楊曉雯，趙鴻雁，樸東日，田國忠，姜 海

布魯氏菌(Brucella)是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，易造成宿主持續(xù)性感染，引起全球性人獸共患流行性疾病—布魯氏菌病。該病主要表現(xiàn)為發(fā)熱、多汗、乏力、關節(jié)疼痛等癥狀，嚴重者喪失勞動能力，影響公共衛(wèi)生安全以及經(jīng)濟發(fā)展[1]?；谏b定和宿主偏好性，國際上將布魯氏菌分為12個種[2-6]。人感染布魯氏菌若診療不及時，容易引起各種并發(fā)癥，如脊柱炎、心內(nèi)膜炎、腦炎等[7]。全球人間布魯氏菌病發(fā)病率年平均超過50萬例，一些流行國家每百萬人口的布魯氏菌發(fā)病率超過100[8]，但據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)調查表明，實際發(fā)病率是報告的10～25倍[9]。2019年我國人間布魯氏菌病發(fā)病數(shù)為45 406例，較2018年略有下降(39 296例)。我國過去流行的主要種型是羊種布魯氏菌1型和3型[10]，近幾年主要分離株為羊種3型[11]。

臨床治療布魯氏菌病常用利福平、鏈霉素等[12]，氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物可以作為替代藥物[13]。1989年，世界衛(wèi)生組織推薦的布魯氏菌病治療方案為強力霉素—利福平聯(lián)合用藥6周，或者強力霉素服用6周，結合鏈霉素聯(lián)合用藥2～3周[14]，目前該方案仍在使用。目前，土耳其[15]、埃及[16]等國家和地區(qū)[17-22]已經(jīng)出現(xiàn)利福平抗性布魯氏菌，我國近年來也有相關利福平抗性分離株的報道[23]。利福平抗性基因rpoB突變后能夠產(chǎn)生抗性菌株。布魯氏菌基因組中是否有其他基因參與利福平代謝尚無報道。本研究選擇羊種3型代表菌株，利用人工誘變技術獲得利福平抗性菌株，通過轉錄組測序篩選利福平代謝相關基因，預測利福平代謝的主要代謝途徑。旨在為布魯氏菌耐藥相關基因的篩選提供新思路，為布魯氏菌耐藥菌株的防控提供基礎性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1布魯氏菌菌株和基因組 羊種布魯氏菌3型標準菌株于中國疾病預防控制中心傳染病所BSL-3實驗室內(nèi)傳代培養(yǎng)，其基因組序列及其氨基酸序列于NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫中下載(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/740/355/GCF_000740355.1_ASM74035v1/)，rpoB基因序列參考NCBI Gene數(shù)據(jù)庫中Gene ID: 29593532序列。

1.2MIC值檢測 劃線培養(yǎng)羊種布魯氏菌1型和3型菌株，取3～5個單菌落利用生理鹽水調整布魯氏菌比濁度為0.5個麥氏單位，利用96孔凝集板倍比稀釋利福平至0.125～256 μg/mL，加入100 μL稀釋的待檢菌液(布魯氏菌量為1×105CFU/孔)，37 ℃培養(yǎng)48 h，質控菌株為肺炎鏈球菌 ATCC 49619(參考CISL_M45(2016))，同時設置陰性、陽性對照。

1.3利福平抗性菌株誘導 配置含利福平0.125～256 μg/mL的布氏瓊脂培養(yǎng)基，劃線培養(yǎng)布魯氏菌后，取單菌落接種于含0.125 μg/mL利福平的布氏瓊脂培養(yǎng)基中，待其長出單菌落后于相同濃度利福平培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，多次傳代，待其抗性表型穩(wěn)定后再接種于高利福平濃度的培養(yǎng)基中，同時利用未添加利福平的布氏瓊脂培養(yǎng)基做對照，檢測單菌落生長速度。

1.4紙片法藥敏檢測 劃線培養(yǎng)羊種3型布魯氏菌菌株，取3～5個單菌落利用生理鹽水調整布魯氏菌比濁度為0.5個麥氏單位，取調整后布魯氏菌菌液100 μL溶解于含0.7%瓊脂的半固體布氏瓊脂培養(yǎng)基，使菌液均勻分布于整個培養(yǎng)基中，選擇利福平藥敏片(OXID)貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)48 h，檢測抑菌圈大小。

