邢 燕，錢玉春，張文艷，胡忠旺，孫 永

沙門菌是一類重要的人獸共患病原體，血清型多達2 000多種，其中絕大多數血清型既可存在于動物、環(huán)境中，也可傳播至人。沙門菌感染會引起腹瀉、發(fā)熱等癥狀[1]，屬于自限性疾病，但對于細菌入血的少數重癥患者，必須使用抗生素治療。

喹諾酮類抗生素是成人治療沙門菌感染的一線藥物之一。沙門菌對喹諾酮類藥物產生耐藥對于治療非常不利。目前沙門菌對一代藥物萘啶酸已表現出明顯耐藥，對第三代藥物環(huán)丙沙星的敏感性仍較高，耐藥率大約在2%～3%[2-3]。

對喹諾酮類藥物耐藥機制的研究表明，喹諾酮耐藥決定區(qū)的基因突變，即位于細菌染色體上的gyrA、gyrB基因的突變，是導致喹諾酮耐藥的主要原因[4]。隨著研究的深入，由質粒介導的耐藥相關基因，如qnr、aac(6′)-Ib-cr、qepA等都被發(fā)現與喹諾酮耐藥有關[5-7]。研究發(fā)現質粒介導的耐藥通常引起喹諾酮類藥物的MIC濃度降低或藥物敏感性下降，不能達到臨床耐藥水平[8-10]。但Toyotakasato[11]等人于2011年報道了一例臨床分離的大腸桿菌HUE1，它不含染色體編碼基因的耐藥突變，僅有質粒上攜帶的基因qnrS1和oqxAB并表現出環(huán)丙沙星耐藥。

本實驗室在對臨床分離沙門菌菌株的抗生素耐藥篩查中，發(fā)現一株多耐藥菌株SM846，它對喹諾酮類藥物萘啶酸和環(huán)丙沙星都耐藥，在PCR研究耐藥機制時，沒有檢測到gyrA和gyrB基因的突變。隨后對它進行了全基因組測序及序列比較分析，來研究它的耐藥機制。

1 材料與方法

1.1菌株來源及分離鑒定 沙門菌SM846于2014年從1名11個月的嬰兒腹瀉糞便標本中分離。沙門菌從沙門顯色培養(yǎng)基(購于上?？岂R嘉)中分離出單個菌落，純菌落使用梅里埃的微生物鑒定系統(tǒng)(購于梅里埃VITEK2)鑒定，經血清學(購于寧波天潤)鑒定為湯普遜沙門菌(S.thompson)。

1.2藥敏試驗 使用thermo公司的SensititreAIM儀器和基于微量肉湯法定制的藥敏板(購于上海星佰)，測定沙門菌SM846對14種抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。試驗菌株培養(yǎng)至對數期，用無菌生理水調整菌懸液濃度至0.5McF，取50 μL菌懸液加入到11 mL CAMHT肉湯中，將稀釋后的菌液(細菌數1×105～1×106)接種在藥敏板上。培養(yǎng)24 h，測定結果。使用大腸桿菌ATCC25922為試驗的質控菌株。14種抗生素分別為：氨芐西林(AMP)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、四環(huán)素(TET)、氯霉素(CHL)、頭孢唑林(CFZ)、環(huán)丙沙星(CIP)、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑(SXT)、頭孢他啶(CAZ)、亞胺培南(IPM)、萘啶酸(NAL)、頭孢西丁(CFX)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(GEN)、阿奇霉素(AZM)。根據CLSI的判讀標準確定MIC值。

1.3全基因組測序 對于組裝基因組的菌株，提供8～10 μg高質量的基因組DNA，用Covaris g-TUBE隨機打斷成10 kb左右的片段，隨后用DNA Template Prep試劑盒構建SMRTbell文庫。構建好的SMRTbell文庫結合V3測序引物和聚合酶采用自由擴散的方式加入到PacBio Sequel平臺的測序芯片中。測序過程由金唯智公司處理和分析。

