chǎn)幅度可達13.5%。李昉峻等[7]研究表明施用海藻糖能抑制水稻幼苗對鎘的吸收，降低鎘導致的葉綠素含量下降的幅度。與化肥相比，海藻肥富含氨基酸、天然植物激素前體物等多種高濃度活性物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)作物體內(nèi)的激素和營養(yǎng)平衡，增強免疫力，促進作物增產(chǎn)增收，成為肥料制造領(lǐng)域的熱門產(chǎn)品[8-9]。龍須菜可以吸收水體中的富余養(yǎng)分，抑制有害的赤潮微藻，回收后，還可進一步制備成土壤改良劑、生物燃料、生物肥料等[10-14]。用傳統(tǒng)的方法從龍須菜中提取瓊膠，會消耗大量的強酸、強堿，并產(chǎn)生難以利用的副產(chǎn)物藻渣，造成環(huán)境污染[15-16]。若進一步通過酸解法，將瓊膠制備成寡糖，則會消耗額外的強酸，并且產(chǎn)物不均一[17-18]。按此工藝生產(chǎn)的海藻寡糖，從成本和品質(zhì)上看，都無法滿足農(nóng)業(yè)用肥的需求。

本課題組利用深海原位富集的方法，從海水中分離得到細菌Flammeovirgasp.OC4，并通過菌株和龍須菜共培養(yǎng)的工藝，高效地獲取海藻寡糖[19-21]。該工藝大大降低了成本，使原來多用于高端化妝品、保健品的海藻寡糖，有了更廣泛的應用領(lǐng)域。其中，將該海藻寡糖與膠質(zhì)芽孢桿菌Bacillusmucilaginosus001B復配成海藻寡糖生物肥，能使多種作物提質(zhì)增產(chǎn)。在福建省南靖縣，鐵觀音茶樹噴施海藻寡糖生物肥可增產(chǎn)10.6%，并且茶葉的百芽重、維生素C、茶多酚等多個指標均有提高[22]。在重慶市酉陽縣南腰界鄉(xiāng)，噴施海藻寡糖生物肥的中華竹稻(聚兩優(yōu)746)，平均每667 m2增產(chǎn)24.3 kg，產(chǎn)投比達到2.6 ∶ 1[23]。前期研究表明海藻寡糖復配膠質(zhì)芽孢桿菌的生物肥能夠促進水稻提質(zhì)增產(chǎn)，但各個成分的單獨作用效果有待進一步研究。本研究以在南平地區(qū)廣泛種植的甬優(yōu)1540為試驗對象，通過分別施用單一成分的肥料以及復合肥料，探討肥料中各成分的作用機理。通過分析不同施肥水平下水稻產(chǎn)量、生理指標、根系土壤指標、微生物群落構(gòu)成的差異，找出進一步優(yōu)化海藻肥配方的依據(jù)，為水稻產(chǎn)業(yè)的減肥增效提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

膠質(zhì)芽孢桿菌Bacillusmucilaginosus001B由本實驗室前期從大田中分離得到。海藻寡糖是以深海細菌Flammeovirgasp.OC4發(fā)酵龍須菜制得，為新瓊二糖、瓊膠三糖、新瓊四糖、瓊膠五糖、新瓊六糖的混合物。供試水稻品種為甬優(yōu)1540。

1.2 田間試驗設(shè)計

試驗于2018年在政和縣石屯鎮(zhèn)松源村進行，海拔180 m，土質(zhì)為砂壤土，肥力中等。水源條件好，排灌方便，前茬冬閑。試驗田選擇條件基本一致的連片田塊進行，設(shè)置了4個處理，處理A(66.7%海藻寡糖+33.3%膠質(zhì)芽孢桿菌)、處理B(100%海藻寡糖)、處理C(100%膠質(zhì)芽孢桿菌)、CK(清水對照)，機耕方式。各處理不設(shè)重復，處理A面積3 773.52 m2；處理B面積3 873.53 m2；處理C面積3 386.84 m2；清水對照(CK)面積3 193.49 m2。

