馬 彥，曹 雪，李 雯，李雪靜，冀 英，楊 靜，岑 雯，馮文莉

由機(jī)會(huì)致病真菌煙曲霉引起的侵襲性曲霉病(IA)是免疫功能低下患者感染性死亡的主要原因之一[1]。免疫調(diào)節(jié)治療聯(lián)合抗真菌治療目前被認(rèn)為能最有效地改善疾病[2-4]。煙曲霉與宿主的相互作用是動(dòng)態(tài)的、復(fù)雜的。宿主免疫系統(tǒng)需識(shí)別煙曲霉的不同形態(tài)以控制真菌生長(zhǎng)，防止組織入侵。煙曲霉的生命周期及其細(xì)胞壁隨形態(tài)變化而變化，這在煙曲霉致病中極其重要[5]。生長(zhǎng)發(fā)芽是菌株在體內(nèi)致病的重要環(huán)節(jié)[6]。出芽蛋白BEM46屬于α/β水解酶超家族成員，在進(jìn)化上相對(duì)保守。粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)中BEM46為菌絲特異性生長(zhǎng)所必需，它通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)決定或維持細(xì)胞的極性生長(zhǎng)[7]。目前出芽蛋白BEM46在煙曲霉極性生長(zhǎng)中的作用尚不明確。本研究旨在初步對(duì)編碼出芽蛋白BEM46的基因在煙曲霉極性生長(zhǎng)中定位及相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 煙曲霉Bem46基因缺陷株(ΔBem46)為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，具體構(gòu)建方法見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。熒光標(biāo)記eGFP來(lái)自質(zhì)粒為pUCGH，該質(zhì)粒含有潮霉素抗性基因，可用于篩選含有熒光標(biāo)記成功的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化和對(duì)照用菌株Ku80和質(zhì)粒均由美國(guó)Duke大學(xué)分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室William J. Steinbach教授贈(zèng)送。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

1.2.1培養(yǎng)基 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化常用培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[8]。

1.2.2試劑和儀器 溶壁酶:Vinoflow FCE 購(gòu)自Novozymes公司；Gene JET Gel Extraction Kit、 Gene JET Plasmid Miniprep Kit、Fast DigestKpnI、 Fast DigestBamHI、Fast DigestSbfI和Fast DigestHindIII均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，T4DNA Ligase購(gòu)自TaKaRa，潮霉素B購(gòu)自Sigma公司。DH5α細(xì)胞購(gòu)自生工。激光共聚焦顯微鏡的型號(hào)FV1 000，日本奧林巴斯公司。

1.3DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備 -80 ℃保存的DH5α感受態(tài)細(xì)胞菌懸液冰上融化后接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min過(guò)夜震蕩培養(yǎng)，在100 mL LB液體培養(yǎng)基中加入2 mL新培養(yǎng)的菌懸液，振蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)0.55后置于冰上；然后5 000 r/min，4 ℃離心10 min；棄去上清，用預(yù)冷的氯化鎂溶液輕柔重懸細(xì)胞，于冰上5 min，再次4 000 r/min低溫離心10 min，棄上清，用預(yù)冷的氯化鈣溶液重懸細(xì)胞，冰浴20 min后再次4 000 r/min低溫離心10 min，棄上清，用20 mL氯化鈣-甘油溶液重懸細(xì)胞，-80 ℃分裝保存。

1.4 構(gòu)建煙曲霉Bem46基因熒光定位株

1.4.1Bem46基因擴(kuò)增 利用煙曲霉基因組(www.aspergillusgenome.org) 找出同N.crassa中Bem46基因同源的基因及該基因下游約1 000 bp大小的序列。

1.4.2熒光定位菌株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建 克隆煙曲霉Bem46基因的ORF(不含終止密碼子)后，利用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI，將該基因全序列克隆連接入pUCGH質(zhì)粒，得到pUCGH-Bem46質(zhì)粒。擴(kuò)增Bem46基因下游約1 000 bp長(zhǎng)度的側(cè)翼序列，利用限制性內(nèi)切酶SbfI和HindIII將片段連接入pUCGH-Bem46質(zhì)粒得到pUCGH-Bem46-term。構(gòu)建使用及驗(yàn)證引物見(jiàn)表1。用KpnI和HindIII酶切質(zhì)粒pUCGH-Bem46-term，酶切片段4 ℃保存做原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化用。

表1 構(gòu)建煙曲霉Bem46熒光定位轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體及驗(yàn)證用引物

1.4.3煙曲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法構(gòu)建Bem46基因熒光定位株 在200 mL GMM+YE液體培養(yǎng)基中加入2 mLKu80孢子菌懸液，37 ℃ 250 r/min振蕩過(guò)夜。于50 mL離心管中將3 g Vinoflow放入 40 mL Osmotic Media中振蕩混勻。28 ℃ 75 r/min，搖床4 h，間斷輕柔吹打混勻。沿管壁緩慢加入10 mL Trapping Buffer， 4 ℃ 3 500 r/min，離心10 min。輕柔將原生質(zhì)吸取至15 mL離心管，置于冰上。然后加入12 mL STC，輕柔顛倒混勻，3 500 r/min低溫離心8 min后放于冰上。棄上清，加入1 mL STC，輕吹上層白色沉淀，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，再次加STC離心，棄上清。加1 mL STC，輕柔吹打混勻，顯微鏡下觀察原生質(zhì)體狀況，備用。取15 mL離心管將5 μg酶切片段產(chǎn)物及200 μL原生質(zhì)體混合，置于冰上1 h。在離心管中將1.25 mL PEG-CaCl2，酶切片段-原生質(zhì)體混合物輕柔混勻，室溫下放置 20 min，將4 mL STC加入，輕輕上下混勻。在SMM平皿上平鋪200 μL混合物，過(guò)夜后其上加蓋含潮霉素的SMM培養(yǎng)基，37 ℃孵箱培養(yǎng)3 d，觀察平皿上菌落生長(zhǎng)狀況。具體操作方法見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。