1.4測序后數據分析 使用Prodigal軟件(version 3.02)進行染色體編碼基因預測[12]；與Rfam(version 12.0)數據庫進行序列比對獲得非編碼RNA結果[13]。使用在線網站RAST對質粒進行注釋[14]。使用resfinder[15]與CARD[16]進行耐藥基因的預測分析。使用SISTR[17]預測血清型，PlasmidFinder預測質粒類型[18]。使用SnapGene(from GSL Biotech; available at snapgene.com)對質粒的編碼基因進行展示?；蚪M線圖使用CGView1.3.4[19]生成。質粒上耐藥基因圖由ApE軟件制作(available at https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/)。質粒序列使用clustalw進行比對(available at https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，進化樹由軟件mega-X根據NJ法生成[20]。

2 結 果

2.1測序菌株信息 SM846的全基因組包含1條染色體和1條質粒。染色體全長4 754 945 bp，GC含量52.3%，預測包含編碼序列4 425個，含64個rRNA，89個tRNA，其它RNA178個。質粒全長152 940 bp，GC含量53.4%，預測包含編碼序列193個，不含RNA。染色體和質粒基因組已提交到NCBI，序列號分別為：CP028729、CP029249?；赟ISTR數據庫預測的血清型為湯普遜，與血清學鑒定結果一致?；赑lasmidFinder質?；蚪M數據庫預測的質粒類型為IncA/C2。SM846測序原始數據見表1。

表1 SM846測序原始數據統(tǒng)計信息

2.2 藥敏試驗結果與耐藥基因分布

2.2.1藥敏試驗 SM846對IPM、GEN敏感，對其它12種抗生素都高度耐藥，包括喹諾酮藥物萘啶酸和環(huán)丙沙星。雖然SM846對喹諾酮耐藥，PCR檢測gyrA和gyrB基因的耐藥突變，沒有獲得任何突變位點的結果。對SM846進行了基因組測序以研究它的喹諾酮耐藥機制(詳見表2)。

表2 SM846藥敏試驗結果及相關耐藥基因

2.2.2耐藥基因分布 將SM846序列與ResFinder數據庫比對，注釋結果顯示，SM846的染色體不含有任何和已知耐藥有關的基因和突變，它有3個parC蛋白的未知突變，分別是p.T57S、p.T255S、p.V657I。它的質粒p846攜帶13個耐藥相關基因，分別是耐氨基糖苷類的aadA2、APH(6)-1d、APH(3″)-1b；耐氯霉素的floR；耐β-內酰胺類的blaTEM-1、blaCMY-2；耐喹諾酮類的qnrS1和qepA1；耐大環(huán)內酯類mph(A)；耐磺胺類的sul1、sul2；耐四環(huán)素類tet(A)；以及耐甲氧嘧啶的dfrA12(見表1)。由于ResFinder和CARD對耐藥基因的篩選標準有差別，ResFinder比對的是明確并且特異地與耐藥相關的耐藥基因，而CARD數據庫的比對結果中還包括外排泵系統(tǒng)和基因表達調控系統(tǒng)等非特異的基因。CARD數據庫的預測結果，除了包含ResFinder中的耐藥基因，還有30個位于染色體上的基因，分別屬于RND抗生素外排泵、ABC抗生素外排泵、MFS抗生素外排泵、以及上述外排泵基因上下游的正負調控基因。

2.3 耐多藥質粒信息

2.3.1由于SM846的耐藥基因，包括與喹諾酮耐藥相關的基因，都在質粒上，我們對質粒p846進行了進一步的分析。p846共編碼193個基因，去除小于100 bp和沒有明確功能的，還有159個。其中13個基因與耐藥相關。

將p846的序列與NCBI上其它公開數據比對，可以得到很多相似度大于99%的質粒。表3中列出了代表性的13條質粒，分別是4條相似度最高的和9條覆蓋度最高的序列。用ResFinder注釋上述質粒的耐藥基因，獲取它們的耐藥基因的攜帶情況(表3)。