試驗于6月15日播種，采用秧盤育秧，7月10日移栽，選用“久保田”六行機插秧，株行距30 cm×22 cm。每667 m2施51%復合肥30 kg作基肥，同時分別混入100 g各自類型的海藻寡糖微生物肥。此外，通過葉面肥形式增施3次海藻寡糖微生物肥(每667 m2施肥8 g)。第1次在8月3日水稻盛蘗時結(jié)合防治稻飛虱進行；第2次于8月18日結(jié)合防治稻飛虱、螟蟲時噴施；第3次于9月25日齊穗時噴施。11月5日收獲。

1.3 葉綠素相對含量的測定

于分蘗后期對各處理測定葉片葉綠素相對含量，選取主葉尖的下端10 cm處中間測量，每個處理測定100個數(shù)據(jù)。檢測設(shè)備采用LYS-A型葉綠素測定儀(杭州綠博儀器有限公司)。

1.4 水稻產(chǎn)量及籽粒品質(zhì)測定

于成熟期對各個處理以梅花型五點取樣，每個樣取1.11 m2測產(chǎn)量(參考用)；實際產(chǎn)量以實割實收過地磅計量為準。

將各處理的稻米，脫粒后混勻，根據(jù)(NY/T 2017-2011《植物中氮、磷、鉀的測定》)、(NY/T 2420-2013《植株全鉀含量的測定 火焰光度法》)測定稻米中的全氮、全磷、全鉀。

1.5 土壤樣品采集與理化指標測定

將各處理地塊進行三等分，每個地塊以梅花型五點取樣獲取水稻植株的根系土壤，混勻后作為1個樣品。依照(NY/T 1121.2-2006《土壤pH的測定》)、(NY/T 1121.6-2006《土壤有機質(zhì)的測定》)、(HJ 717-2014《土壤質(zhì)量 全氮的測定 凱氏法》)、(HJ 632-2011《土壤總磷的測定 堿熔-鉬銻抗分光光度法》)、(NY/T 87-1988《土壤全鉀測定法》)、(LY/T 1228-2015《森林土壤氮的測定》)、(NY/T 1121.7-2014《土壤檢測第7部分：土壤有效磷的測定》)、(NY/T 889-2004《土壤速效鉀和緩效鉀的測定》)、(NY/T 890-2004《土壤有效態(tài)鋅、錳、鐵、銅含量的測定 二乙三胺五乙酸(DTPA)浸提法》)、(NY/T 1121.13-2006《土壤檢測 第13部分：土壤交換性鈣和鎂的測定》)，對土壤相關(guān)理化指標進行測定。

1.6 土壤DNA提取及高通量測序

采用OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit提取各土壤樣本DNA，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量。以定量的DNA為模板對菌群的V3～V4區(qū)進行PCR擴增，所用引物為融合了Miseq測序平臺的引物，341F引物：(barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物：GACTACHVGGGTATCTAATCC。PCR采用30 μL反應體系，程序為：94℃預變性3 min；5個循環(huán)(94℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s)；再20個循環(huán)(94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s)，然后，72℃延伸5 min。取20 ng的擴增產(chǎn)物作為模板，引入Illumina橋式PCR兼容引物進行第2輪擴增，程序為：95℃預變性3 min；5個循環(huán)(94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s)；然后，72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測，利用磁珠(Agencourt AMPure XP)對DNA進行純化回收，利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，以20 pmol濃度上機測序[委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量宏基因組微生物測序]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel、R、OriginPro 8.0等軟件進行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同施肥處理對水稻葉綠素的影響

