李寶林，袁 蘭，葉 婷，田 剛，曾章銳，蔡宛玲，羅思劍，劉靳波

2019 年12月在中國(guó)湖北省武漢市首次報(bào)道有新型冠狀病毒感染的肺炎病例，此后在其他省份相繼有報(bào)告類似病例[1-2]。2020年2月11日國(guó)際病毒分類委員會(huì)將新型冠狀病毒正式命名為SARS-CoV-2，2020年2月22日，國(guó)家衛(wèi)健委正式將新型冠狀病毒肺炎英文名稱修訂為COVID-19[3]。在最新的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[4]中闡述病例診斷需具備病原學(xué)特征之一：1)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2 核酸陽(yáng)性；2)病毒基因測(cè)序，與已知的 SARS-CoV-2 高度同源。因此準(zhǔn)確、及時(shí)的病原學(xué)核酸檢測(cè)已成為診斷 SARS-CoV-2感染的重要環(huán)節(jié)。同時(shí)在第六版方案鑒別診斷中指出：新型冠狀病毒感染輕型表現(xiàn)需與其它病毒引起的上呼吸道感染相鑒別；新型冠狀病毒肺炎主要與流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原體感染鑒別。強(qiáng)調(diào)“對(duì)疑似病例要盡可能采取包括快速抗原檢測(cè)和多重PCR核酸檢測(cè)等方法，對(duì)常見(jiàn)呼吸道病原體進(jìn)行檢測(cè)”。

引起發(fā)熱、咳嗽等上呼吸道癥狀，又能感染下呼吸道引起肺炎，類似SARS-CoV-2感染的病原體有多種，如SARS冠狀病毒[1]。SARS-CoV-2病毒更容易傳播，潛伏期更長(zhǎng)[5]，這給臨床診斷帶來(lái)很大困難，及時(shí)有效的鑒別出患者病原體感染，在疫情防控中將起到重要作用。本研究對(duì)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院114例COVID-19疑似患者咽拭子標(biāo)本進(jìn)行回顧分析，檢測(cè)患者是否有其它呼吸道病毒感染。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 2020年2月1日至2020年2月12日，收集西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院114例新冠疑似患者咽拭子標(biāo)本，114例門(mén)診患者均有發(fā)熱、咳嗽等上呼吸道癥狀，部分患者有下呼吸道癥狀。男性55例，女性59例，年齡最小出生16 d，最大80歲。

1.2試劑與儀器 半自動(dòng)核酸提取儀EX3600及配套核酸提取試劑(批號(hào)：P20200203)購(gòu)自上海之江生物科技股份有限公司。SARS-CoV-2核酸擴(kuò)增試劑由湖南圣湘生物科技股份有限公司(批號(hào)：2020004)和上海之江生物科技股份有限公司(批號(hào)：P20200203)提供。SARS-CoV-2核酸擴(kuò)增設(shè)備ABI7500熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司。呼吸道病毒核酸檢測(cè)試劑盒及配套核酸檢測(cè)設(shè)備加熱離心機(jī)、RTisochipTM-A微流控芯片核酸分析儀購(gòu)自成都博奧晶芯生物科技有限公司。

1.3標(biāo)本的采集與處理 咽拭子標(biāo)本采集按照國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第四版)》進(jìn)行采集[6]，將收到的標(biāo)本置于56 ℃烤箱中30 min進(jìn)行滅活處理，滅活后標(biāo)本管在振蕩器振蕩不低于2 min。核酸的提?。喝? 000 μL標(biāo)本洗脫液13 000 r/min離心10 min，棄部分上清，留取300 μL上清液與沉淀混勻，將混合物吸入EX3600核酸提取儀預(yù)裝板A孔中，將預(yù)裝板置于設(shè)備固定位置，啟動(dòng)核酸提取程序提取核酸，洗脫體積70 μL。

1.4SARS-CoV-2核酸的擴(kuò)增 SARS-CoV-2核酸擴(kuò)增引物及探針均由湖南圣湘提供，有2個(gè)靶序列。FAM區(qū)域靶標(biāo)(ORF 1ab)：ROX區(qū)域靶標(biāo)(N基因)：內(nèi)標(biāo)通道VIC檢測(cè)人體細(xì)胞核糖核酸酶P(Ribonuclease P，RNase P)，所有檢測(cè)標(biāo)本核酸同時(shí)再用上海之江SARS-CoV-2擴(kuò)增試劑擴(kuò)增驗(yàn)證ORF 1ab和N基因，所有操作均按照試劑說(shuō)明書(shū)操作。核酸確診陽(yáng)性根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第四版)》要求進(jìn)行判讀。

1.5呼吸道病毒核酸擴(kuò)增 按照博奧呼吸道病毒核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，呼吸道病毒核酸擴(kuò)增結(jié)果判讀：結(jié)果由軟件自動(dòng)分析，出現(xiàn)S型曲線且Tp(Time postive)值≤35，則判斷為陽(yáng)性。出現(xiàn)S型曲線且Tp值>35，報(bào)告為疑似陽(yáng)性。當(dāng)無(wú)S型曲線且Tp值顯示為“-”，則判斷為陰性。Tp值定義：“S”型曲線進(jìn)入快速擴(kuò)增期的第1個(gè)拐點(diǎn)，拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)的時(shí)刻與原點(diǎn)時(shí)刻的差值定義為T(mén)p值，單位為min。呼吸道病毒核酸檢測(cè)指標(biāo)有：甲型流感病毒2009 H1亞型、甲型流感病毒季節(jié)性 H1亞型、甲型流感病毒季節(jié)性 H3亞型、甲型流感病毒 H7亞型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腸道病毒/鼻病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16型、柯薩奇病毒A6型、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型、人副流感病毒4型、人偏肺病毒、冠狀病毒OC43/HKU1型、冠狀病毒NL63/229E型。

