蔡 良，歐陽冬青，施華蓉，吉小寶

(江西百神藥業(yè)股份有限公司/江西省中藥配方顆粒重點實驗室， 江西 宜春 336000)

我國是食用菌的生產(chǎn)、消費及出口大國。隨著食用菌行業(yè)的快速發(fā)展，土地和林木資源的短缺，傳統(tǒng)的棉籽殼、玉米粉等原料價格不斷攀升，使得菇農(nóng)的生產(chǎn)成本提高，利潤下降，生產(chǎn)積極性受挫。同時棉籽殼等原料還存在農(nóng)藥殘留率高導(dǎo)致我國食用菌國際競爭力疲軟。因此，開發(fā)新的廉價綠色有機原料對于促進食用菌行業(yè)發(fā)展意義重大[1]。中藥渣是一種具有經(jīng)濟價值的資源，目前已有較多研究表明中藥渣可用于平菇、靈芝、杏鮑菇等食用菌栽培，不僅可以實現(xiàn)資源再利用，解決環(huán)境污染問題，還可以降低菇農(nóng)的生產(chǎn)成本[1-2]。中藥配方顆粒藥渣為單味飲片水提后廢棄的藥渣，與一般中藥渣對比，藥材來源固定，組分簡單，不同品種藥渣經(jīng)脫水干燥后可以隨機搭配組合進行配料，且藥渣沒有醇提、醇沉等生產(chǎn)工序，相對而言有更多的有效成分殘留在藥渣中，其營養(yǎng)更豐富。目前各類中藥配方顆粒生產(chǎn)企業(yè)達60余家，產(chǎn)業(yè)規(guī)模已達近200億元，產(chǎn)生的藥渣量大，如江陰天江藥業(yè)有限公司每年因生產(chǎn)配方顆粒產(chǎn)生藥渣約達7 500 t，除約1 200 t制備成有機肥外，其余均需要環(huán)保部門焚燒處理[3]。因此中藥配方顆粒藥渣是一類食用菌潛在的廉價綠色有機原料。靈芝是我國著名的藥食兩用真菌，具有較高的藥用及保健價值[4]。靈芝的主要活性物質(zhì)有靈芝多糖和靈芝三萜，具有廣泛的藥理活性[5]。為探究中藥配方顆粒藥渣栽培靈芝的效果，采用江西百神藥業(yè)股份有限公司6種藥食同源中藥配方顆粒藥渣進行靈芝代料栽培，對各種藥渣栽培的靈芝生長情況、產(chǎn)品性狀及質(zhì)量(以靈芝多糖與三萜類物質(zhì)為指標)進行分析研究，考察中藥配方顆粒藥渣作為靈芝栽培原料的可行性。同時，挑選3株子實體采用組織分離法制備菌種，考察操作的可行性及重現(xiàn)性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

G-I赤芝菌種(自制)。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1復(fù)蘇馴化培養(yǎng)基 黃豆粉1.5%、山藥0.2%、玉米粉2%、麩皮0.3%、磷酸二氫鉀0.1%、葡萄糖2%、硫酸鎂0.05%、維生素B110 mg·L-1、酵母粉0.3%、瓊脂2% 。將硫酸鎂、磷酸氫二鉀、葡萄糖、維生素B1、酵母粉5種物料用水溶解，備用。然后將黃豆粉、玉米粉、麩皮和切碎的山藥加水混合均勻后，加熱、攪拌，煮沸30 min，再經(jīng)8層紗布過濾。將上述兩種溶液合并混勻，定容至配制量，分裝于三角瓶中。

1.2.2固體培養(yǎng)基 配方1(CK)：棉籽殼89%、麩皮10%、石膏粉1%；配方2[6]：棉籽殼63%、黃芪藥渣20%、玉米粉10%、麩皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%；配方3：棉籽殼63%、川芎藥渣20%、玉米粉10%、麩皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%；配方4：棉籽殼63%、白術(shù)藥渣20%、玉米粉10%、麩皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%；配方5：棉籽殼63%、人參藥渣20%、玉米粉10%、麩皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%；配方6：棉籽殼63%、黨參藥渣20%、玉米粉10%、麩皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%；配方7：棉籽殼63%、酒蓯蓉藥渣20%、玉米粉10%、麩皮5%、石膏粉1%、蔗糖1%。