水稻葉片的葉綠素含量高低與光合效率有較強的相關(guān)性[24]。如圖1所示，處理B的葉綠素含量最高，其次是處理A。處理B為100%的海藻寡糖，處理A含66.7%的海藻寡糖，這說明肥料中的海藻寡糖可能有促進水稻葉片葉綠素合成的功能，在一定范圍內(nèi)，較高的濃度有較好的促合成效果。而肥料A的另一成分膠質(zhì)芽孢桿菌對促進葉綠素合成的效果不明顯。處理C(100% 膠質(zhì)芽孢桿菌)與對照(CK)的葉綠素相對含量差別不顯著。與對照(CK)相比，處理A和處理B的葉綠素含量增幅均超過17.37%。張運紅等[25]研究發(fā)現(xiàn)增施海藻寡糖增效尿素能使水稻不同時期的葉綠素含量提高10.69%至19.58%。本研究的趨勢與其相同，表明低分子量的海藻寡糖可增加水稻光合色素含量，提升水稻光合效率有著重要影響。

2.2 不同施肥處理對水稻產(chǎn)量的影響

根據(jù)實收產(chǎn)量測算，各處理的水稻每667 m2(下同)產(chǎn)量為523.1～592.2 kg(表1)。處理A的產(chǎn)量最高，為592.2 kg；處理C的產(chǎn)量次之，為580.0 kg；處理B的產(chǎn)量較低，為552.2 kg；清水對照(CK)的產(chǎn)量最低，為523.1 kg。結(jié)果表明，增施海藻寡糖或膠質(zhì)芽孢桿菌對水稻都有增產(chǎn)作用，增產(chǎn)效果分別為5.6%、10.9%。而增施海藻寡糖和膠質(zhì)芽孢桿菌的水稻，增產(chǎn)則達到13.2%，說明海藻寡糖和膠質(zhì)芽孢桿菌對水稻的增產(chǎn)有著協(xié)同作用。有研究表明，對于同一種肥料，在不同時期進行葉面施肥，會導致水稻的增產(chǎn)或減產(chǎn)[26]。本試驗盡管實現(xiàn)了增產(chǎn)，但進一步優(yōu)化其復配比例，探究不同時期施肥的效果仍有意義。五點測產(chǎn)的結(jié)果略大于實收產(chǎn)量，但總體趨勢不變，最高的單位面積產(chǎn)量仍是海藻寡糖和膠質(zhì)芽孢桿菌復配的處理。

表1 不同施肥處理水稻產(chǎn)量比較

2.3 不同施肥處理對水稻籽粒的影響

研究表明在施氮量較高條件下，成熟期水稻籽粒中的氮濃度顯著高于常規(guī)施氮處理[27]。本試驗結(jié)果(表2)表明，增施100%海藻寡糖的處理B，水稻籽粒中的全氮和全磷含量最高，分別高于對照(CK)7.8%和6.3%，增施海藻寡糖和膠質(zhì)芽孢桿菌復合肥的處理A，水稻籽粒中全鉀的含量最高，高于對照(CK)25.0%。由于各處理增施的海藻寡糖生物肥均為少量的肥料增效劑，其施氮水平與對照一致，而籽粒中氮濃度高于對照(CK)，說明增施的海藻寡糖生物肥有利于水稻籽粒的物質(zhì)積累，改善營養(yǎng)指標。

表2 不同施肥處理水稻籽粒的氮磷鉀分析比較

2.4 不同施肥處理水平對根系土壤理化性質(zhì)的影響

有研究表明，土壤pH值會影響早稻及晚稻品種的株高、鎘含量、結(jié)實率、每穗實粒數(shù)、千粒重、單株產(chǎn)量等多個指標[28]。如表3所示，根系土壤pH最高的是處理B，為5.39；而最低的是處理A，為4.92。增施海藻寡糖生物肥的各個處理，其根系土壤的有機質(zhì)含量均高于對照(CK)，全氮、全鉀含量也均高于對照(CK)。而對照(CK)的根系土壤全磷含量最高，達到1.52 g·kg-1。