1.5RNA提取及轉錄組測序 培養(yǎng)至對數(shù)生長期早期的菌株中加入2倍體積RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen)，混勻后室溫孵育5 min，5 000 ×g離心10 min收集沉淀，Trizol法抽提細菌總RNA；利用DNA酶消化提取的樣品總RNA，利用NanoDrop檢測總RNA OD260/280(≥1.8)和OD260/230(≥1.8)、Algilent 2100檢測總RNA濃度(≥40 ng/μL)、23S/16S(≥1.0)、RIN值(≥7.0)，檢測合格后送交華大基因有限公司測序。每個樣品重復3次后混合。檢測合格的樣品利用磁珠法去除樣品中的rRNA后，然后進行片段化處理。隨后合成雙鏈cDNA并進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，將構建好的測序文庫使用HiSeq測序。

1.6轉錄組測序分析 將獲得的原始數(shù)據(jù)過濾掉低質量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads，得到可用數(shù)據(jù)。使用Bowtie2[24]軟件將可用數(shù)據(jù)比對到參考基因，之后再使用RSEM[25]軟件包計算基因的表達水平，篩選差異表達基因，并對差異表達基因做深入的聚類分析和功能富集分析等。

1.7RpoB基因突變檢測 針對rpoB基因全長序列和高變位點利用primer 5設計引物進行PCR擴增，擴增體系為50 μL，擴增條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(高變位點)/4 min(全長)，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物跑膠檢測大小無誤后送樣測序。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計 利用excel2016對數(shù)據(jù)進行初步統(tǒng)計，利用R3.4.3程序繪制熱圖、venn圖等，利用R或者SPSS23.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1人工誘導獲得利福平抗性菌株 利用稀釋法檢測羊種布魯氏菌3型標準菌株利福平MIC值，結果為0.5 μg/mL，表明該菌株沒有利福平抗性。經(jīng)多次傳代誘導，最終獲得了能夠在256 μg/mL利福平布氏瓊脂培養(yǎng)基上生長的布魯氏菌菌株(圖1)。該菌株利福平抗性表型穩(wěn)定，與標準菌株相比，在布氏瓊脂培養(yǎng)基上生長狀態(tài)及速度差異不明顯。擴增rpoB基因高變區(qū)測序結果表明，rpoB基因1606位點由C變?yōu)門，基因全長測序表明，除1 606位點外，rpoB基因其余位點未出現(xiàn)變異。以上結果表明，通過不同濃度的利福平人工誘變，能夠獲得抗性表型穩(wěn)定的布魯氏菌變異菌株。

(左)人工誘變布魯氏菌利福平抗性菌株和(右)布魯氏菌標準菌株

2.2轉錄組測序分析 本研究利用轉錄組測序分析標準菌株和利福平抗性菌株全基因組水平的基因表達量變化。原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后獲得對照菌株(BM3T)6 845 213條reads，抗性菌株(BM3256)7 324 536條reads，覆蓋基因組分別為98.64%和98.38%。檢測基因的表達量可知，與標準菌株相比，利福平抗性菌株中121個基因表達量上調，197個基因表達量下調(圖2)。

圖2 利福平抗性菌株差異表達基因聚類熱圖

2.3差異基因功能分析 將差異表達的基因進行GO(gene ontology)和KEGG功能聚類分析。121個表達量上調的基因中，85個能夠比對到GO數(shù)據(jù)庫中，分子功能占84.7%，細胞成分占47.1%，生物過程占57.6%。分子功能中主要集中于催化活性和結合功能；細胞成分中主要集中于膜、膜成分和細胞；生物過程主要集中于代謝過程和細胞過程。197個表達量上調的基因中，144個能夠比對到GO數(shù)據(jù)庫中，分子功能占76.4%，細胞成分占51.4%，生物過程占57.6%。GO功能分類基本與上調基因功能類似，但部分功能如細胞器、細胞器組分、結構分子活性未在表達量上調的基因中發(fā)現(xiàn)(圖3)。

注：A為表達量上調基因的GO功能分析，B為表達量下調基因的GO功能分析。

KEGG功能聚類分析中，表達量上調的基因參與的KEGG代謝通路主要集中于不同環(huán)境中的微生物代謝、碳代謝和抗生素的生物合成；表達量下調的基因參與的KEGG代謝通路則主要集中于細菌分泌系統(tǒng)、磷酸肌醇代謝和ABC 轉運(圖4)。

注：A為表達量上調基因的KEGG功能分析，B為表達量下調基因的KEGG功能分析。

參與催化活性、結合、細胞成分、膜和細胞成分、代謝過程和細胞過程的基因在利福平存在的條件下差異表達，這些基因參與碳代謝、抗生素的生物合成、細菌分泌系統(tǒng)、磷酸肌醇代謝和ABC 轉運蛋白等代謝通路。以上結果表明，布魯氏菌通過多種代謝途徑來代謝/抵御利福平的作用。