其中配方1為對照(CK，不加中藥渣)。每個配方制備菌包4包，每包干重700 g，配料時按照料水比1∶1.5，不調(diào)節(jié)pH，拌好后，常溫悶堆2 h后再攪拌1次，裝入聚丙烯袋(規(guī)格：17 cm×35 cm×0.05 mm)，并將接種棒塞進基質(zhì)中壓實，套好出菇環(huán)，121℃滅菌1.5 h。

1.2.3組織分離培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、山藥2%、葡萄糖2%、瓊脂2%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.1%、維生素B110 mg·L-1，將葡萄糖、瓊脂、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素B1加水溶解，備用。然后將馬鈴薯和山藥加水混合均勻后，加熱、攪拌，煮沸30 min，再經(jīng)8層紗布過濾。將上述兩種溶液合并混勻，定容至配制量，分裝于三角瓶中。

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1主要試劑 葡萄糖、KH2PO4、MgSO4(西隴化工試劑有限公司)；棉籽殼、石膏粉、蔗糖、玉米粉、黃豆粉、麩皮、山藥(市購)；酵母粉(英國OXOID公司)；黃芪、川芎、黨參、人參、白術(shù)、酒蓯蓉等藥渣(中藥配方顆粒藥渣經(jīng)干燥處理后獲得)；無水葡萄糖與齊墩果酸對照品(中國食品藥品檢定研究院)，除硫酸優(yōu)質(zhì)純外其余檢測試劑均為西隴化工試劑有限公司分析純試劑。

1.3.2主要儀器 Neofuge 15R 高速冷凍離心機(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；UV-2600紫外可見分光光度計[島津儀器(蘇州)有限公司]；CJ超凈工作臺(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)；LRH-250生化培養(yǎng)箱(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司)；XG1.D脈動真空滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；奧林巴斯CX23顯微鏡(上海普赫光電科技有限公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1菌種制備 將斜面菌種轉(zhuǎn)接至復(fù)蘇馴化培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，待菌絲接近長滿平皿時，收種備用。

采用配方1(CK，不加中藥渣)制備菌包，將平皿菌種用接種刀切成小塊(約0.5 cm2)接種至菌包，為保證菌絲更快的長滿，取出接種棒后在菌包的上中下均接菌種3小塊。接種后放置在自制的大棚蓋好遮陽網(wǎng)避光培養(yǎng)，控制溫度在26～30℃，每天通風2次，每次1 h。菌包培養(yǎng)時間約30 d，待其長滿菌袋后方可用于子實體栽培接種用。

1.4.2靈芝子實體栽培 (1)不同培養(yǎng)基對菌絲體及子實體生長影響。按照1.2.2培養(yǎng)基制備菌包，取出接種棒后，手工接種菌種后轉(zhuǎn)移至大棚培養(yǎng)，經(jīng)暗培養(yǎng)菌包長滿菌絲后，除去遮陽網(wǎng)進行光照培養(yǎng)，菌絲培養(yǎng)過程通過噴淋自來水及通風控制溫濕度，控制溫度26～30℃，濕度60%～70%；光照培養(yǎng)過程控制溫度26～30℃，濕度85%～95%。記錄靈芝菌絲體及子實體各個生長情況，對其生長形態(tài)進行拍照。(2)不同培養(yǎng)基子實體經(jīng)濟形狀比較。按照1.2.2培養(yǎng)基制備菌包，參照1.4.2(1)方法進行接種培養(yǎng)，對第1茬靈芝子實體的生長周期、直徑、厚度、重量進行記錄。其中生長周期以接種后至菌蓋黃白色生長圈停止生長后計，子實體直徑與厚度采用游標卡尺測定，子實體重量采用電子天平稱重，子實體直徑、厚度、重量均為各配方子實體的平均重量。(3)子實體多糖及三萜與甾醇測定。收集生長較好的子實體，按照1.5分析方法進行檢測，對比不同栽培料培養(yǎng)的子實體多糖及三萜與甾醇的差異。(4)靈芝菌種制備。挑選子實體個大，開傘至4～6分的幼嫩子實體，取菌蓋邊緣的白色生長圈，將菌蓋邊緣白色生長圈切成約0.5 cm2大小，用300 mL左右無菌水洗凈后，轉(zhuǎn)接至平皿，分離1～3次即得純種菌株。觀察菌絲性狀、生長速度、并進行顯微鑒別。

