劉曉紅，黃欽耿，梁 玲，趙 穎，唐謝芳，蔣順進(jìn)，黃煒乾，吳松剛

(1.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院， 遼寧 丹東 118003；2.廣東容大生物股份有限公司， 廣東 清遠(yuǎn) 511500；3.福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心， 福建 福州 350107)

飼用抗生素在動物促生長、提高飼料報酬等方面具有顯著的效果[1]。但隨著抗生素作為動物促生長劑在飼料中的廣泛使用，其弊端正日益凸現(xiàn)，如導(dǎo)致動物胃腸道菌群失調(diào)、免疫刺激、廣泛耐藥性和藥物殘留等，也引發(fā)了一系列公共安全、環(huán)境保護(hù)和食品安全方面的問題[2-3]。2020年，中國正式進(jìn)入“無抗養(yǎng)殖”新時代，飼料端全面禁抗，飼用抗生素替代品研究受到廣泛關(guān)注，如何開發(fā)尋找無毒、高效、不產(chǎn)生耐藥性的綠色安全飼料添加劑已成為動物營養(yǎng)領(lǐng)域熱點之一。

蛹蟲草在中國、韓國和日本已長期用作營養(yǎng)和保健食品，具有多種重要的生理活性[4]。蛹蟲草作為一種廣為人知的藥食用真菌之一，在分類學(xué)上隸屬于真菌界Fungi、子囊菌門Ascomycota、糞殼菌綱Sordariomycetes、肉座菌亞綱Hypocreomycetidae、肉座菌目Hypocreales、蟲草科Cordycipitaceae、蟲草屬Cordyceps[5]。目前，蛹蟲草已經(jīng)進(jìn)入我國新資源食品和新食品原料目錄，是國家認(rèn)定的健康食品來源，其無性型菌株-蛹草擬青霉作為寄生于鱗翅目昆蟲蛹體的昆蟲病原菌，正是其廣泛的藥理活性成分的主要來源[6]。蟲草素作為蛹蟲草的標(biāo)志性活性成分，國內(nèi)外研究都顯示其具有非常好的抗病毒、炎癥修復(fù)以及免疫調(diào)節(jié)的功能[7]。此外，蛹草擬青霉代謝產(chǎn)生的其他活性物質(zhì)，如蟲草多糖、蟲草酸、腺苷、甾醇類、超氧化物歧化酶(SOD)等，也展現(xiàn)非常廣泛的生理與藥理功能。Koh等[8]發(fā)現(xiàn)蟲草菌絲體的熱水浸提物用作抗生素生長促進(jìn)劑替代品，能夠提高肉雞生長性能和免疫機(jī)能，改善動物腸道微生物組成；Han等[9]研究結(jié)果顯示，添加1 g·kg-1蛹草菌絲體及其代謝產(chǎn)物(蟲草素含量約為5.09 mg·g-1)顯著增加肉仔雞日增重，對肉仔雞的生長性能具有積極影響；Cheng等[10]在斷奶仔豬中添加1 000 μg·kg-1的蟲草素含量約為5.0 mg·g-1的蛹草擬青霉菌絲體及其代謝產(chǎn)物，可促進(jìn)仔豬的生長性能和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力，有助于降低仔豬斷奶生理和免疫應(yīng)激。不僅僅菌絲體，Waewagee等[11]采用蛹蟲草培育的基座(蟲草素含量約為3.63 mg·kg-1)，在育肥豬日糧中添加2.0 g·kg-1的蛹蟲草培養(yǎng)基座可顯著提高豬的生長性能，增強(qiáng)其免疫球蛋白分泌和抗氧化能力，同時降低生長豬的白細(xì)胞百分比，膽固醇和丙二醛濃度，而不損害肝功能。