2 結(jié) 果

2.1COVID-19疑似患者SARS-CoV-2核酸擴(kuò)擴(kuò)增曲線 采用2種試劑平行對(duì)114例COVID-19疑似患者進(jìn)行SARS-CoV-2核酸擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。部分患者內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖1，圖1A是由湖南圣湘檢測(cè)試劑進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)標(biāo)Ct值集中在20～25之間，圖1B是由上海之江檢測(cè)試劑進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)標(biāo)Ct值集中在28～31之間。

圖1 SARS-CoV-2核酸擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增曲線

2.2114例COVID-19疑似患者18種呼吸道病毒核酸檢測(cè) 114例COVID-19疑似患者中，有21例查出非SARS-CoV-2感染的呼吸道病毒，感染率達(dá)18.42%，≤20歲有8例，≤40歲有7例，≤60歲有6例。同時(shí)感染兩種病毒的有3例：病例15混合感染了呼吸道合胞病毒和柯薩奇病毒A16型，病例45混合感染了冠狀病毒NL63/229型和人副流感病毒1型，病例74混合感染了甲型流感病毒和甲型流感病毒季節(jié)性H3亞型。21例患者中，感染乙型流感病毒有6例，感染呼吸道合胞病毒有5例，感染冠狀病毒NL63/229型和腸道病毒/鼻病毒各有3例，感染人偏肺病毒有2例，詳見(jiàn)表1。

表1 21例COVID-19疑似患者呼吸道病毒病毒感染分析

2.310種呼吸道病毒恒溫?cái)U(kuò)增曲線及Tp值 21例呼吸道病毒感染患者中，共有10種病毒感染，病毒恒溫曲線見(jiàn)圖2，其中A代表的是乙型流感病毒。PC(Positive external control)外對(duì)照，芯片中預(yù)包埋的陽(yáng)性對(duì)照品，檢測(cè)整個(gè)恒溫?cái)U(kuò)增過(guò)程是否存在抑制物。IC(Internal control)內(nèi)對(duì)照，擴(kuò)增樣本中的管家基因GAPDH，檢測(cè)整個(gè)采樣和提取過(guò)程是否合格。圖2中的PC和IC擴(kuò)增都很明顯，說(shuō)明整個(gè)實(shí)驗(yàn)是成功的。各病例病毒擴(kuò)增Tp值見(jiàn)表1。

圖2 呼吸道病毒恒溫?cái)U(kuò)增曲線圖

3 討 論

2020年1月7日，研究人員從一名武漢患者體內(nèi)成功分離出SARS-CoV-2病毒并進(jìn)行了全基因組測(cè)序[7-8]，研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2是冠狀病毒的一種，其中有2種冠狀病毒，嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)已經(jīng)在世界范圍內(nèi)引起了了嚴(yán)重急性呼吸道疾病的暴發(fā)[9]。SARS-CoV-2發(fā)病時(shí)常見(jiàn)臨床癥狀有發(fā)熱、干咳、肌肉疼痛，這些癥狀和SARS-CoV、MERS-CoV很像，因此，快速準(zhǔn)確的臨床診斷成為控制疫情的關(guān)鍵，但是面對(duì)未知病毒的感染，快速對(duì)其進(jìn)行鑒別診斷、排除其它病毒感染、進(jìn)行多種病原體檢測(cè)同樣顯得重要，在不同版本的《新型冠狀病毒感染的肺炎治療方案》中也多次提出。Chen等[10]研究了99例COVID-19感染患者，發(fā)現(xiàn)1例(1%)合并細(xì)菌感染，4例(4%)合并真菌感染，汪明等[11]對(duì)武漢地區(qū)8 274例新型冠狀病毒核酸受檢者同時(shí)進(jìn)行13種常見(jiàn)呼吸道病原體多重PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2陽(yáng)性患者會(huì)合并感染其他病原體。以上都說(shuō)明，在防控COVID-19疫情時(shí)必須把其它病原體納入檢測(cè)計(jì)劃中。本研究將114例COVID-19疑似患者做為研究對(duì)象，采用恒溫?cái)U(kuò)增法對(duì)其咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了18種呼吸道病毒檢測(cè)的回顧性分析，該技術(shù)能夠快速精準(zhǔn)的檢測(cè)MERS-CoV的ORF基因和N基因，效果優(yōu)于實(shí)時(shí)定量RT-PCR[12-13]。通過(guò)篩查發(fā)現(xiàn)18.42%的SARS-CoV-2核酸陰性患者有呼吸道病毒感染。包括5例嬰幼兒和1例兒童，6例患者均感染了不同的呼吸道病毒，這與李權(quán)恒等[14]研究有一定出入，也更加說(shuō)明了呼吸道感染的復(fù)雜性。而在所有感染的患者中，從0歲到60歲均有人群感染不同的呼吸道病毒，沒(méi)有明顯年齡易感趨勢(shì)，這和SARS-CoV-2感染很相似，因此在整個(gè)疫情防控中一定要做好呼吸道病毒感染的鑒別。

利益沖突：無(wú)