1.5 測定方法

靈芝多糖的測定，三萜及甾醇測定參照2015版《中國藥典》靈芝藥材檢測方法檢測[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對靈芝菌絲及子實體生長情況的影響

從試驗結(jié)果(表1)可知，各配方在菌絲生長及子實體生長情況差異明顯。配方2、3、5發(fā)菌時間較配方1(CK，不加中藥渣)快，其他配方發(fā)菌速度則相對較慢。菌絲外觀及長勢方面較好的是配方1～3(表1)?？疾觳煌囵B(yǎng)基對靈芝子實體生長情況，發(fā)現(xiàn)配方3～4菌絲培養(yǎng)及原基分化時間最長，而配方5～6菌絲生長及原基分化時間則較短(表2)。培養(yǎng)過程菌絲生長及子實體生長差異可能與培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分及原料結(jié)構(gòu)的堅硬程度有關(guān)[8-9]。

表1 不同培養(yǎng)基栽培靈芝菌絲生長情況

表2 不同培養(yǎng)基子實體生長各階段所需時間

2.2 不同培養(yǎng)基對靈芝子實體形狀及產(chǎn)量的影響

7個配方培養(yǎng)基均能出菇，且靈芝子實體均能正常生長，但外觀形態(tài)及色澤有明顯區(qū)別。其中形態(tài)及色澤較好的是配方1～4，靈芝形態(tài)呈腎形、半圓形，表面為黃褐色至深黑色。配方6、8色澤較好，子實體表面有明顯的漆狀光澤(圖1)。

從表3可以看出，配方2、5的生長周期較配方1(CK，不添加中藥渣)短，其他配方培養(yǎng)周期相近。配方3(添加川芎藥渣)子實體產(chǎn)量較其他配方高，每包子實體產(chǎn)量達到28.77 g以上。說明質(zhì)硬川芎、白術(shù)藥渣栽培靈芝雖然生長時間長，但其栽培的子實體形態(tài)較好，且芝蓋大而厚實，產(chǎn)量相對較高，而人參、黃芪等相對質(zhì)軟的藥渣雖然生長周期較短，但子實體相對小而薄，產(chǎn)量相對較低。

2.3 靈芝子實體多糖與三萜及甾醇含量對比

挑選配方1～5栽培的子實體進行含量檢測，檢測結(jié)果(表4)表明栽培的靈芝子實體多糖與三萜及甾醇含量均達到《中國藥典》中規(guī)定的含量(多糖不得少于0.90%，三萜及甾醇不得少于0.50%)要求，不同培養(yǎng)基栽培的靈芝子實體含量差異較大，其中配方3(添加川芎藥渣)栽培靈芝子實體含量最高，其多糖含量為2.14%、三萜及甾醇含量為1.03%，分別為配方1(CK，不添加中藥渣)的1.35、1.49倍。且添加中藥渣栽培料栽培的靈芝子實體三萜及甾醇含量普遍較單純使用棉籽殼對照高，說明栽培料添加部分中藥渣進行靈芝栽培有利于靈芝子實體三萜及甾醇含量的提高。