2.4差異基因相關性分析 將差異表達基因比對至STRING數(shù)據(jù)庫，利用與已知蛋白的同源性獲得基因間的互作關系。結果發(fā)現(xiàn)，表達量下調的基因中，存在互作相關蛋白，經(jīng)同源篩選發(fā)現(xiàn)11個互作基因，屬于virB操縱子，編碼IV型分泌系統(tǒng)(圖5)。

注：A為表達量上調基因的互作關系圖，B為表達量下調基因的互作關系圖。

3 討 論

利福平屬于利福霉素抗生素組，通過阻斷細菌RNA和蛋白質合成引發(fā)其殺菌作用，布魯氏菌利福平抗性相關基因rpoB基因編碼DNA依賴性的RNA聚合酶β亞基，該基因突變后導致菌株對利福平的親和力降低[26]。對羊種和牛種布魯氏菌的研究表明，rpoB基因存在影響利福平抗性水平的高變位點(1 560-1 740位點)[27]。本研究的結果與前人研究結果[27]類似，人工誘變的利福平抗性布魯氏菌rpoB基因1 606位點出現(xiàn)單核苷酸突變。由于針對布魯氏菌的研究需要生物安全三級實驗室(Biosafety Level-3，BSL-3)，因此，常規(guī)的耐藥研究很少涉及布魯氏菌。目前的研究表明，布魯氏菌耐利福平與rpoB基因突變相關[27]，其他基因的表達量變化是否影響布魯氏菌利福平抗性表型尚無報道。本研究通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn)，virB操縱子等基因與利福平抗性相關。

IV型分泌系統(tǒng)是多蛋白復合物，存在于許多革蘭氏陰性菌中，如根瘤菌、幽門螺旋桿菌、嗜肺軍團菌和布魯氏菌等[28]。IV型分泌系統(tǒng)允許底物通過細胞膜，將分泌性蛋白釋放到宿主細胞中，同時，在接合、DNA攝取和釋放等方面也發(fā)揮重要作用，是布魯氏菌重要的毒力因子，是由virB操縱子編碼[29]。本研究中轉錄組測序結果表明，virB操縱子在利福平抗性菌株中表達量下調。virB操縱子包括12個基因，即virB1-12，與細菌在細胞內(nèi)復制和形成持續(xù)性感染有關[30]。布魯氏菌侵入宿主細胞后，形成含有布魯氏菌液泡(Brucella-containing vacuole，BCV)，BCV與溶酶體融合，大約90%的BCV被吞噬溶酶體降解，剩余10%的BCV可能通過酸化機制逃避宿主免疫機制，隨后觸發(fā)virB操縱子釋放大量分泌性蛋白進入宿主細胞質中[31]。virB操縱子中不同的基因功能不同，virB1可能影響著其它virB蛋白，virB6、virB7和virB10蛋白是細菌跨膜蛋白的傳送信號，VirB4和VirB11蛋白與VirD4蛋白偶聯(lián)使ATP酶從表面跨膜進入細胞質，virB2和virB5蛋白可能是細菌表面菌毛結構蛋白，virB8在IV型分泌系統(tǒng)中起主要作用, 主要是與virB9和virB10在細胞膜上形成群體[32]，virB3和virB12功能尚不明確，推測可能與復合體的裝配有關[33]。IV型分泌系統(tǒng)是布魯氏菌毒力的重要組成部分，對于布魯氏菌的胞內(nèi)寄生和逃逸宿主免疫具有重要的作用。當前對于IV型分泌系統(tǒng)的組成及編碼相關基因的功能研究較為明確。本研究中發(fā)現(xiàn)，利福平抗性菌株中virB操縱子的表達量降低，推測布魯氏菌virB操縱子與利福平抗性相關，通過降低virB操縱子基因的表達來抵御利福平的作用。

綜上，本研究通過不同濃度的利福平人工誘變，能夠獲得抗性表型穩(wěn)定的布魯氏菌變異菌株。同時，利用轉錄組測序方法發(fā)現(xiàn)利福平抗性菌株中121個基因表達量上調，197個基因表達量下調，差異基因功能主要集中于催化活性、結合、細胞成分、膜和細胞成分、代謝過程和細胞過程；主要參與碳代謝、抗生素的生物合成、細菌分泌系統(tǒng)、磷酸肌醇代謝和ABC轉運蛋白等代謝通路。包括virB操縱子在內(nèi)的涉及碳代謝等代謝通路的基因，通過表達量的改變參與抵抗利福平的作用。本研究通過人工誘變菌株的全轉錄組檢測為布魯氏菌耐藥相關基因的篩選提供新思路，篩選出的差異表達基因作為布魯氏菌利福平抗性候選基因，為布魯氏菌利福平抗性的研究奠定了基礎，同時為布魯氏菌耐藥菌株的防控提供基礎性數(shù)據(jù)。

利益沖突：無