因此，蛹草擬青霉及其代謝產(chǎn)物作為功能性飼料添加劑，被證明是動物生產(chǎn)中有效的營養(yǎng)調(diào)節(jié)素，能夠有效增強(qiáng)細(xì)胞活力，幫助機(jī)體建立免疫防線，從而提高免疫力，不僅可以改善動物健康，還可以減少藥物使用，改善腸道生態(tài)。本研究正是基于蛹蟲草豐富的生理和藥理功能，以特異型高產(chǎn)蟲草素蛹草擬青霉菌株FY1421(paecilomycesmilitarisFY1421)為基礎(chǔ)，通過發(fā)酵獲得富含蟲草活性成分的蛹草擬青霉培養(yǎng)物，評估其作為飼料添加劑對南美白對蝦生長性能及免疫能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蛹草擬青霉FY1421(paecilomycesmilitarisFY1421)菌種由遼東學(xué)院蟲草研究所提供，保藏編號為CCTCC NO：M2016220。南美白對蝦由福清宏峰泰水產(chǎn)養(yǎng)殖公司提供。南美白對蝦0、1號飼料由福建大昌生物科技實業(yè)有限公司提供。其中0號飼料為對蝦幼蝦飼料：秘魯魚粉37%、白魚粉18%、烏賊膏4%、大豆磷脂6%、發(fā)酵豆粕14%、蝦肉粉7%、海藻粉2.5%、次粉6.5%、小麥面筋粉5.2%、食鹽0.4%、預(yù)混料4%；1號飼料為對蝦中成蝦飼料：智利魚粉30%、國產(chǎn)魚粉8%、烏賊膏4%、發(fā)酵豆粕18%、花生粕6%、蝦殼粉10%、大豆磷脂5%、小麥粉10.5%、魚油1.5%、磷酸二氫鈣2.6%、乳酸鈣0.4%、預(yù)混料4%。

1.2 蛹草擬青霉FY1421培養(yǎng)物的制備

將活化后的蛹草擬青霉菌塊接種到裝有150 mL馬鈴薯葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基(配方：馬鈴薯的浸汁200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1)的20瓶三角瓶(250 mL)中，然后將其放置搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為230 r·min-1、28℃恒溫培養(yǎng)5 d，制成種子液3 L。將3 L蛹草擬青霉種子液接種到50 L發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝30 L馬鈴薯葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(配方：馬鈴薯的浸汁200 g·L-1、葡萄糖30 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1)，28℃，通氣量10～15 L·min-1，壓力0.1 MPa下發(fā)酵培養(yǎng)3 d。發(fā)酵結(jié)束后，加入0.25%(w/v)的輕質(zhì)碳酸鈣，進(jìn)風(fēng)135℃，出風(fēng)85℃進(jìn)行低溫噴霧干燥，得到蛹草擬青霉FY1421培養(yǎng)物。參考(NY/T 2116-2012《蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液相色譜法》)方法檢測其蟲草素含量，獲得的FY1421培養(yǎng)物蟲草素含量為5.2 g·kg-1。

1.3 試驗分組以及飼養(yǎng)管理

首先進(jìn)行對蝦幼苗培育，將幼蝦苗投放于5 m×3 m×1.5 m的水池中培養(yǎng)，水的鹽度為6‰，24 h充氣，水溫在24～29℃，初始只投放0號飼料，投餌量為蝦苗總重量的10%，分上下午投喂，每日投餌量增加10%。投喂20 d后，開始選擇健康、大小均勻的南美白對蝦，進(jìn)行1號飼料喂養(yǎng)試驗。喂養(yǎng)試驗采用循環(huán)水機(jī)(福建省寧德市金鼎海洋水產(chǎn)研究所，GBL-800YZ-200型)，設(shè)試驗組與對照組，每組3個平行，每組各投放100尾，飼養(yǎng)于120 cm×80 cm×60 cm的圓形水族箱。試驗組以0.05%添加蛹草擬青霉FY1421培養(yǎng)物，添加劑加水與飼料充分混勻，對照組只投喂基礎(chǔ)飼料。投餌量為該水箱內(nèi)蝦苗總重量的10%，分上下午投喂，每日投餌量增加10%。每日中午利用循環(huán)水泵吸出池底的殘餌和糞便，每周對水箱內(nèi)添加新鮮的0.6%海水，試驗期間水鹽度保持于0.4%～0.7%，水溫為23～30℃，24 h充氣，飼養(yǎng)30 d后，測定相關(guān)指標(biāo)。

1.4 南美白對蝦生長指標(biāo)的測定

試驗開始測量每組蝦的總重量，結(jié)束時分別測量每尾蝦的體重，同樣測量每組蝦的初始長度，結(jié)束時分別測量每尾蝦的長度，去頭剝殼取肌肉。按以下公式分別計算增重率、增長率、成活率、出肉率和飼料系數(shù)：

增重率=(末體重-初始體重)/初始體重×100%；

增長率=(末長度-初始長度)/初始長度×100%；

成活率=末尾數(shù)/初始尾數(shù)×100%；

出肉率=肌肉重/末體重×100%；

餌料系數(shù)=(末體重-初體重)/總喂食的飼料量×100%。

1.5 南美白對蝦免疫指標(biāo)的測定

首先用10 mL的注射器從對蝦背部的圍心腔中吸取血液，注入到1.5 mL離心管中，冰浴，4℃，12 000 r·min-1，10 min，取上清即為藍(lán)色的對蝦血清，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩７謩e測定血清中溶菌酶、酚氧化酶。