表3 不同培養(yǎng)基栽培靈芝子實體經(jīng)濟形狀比較

表4 不同培養(yǎng)基栽培靈芝子實體多糖與三萜及甾醇含量

2.4 靈芝子實體組織分離方法

取配方2、5、6栽培開傘至4～6分的幼嫩子實體，取子實體菌蓋邊緣的白色生長圈，將菌蓋邊緣白色生長圈切成約0.5 cm2大小菌塊3～4塊，用300 mL左右無菌水洗凈后，轉(zhuǎn)接至平皿，待平皿中菌絲長至1 cm左右，切成3～4小塊轉(zhuǎn)接至平皿，如此反復(fù)分離1～3次直至得到純種菌株。轉(zhuǎn)移至平皿的子實體菌絲生長較快，培養(yǎng)3～4 d即可長滿平皿，轉(zhuǎn)接至平皿長出菌絲只需長至1～2 cm方便切塊即可再次分離。本試驗方法從獲得幼嫩的子實體到分離獲得純種的周期最長約需9 d，如果在操作過程中控制好操作及環(huán)境且無菌水清洗子實體到位，1次分離便得到純種菌株，本試驗配方2子實體分離的靈芝菌種即只分離了1次便得到純種，通過挑選3株不同子實體制備菌種，均能制備得到純種菌種，說明此方法重現(xiàn)性較好。與G-I菌株對比，3株子實體組織分離得到菌種菌絲潔白，致密(圖2)，長滿平皿時間縮短約1 d，經(jīng)顯微鏡鑒別，能夠觀察到明顯的鎖狀聯(lián)合及芽頭結(jié)構(gòu)(圖3)。

3 結(jié)論與討論

通過對不同培養(yǎng)基進行靈芝子實體代料栽培研究，綜合評比了靈芝菌絲生長、子實體經(jīng)濟形狀及對靈芝多糖及三萜類物質(zhì)含量測定，結(jié)果表明添加川芎藥渣培養(yǎng)基(配方3)、白術(shù)藥渣培養(yǎng)基(配方4)與配方1(CK，不添加中藥渣)相當，特別是添加川芎藥渣栽培靈芝子實體產(chǎn)量及活性成分含量均優(yōu)于配方1(CK，不添加中藥渣)，且研究發(fā)現(xiàn)添加中藥渣作為栽培基質(zhì)靈芝三萜類物質(zhì)含量均高于配方1(CK，不添加中藥渣)，而三萜類物質(zhì)作為主要活性物質(zhì)具有抗過敏和抗發(fā)炎的作用，因此采用中藥配方顆粒藥渣替代部分棉籽殼作為靈芝栽培原料，在提高靈芝品質(zhì)方面有很大的意義。同時本試驗建立了一種子實體組織分離方法制備靈芝菌種方法，該方法制備操作簡單，周期短，重現(xiàn)性好，只需配備簡單的滅菌裝置、超凈臺即可實現(xiàn)靈芝菌種的保種，適合專業(yè)技能不強的菇農(nóng)操作。

隨著中醫(yī)藥事業(yè)的快速發(fā)展，對中藥生產(chǎn)過程產(chǎn)生的大量藥渣進行綜合利用，更好地發(fā)揮中藥的資源價值，提升利用效率，不僅可以節(jié)約資源，延伸經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)鏈，還可以減輕生態(tài)環(huán)境污染和社會壓力[3]。本試驗中藥配方顆粒藥渣作為栽培基質(zhì)，由于在藥材源頭就進行農(nóng)藥殘留與重金屬把關(guān)，能夠避免農(nóng)藥殘留及重金屬超標問題。同時配方顆粒采用單味藥材水提其得到的藥渣與其他復(fù)方制劑藥渣對比成分相對固定，醇溶性、脂溶性成分殘留較多，這些成分中有各種藥理作用的有效成分，如川芎中的川芎嗪以及阿魏酸在心腦血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等具有較好的藥理作用[10]，黃芪含有皂苷類物質(zhì)、黃酮類、氨基酸類、多糖類等有效成分，其中黃芪多糖具有增強機體抗疲勞及應(yīng)激力、清除自由基抗衰老[11]、調(diào)節(jié)血糖等作用[12]，已有文獻報道靈芝生長過程中能夠富集多種礦物元素[13-14]，還有研究人員提出采用藥渣栽培后靈芝具有藥渣中的有效成分[1]。下一步將重點研究藥渣中有效成分在靈芝子實體內(nèi)是否也存在類似富集現(xiàn)象及藥渣栽培后靈芝的是否也具有相應(yīng)的藥理作用。