表3 p846與相似質粒比較

上述質粒中，分離時間早的，如分離自2003年和2004年的質粒。耐藥性都相對較弱，2013年及以后分離出的則表現出很強的耐藥性；質粒菌株來自于人的，耐藥性也強，由于中國分離出的質粒都是2010年以后且自人體分離出，因此中國分離的質粒都顯示出了很強的耐藥性。以質粒的序列進行進化分析，可以得到2個進化簇(見圖1)。與p846親緣關系近的質粒有3個，分別是pCVMN1543、pCFSAN00093402和pRH-1238。其中p846和pRH-1238耐藥性極強，pCVMN1543、pCFSAN000934-02耐藥性一般；p846來自于人分離的菌株，其它3個來自于動物分離的菌株；p846來自中國，pRH-1238來自德國，pCVMN1543和pCFSAN000934-02來自美國。

進化分析序列基于以下質粒序列：p846，pSN254b，p2012EL-2176，pSL131，punnamed3，pTB221，pCVM22425，pCMY2 085072，pCFSAN007427 01，pCVM22513，pCVMN1543，pCFSAN000934 02，pRH-1238。

為了更深入研究p846的遺傳情況，將p846與上面的質粒進行序列對比分析。從對比的圈圖，可以看出p846含有2個較為特殊的區(qū)域，P1和P2。pCFSAN007427.01也含有P1區(qū)域，它是一條分離自2009年的美國的沙門菌的質粒(見圖2)。在NCBI搜索P1序列，發(fā)現很多宿主細菌的質粒中都含有這段序列，如沙門菌、志賀菌、肺炎鏈球菌等。與P1序列的廣泛存在不同，P2序列特異性較強，它與NCBI中的序列沒有很好的匹配。QepA1和qnrS1基因位于P2序列中，它們正是質粒中與喹諾酮耐藥相關的2個基因。QnrS1在沙門菌質粒中分布較為普遍[21]，而qepA1未在耐喹諾酮的沙門菌中發(fā)現過。

由內而外分別是GC content、pAR060302、pSN254b、p2012EL-2176、 punnamed3、 pTB221、pCFSAN007427.01、pRH-1238、pCMY2 085072、pSL131、pCFSAN000934_02、 pCVMN1543、pCVM22425、 pCVM22513、 p846。P1和P2是p846中未比對上的序列。

P2序列全長32 048 bp，GC含量57%。共編碼42個基因，其中13個是和基因移動相關的，如解離酶、轉化酶、內含子等。攜帶6個耐藥基因——qnrS1、qepA1、dfrA12、sul1、aadA12和mph(a)，分別編碼對喹諾酮類、氨基糖苷類、甲氧嘧啶類、磺胺類和大環(huán)內酯類抗生素的耐藥(見圖3)。P2主要由I類整合子構成，包括它的5′端的intI整合酶及3′端的sul1和溴乙錠的耐藥基因以及兩者之間的可變區(qū)。研究發(fā)現，I類整合子的可變區(qū)包含的幾乎都是與耐藥相關的基因[22]。在P2的I類整合子序列里，可變區(qū)包含耐藥基因qepA1、dfrA12和aadA2。P2序列的兩端均有IS6和反向重復序列，提示3′端的qnrS1、5′端的mph(a)基因可能與此相關。這些插入或整合到I類整合子的耐藥基因的存在，使細菌獲得在抗生素壓力下的生存優(yōu)勢。

紅色為可移動蛋白；灰色為IR、IS及Tn等可移動元件箭頭方向為基因編碼方向

3 討 論

根據Resfinder的注釋，parC基因含有3個未知突變p.T57S、p.T255S、p.V657I。經過分析，認為它們對于蛋白結構的變化影響不大，與喹諾酮耐藥無關。有以下原因：首先從氨基酸化學性質分析，T和S、V和I都是化學性質相似的氨基酸，不會引起蛋白質局部電荷以及疏水性質的變化；其次，在Uniport網站搜索到蛋白ParC，已經報導的影響功能的氨基酸突變都有標注，可以參考，而它不含以上3個突變；第三是從蛋白質結構上，雖然沙門氏菌的parC結構未被解析，但和它高度同源的大腸桿菌ParC結構已經解析，這些殘基并不位于關鍵的結合界面，不會影響蛋白質二級結構；最后,這幾個突變位點與同期測序的實驗室其它對喹諾酮敏感菌株的突變位點相同(數據未列出)，可以說明這些突變對于喹諾酮耐藥是不起作用的，并且p.T57S位點的突變在文獻中已經有多次報道，證實其對喹諾酮耐藥是無效的[23]。