溶菌酶活力的測定：用0.1 mol·L-1，pH=6.4的磷酸鉀鹽緩沖液溶解溶壁微球菌(Micrococcuslysoleiklicus)的凍干菌粉，將其配制成OD570nm約為0.3的懸液。取0.6 mL事先冰浴好的該懸液，加入10 L血清混勻，馬上測量其吸光值，此時為A0，然后將混勻液放入37℃水浴30 min，取出后立即置于冰浴中10 min終止反應(yīng)，此時測量其吸光值為A末，溶菌酶活力UL按以下公式計算：UL=(A0-A末)/A末。

酚氧化酶活力的測定：以左旋多巴為底物，將1 mL的0.1 mol·L-1、pH=6.0的磷酸鉀鹽緩沖液與30 L的0.01 mol·L-1左旋多巴以及30 L的血清在室溫下混勻后，用酶標(biāo)儀，每間隔2 min讀取在490 nm的吸光值，讀取1 h，以試驗條件下每分鐘增加0.001定義為一個酶活力單位。

肝胰腺中的堿性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活力測定采用南京建成生物工程研究所測定試劑盒。

1.6 南美白對蝦抗氧化指標(biāo)的測定

肝胰腺中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)的測定采用南京建成生物工程研究所測定試劑盒。采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定肌肉中的丙二醛(MDA)，具體參照南京建成生物工程研究所測定試劑盒。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹草擬青霉培養(yǎng)物對南美白對蝦生長指標(biāo)的影響

南美白對蝦的增重率、增長率、出肉率、成活率、餌料系數(shù)見表1。經(jīng)單因素方差分析(SPSS 18.0)，結(jié)果顯示，添加0.05%蟲草素含量5.1 g·kg-1的蛹草擬青霉FY1421培養(yǎng)物作為飼料添加劑能夠有效改善南美白對蝦的生長性能。與對照組相比，試驗組的增重率提高34.0%，差異顯著(P<0.05)，增長率和出肉率也有改善的趨勢(P>0.05)。值得關(guān)注的是，添加0.05%的蛹蟲草擬青霉還能夠顯著提高個體成活率(成活率提高24.8%，P<0.05)，減少飼料投入(餌料系數(shù)降低9.8%)。

表1 南美白對蝦的生長指標(biāo)

2.2 蛹草擬青霉培養(yǎng)物對南美白對蝦免疫指標(biāo)的影響

蛹草擬青霉培養(yǎng)物作為添加劑對南美白對蝦血清中的溶菌酶、酚氧化酶活力，肝胰腺中的堿性、酸性磷酸酶活力的影響見表2。

溶菌酶、酚氧化酶、堿性及酸性磷酸酶都是甲殼動物重要的非特異性免疫酶類，也是其天然免疫的重要組成部分，在病原的防御與清除中發(fā)揮著重要作用，其活力水平一定程度上也反映了機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。由表2可見，試驗組對蝦血清中的酚氧化酶、肝胰腺中堿性磷酸酶活力均顯著高于對照組(P<0.05)，分別提高34.0%和19.8%。溶菌酶活力和酸性磷酸酶活力也較對照組有改善，但差異不顯著(P>0.05)。體現(xiàn)了蛹草擬青霉培養(yǎng)物的添加能夠有效改善和促進(jìn)磷酸酶活性，加速血液中磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，提高血液的解毒能力，同時能夠基于改善酚氧化酶和溶菌酶的活力增強(qiáng)對蝦的防疫與識別體系，提高免疫力。

表2 南美白對蝦的免疫指標(biāo)

2.3 蛹草擬青霉培養(yǎng)物對南美白對蝦抗氧化指標(biāo)的影響

肝胰腺中的超氧化物歧化酶以及過氧化物酶、過氧化氫酶的測定結(jié)果見表3。經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示，添加蛹草擬青霉培養(yǎng)物的試驗組超氧化物歧化酶和過氧化物酶活力顯著高于對照組(P<0.05)，其中超氧化物歧化酶的活力極顯著高于對照組(P<0.01)，體現(xiàn)了較好的肝胰腺細(xì)胞的抗氧化活性；試驗組過氧化氫酶活力雖較對照組有改善，但差異并不顯著。另外，丙二醛作為組織細(xì)胞脂質(zhì)自由基的降解產(chǎn)物，其含量間接反映組織細(xì)胞的過氧化程度，蛹草擬青霉培養(yǎng)物的添加明顯降低丙二醛含量(P<0.05)，展現(xiàn)了較好抗氧化機(jī)能，提高了對蝦的生長質(zhì)量。