表3 不同施肥處理對根系土壤理化性質(zhì)的影響

2.5 不同施肥處理根系土壤菌群差異分析

土壤微生物是土壤的重要組成部分，通過分析其根系微生物的多樣性變化，可以判定施肥條件的效果[29-30]。高通量宏基因組微生物測序具有不受培養(yǎng)條件限制、快速、準確、數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點，已被廣泛用于土壤微生物生態(tài)學研究[31]。如表4所示，本試驗的12個樣本的高通量測序共獲得749 157條序列，經(jīng)質(zhì)量控制(QC)后，還有746 097條有效序列。原始序列的平均長度為455.61 bp，QC后則為415.43 bp。QC后，各樣本的有效序列數(shù)在48 452條和82 161條之間，平均長度在412.95 bp和419.91 bp之間。測序深度滿足進一步分析的要求。

表4 各樣本高通量測序結(jié)果

樣本聚類樹圖可以通過樹枝結(jié)構(gòu)直觀地反映出多個樣品間的相似性和差異關(guān)系。如圖2所示，各處理的3個樣本大都在同一分支，說明各處理的組間差異大于組內(nèi)差異，添加海藻寡糖生物肥會導致根系土壤的微生物群落發(fā)生改變。而B1相對B2、B3的距離較遠，可能是由于高通量測序時，有效序列數(shù)差異過大導致的。B1的有效序列數(shù)為71 773條，而B2、B3均未超過53 463條。值得注意的是，CK3的有效序列數(shù)(82 161條)也大大超過CK1(51 997條)和CK2(60 865條)，但在聚類分析中，盡管CK1和CK2在同一分支，它們與CK3的距離仍小于與其他處理的距離，因此，CK3和CK1、CK2仍在同一上級分支中。這說明了未施用海藻寡糖生物肥的根系土壤有更大的相似性。

Procrustes test(強制一致性檢驗)是檢驗兩個矩陣相關(guān)關(guān)系的非參數(shù)統(tǒng)計方法，即使用簡化的空間代替全部距離矩陣[32]。圖3中不同顏色代表不同樣本，樣本間相似度越高則在圖中越聚集。如圖3所示，除了處理B外，其他各處理的各個樣本相對聚集，說明不同處理對其土壤菌群的影響趨勢較為一致。處理B與其他各處理之間的距離較大，該處理內(nèi)各樣本之間的距離也較大，可能是因為海藻寡糖能促進或者抑制根系土壤中某些微量菌群的生長，而起始狀態(tài)下微小的菌群差異經(jīng)長期的生態(tài)過程放大導致的。

進一步的菌群分析表明(圖4)，Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Acidobacteria_Gp1、Acidobacteria_Gp3、Actinobacteria、Gammaproteobacteria為根系土壤的主要菌群。值得注意的是，在處理B中，Acidobacteria_Gp1和Acidobacteria_Gp3的相對含量明顯低于其他各個處理。已有研究表明，土壤酸桿菌的相對豐度與土壤pH值呈顯著的負相關(guān)[33-34]。而依照表2所示，處理B的pH值最高，因此其酸桿菌屬的相對含量低于其他處理組。酸桿菌在土壤生態(tài)系統(tǒng)中可能起著降解植物殘體多聚物、參與鐵循環(huán)、光合作用以及單碳化合物代謝等重要作用[35]。

3 結(jié)論

3.1增施單一成分的海藻寡糖能增加水稻葉片的葉綠素相對含量，促進甬優(yōu)1540增產(chǎn)。增施膠質(zhì)芽孢桿菌雖不會增加葉綠素相對含量，但也能促進該水稻增產(chǎn)。兩者混合增產(chǎn)效果更為顯著，說明海藻寡糖與膠質(zhì)芽孢桿菌之間存在混合增效作用。

3.2施用單一成分海藻寡糖的處理，其水稻根系土壤的pH值最高，且根系微生物的酸桿菌屬明顯低于其他處理組，該發(fā)現(xiàn)驗證了“土壤酸桿菌的相對豐度與土壤pH值呈顯著的負相關(guān)”的論斷。

3.3本試驗的海藻寡糖由微生物法制備，不影響其使用作物的有機認證。并且海藻寡糖生物肥可與殺蟲劑混施，節(jié)省時間和降低人工成本。可以進一步優(yōu)化產(chǎn)品配方，為更大面積水稻實現(xiàn)提質(zhì)增收提供可靠的技術(shù)支持。