綜合染色體和質粒序列耐藥基因的注釋結果，可以確定SM846基因組中和喹諾酮耐藥有關基因有acrAB-TolC、sdiA、marR,、marA、qnrS1、qepA1。SdiA位于染色體上，它的作用是無效的[24]。MarR、marA都是編碼acrAB的調控蛋白[25]。QepA1曾在敏感的臨床鼠傷寒沙門菌中檢測出，說明qepA1單獨存在不能介導對喹諾酮耐藥，這與大腸中qepA的研究結果一致[21-23]。SM846的喹諾酮耐藥可能是由acrAB外排泵，QnrS1靶位結合蛋白和qepA1外排泵共同作用來實現。QnrS1或者qepA1或者acrAB單獨存在于沙門菌中，均沒有對喹諾酮藥物產生耐藥性的能力。它們組合在一起的具體作用方式，是否與Sato[11]報道的大腸桿菌HUE1的耐藥機制類似，還需要更多的實驗證實。

對IncA/C2質粒的分析表明，不同來源的質粒，都能在寄生于人和動物的病原體中傳播。當同一型的質粒位于不同地區(qū)時，它們所攜帶的耐藥基因的數量和種類會發(fā)生改變，使宿主獲得不同的耐藥能力，說明同源性強的質?？赏ㄟ^靈活獲取耐藥基因更好的實現本地化生存[26]。Han等[26]分析了4條質粒并與之前發(fā)表的質粒進行比對，發(fā)現相似質粒之間的獨特性是由可移動部分造成的。在SM846中也是如此。p846及相似的質粒，質粒骨架(backbone)區(qū)域在時間跨度十幾年間，相似度達99%，相對保守。IncA/C2型質粒骨架不含qnrS1和qepA1基因，推測抗生素或其它壓力可能促使細菌在可移動元件的幫助下快速獲得相應的耐藥基因，提高細菌的生存能力。

通過質粒信息的比對我們發(fā)現來自于臨床樣本的質粒，它們的宿主細菌種類比動物和環(huán)境來源的樣本要更多樣，也就意味著多耐藥的質粒能通過多種病原菌感染人類。應當注意到，共同的問題包含著不同的細節(jié)，不同地區(qū)的生態(tài)因素和選擇壓力造成了某一地區(qū)獨特的耐藥模式[27-28]。一項根據基因組序列分析多耐藥沙門菌的研究表明，不同地區(qū)的耐藥相關的特征在基因型和表現型上都表現出了地區(qū)差異[27]。因此需要建立地區(qū)性的耐藥監(jiān)測和耐藥控制策略，我們的質粒比對結果也支持這個觀點。在p846相似的質粒中，耐藥相關性最強的質粒來自中國和海地，這2個國家都是經濟不夠發(fā)達，在抗生素使用管理上可能不夠完善，這兩個地區(qū)的細菌耐藥性更強，不適宜直接套用發(fā)達國家對于抗生素管理和控制的策略，因為它們的策略是建立在自己的細菌耐藥監(jiān)測的結果上的。值得一提的是分離自德國的質粒pRH-1238，它攜帶的耐藥基因數量最多，達到20個，所屬的抗生素類型也是最多，可耐9種類型的抗生素。對這條質粒上耐藥基因fosA3的分析表明，它很可能來自中國[29]。我們根據基因組序列所做的進化分析顯示,德國分離的pRH-1238與中國分離的p846在進化上確實屬于一個分支，支持了這個質?？赡芘c中國有關的結論。因此，不同地區(qū)的細菌耐藥監(jiān)測是必要的，各地區(qū)自己的耐藥監(jiān)測結果才是制定其耐藥策略的最合理的依據，也只有根據合理的依據，才能得到有效的控制策略，切實減輕疾病負擔。SM846攜帶qnrS1和qepA1來介導對喹諾酮的耐藥，這個發(fā)現正是我們監(jiān)測的成果之一。

利益沖突：無