表3 南美白對蝦的抗氧化能力

3 結(jié)論與討論

自抗生素被發(fā)現(xiàn)有利于畜禽的生長發(fā)育，其為實現(xiàn)畜牧業(yè)快速發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)[12]。養(yǎng)殖業(yè)一直采用抗生素作為生長促進(jìn)劑來預(yù)防腸道疾病，但長期高劑量、多品種的添加造成耐藥菌株產(chǎn)生、藥品殘留、生態(tài)污染等問題[13]，也引發(fā)了系列的社會問題。2020年7月1日，中國正式禁止各類促生長抗生素在飼料中的添加，“無抗飼料”正式落地。2020年恰逢飼料禁抗元年，抗生素替代品的研發(fā)及應(yīng)用案列也層出不窮，效果不一。鑒于飼用促生長抗生素的主要作用對象為微生物，作用場所也主要在動物腸道，所以飼用抗生素替代品的研發(fā)策略方面，動物腸道健康最受關(guān)注，通過維護(hù)腸道微生態(tài)平衡和提高腸道免疫來促進(jìn)動物生長和保障動物腸道健康已經(jīng)成為“后抗生素時代”健康養(yǎng)殖的行業(yè)共識。而通過活性營養(yǎng)調(diào)節(jié)素的形式增強(qiáng)動物免疫力，維護(hù)腸道免疫系統(tǒng)正常，允許動物自然防御疾病，使動物機(jī)體從根本上對病原形成強(qiáng)有力的抵抗，這無疑是健康養(yǎng)殖的核心。

蛹草擬青霉作為蛹蟲草的無性型，其菌體及代謝產(chǎn)物具備蛹蟲草子實體一致的蟲草活性成分，甚至某些成分含量能夠通過發(fā)酵控制而高效積累。研究表明，蟲草活性成分具有顯著地提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力，激活非特異性免疫，抑菌、抗病毒、抗氧化等功能[14-16]，含有蟲草活性物質(zhì)的飼料添加劑應(yīng)用于動物飼料中，能夠提高飼料利用效率和生產(chǎn)性能，增強(qiáng)動物免疫功能和改善動物產(chǎn)品品質(zhì)[17]。本研究以南美白對蝦為研究對象，通過制備富含蟲草素的蛹草擬青霉FY1421培養(yǎng)物，并以此作為飼料添加劑考察其對對蝦生長的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，添加0.05%蛹草擬青霉培養(yǎng)物能夠有效改善南美白對蝦的生長性能，增重較多(P<0.05)，而且個體成活率較對照組顯著改善(P<0.05)，餌料系數(shù)也降低了9.8%。其生長性能的改善不僅體現(xiàn)在個體數(shù)據(jù)上，在血液免疫指標(biāo)方面，包括溶菌酶、酚氧化酶、堿性磷酸酶都有顯著增高(P<0.05)，酸性磷酸酶也有改善(P>0.05)，說明蛹草擬青霉培養(yǎng)物能激活南美白對蝦的免疫系統(tǒng)，改善對蝦的健康狀況。另外，抗氧化指標(biāo)，包括肝胰腺中的超氧化物歧化酶和過氧化物酶均顯著高于對照組(P<0.05)，其中超氧化物歧化酶的活力較對照達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，過氧化氫酶活性雖差異不顯著，但其活性也得到明顯改善。在過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛的含量方面，試驗組也較對照組顯著降低，間接印證了蛹草擬青霉培養(yǎng)物突出的抗氧化活性。整體而言，蛹草擬青霉培養(yǎng)物可用于改善南美白對蝦的生長性能和健康狀況，也展示了將具有特殊蟲草活性營養(yǎng)調(diào)節(jié)素的蛹草擬青霉代謝產(chǎn)物作為對蝦飼料添加劑，可極大提高對蝦的生長指標(biāo)，增強(qiáng)對蝦免疫和抗氧化能力，提高對蝦生存和抗病能力，為禁抗后的健康養(yǎng)殖提供了新選擇，也為蟲草屬真菌資源的利用提供新方向。