1.5激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光在煙曲霉不同形態(tài)中的分布 將煙曲霉Bem46熒光定位株孢子懸液定量，在10 mL GMM液體培養(yǎng)基中加入10 μL 1×106個(gè)/mL 孢子懸液，輕柔混勻，倒入滅菌培養(yǎng)皿；75%酒精沖洗蓋玻片后過(guò)火，將蓋玻片放入培養(yǎng)皿，盡量避免產(chǎn)生氣泡；于37 ℃避光培養(yǎng)；分別于培養(yǎng)5 h、6 h和16 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出蓋玻片置于載玻片上，共聚焦顯微鏡觀察。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)極性生長(zhǎng)相關(guān)基因Bem1、Bud5表達(dá)量 煙曲霉基因組(www.aspergillusgenome.org) 中查找極性生長(zhǎng)相關(guān)基因Bem1和Bud5基因序列，設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表2)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增極性生長(zhǎng)相關(guān)基因Bem1、Bud5和內(nèi)參基因所用引物

提取對(duì)照菌株Ku80及煙曲霉ΔBem46總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA(按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行 操作)。反應(yīng) 體系10 μL如下：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNA 1 μL，RNase-free水 7 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，10 ℃保溫。將產(chǎn)物濃度定量并儲(chǔ)存于4 ℃。

RT-PCR檢測(cè)煙曲霉ΔBem46中極性生長(zhǎng)相關(guān)基因Bem1、Bud5的表達(dá)水平。內(nèi)參基因?yàn)棣?tubulin。研究中所用引物列于表2。反應(yīng)體系如下：cDNA 2 μL， SYBR Premix Ex TaqII 10 μL，上下游引物分別0.8 μL，雙蒸水 6.4 μL, 共20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 30 s；PCR 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解 95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s；降溫 50 ℃ 30 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.7統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)算基因表達(dá)量：將Cq值等數(shù)據(jù)從LightCycler96 PCR儀導(dǎo)出，Ku80作為對(duì)照菌株，計(jì)算2-ΔΔCq，其中ΔΔCq=(Cq目的基因-Cq內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Cq目的基因-Cq內(nèi)參基因)對(duì)照組，得出Bem1和Bud5基因在ΔBem46基因缺陷株相對(duì)于Ku80表達(dá)的變化倍數(shù)。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)6次。采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1煙曲霉Bem46基因熒光定位菌株構(gòu)建模式圖

見(jiàn)圖1，在煙曲霉基因組中通過(guò)序列比對(duì)找到Bem46基因，Afu7g04660，1 116 bp個(gè)堿基編碼311個(gè)氨基酸。將該基因全序列克隆入質(zhì)粒pUCGH。圖1中將煙曲霉Bem46全基因插入到質(zhì)粒pUCGH熒光標(biāo)記eGFP上游，將煙曲霉Bem46基因下游約1 000 bp序列連接入篩選標(biāo)記潮霉素下游。

圖1 利用含有熒光定位標(biāo)記eGFP的質(zhì)粒pUCGH構(gòu)建熒光定位株載體示意圖

2.2 煙曲霉Bem46基因熒光定位菌株驗(yàn)證

2.2.1熒光定位菌株構(gòu)建載體Bem46基因測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 將Bem46基因正確成功連接入質(zhì)粒pUCGH后進(jìn)行Bem46基因測(cè)序，確保正確的基因序列被克隆。由圖2可見(jiàn)測(cè)序結(jié)果為整齊單一序列峰，且同煙曲霉基因組中Bem46基因序列比對(duì)完全符合。

圖2 構(gòu)建熒光定位菌株載體中Bem46基因測(cè)序結(jié)果(部分)

2.2.2熒光定位菌株轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證結(jié)果 根據(jù)Bem46基因序列設(shè)計(jì)了3組引物來(lái)驗(yàn)證定位菌株構(gòu)建是否成功，結(jié)果見(jiàn)圖3。具體引物配對(duì)以及擴(kuò)增相應(yīng)片段大小見(jiàn)表3。

表3 煙曲霉Bem46基因熒光定位菌株驗(yàn)證使用引物及相應(yīng)片段大小

菌株1,2,3,4,5,6均是轉(zhuǎn)化子，Ku80為對(duì)照菌株

由表3可見(jiàn)引物I中煙曲霉Bem46定位菌株轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增條帶約1.2 kb，而對(duì)照菌株無(wú)條帶出現(xiàn)，在圖3 I中轉(zhuǎn)化子1、2、3、4、5、6有正確大小的條帶，說(shuō)明有篩選標(biāo)記eGFP同目的基因Bem46相連接。引物II熒光定位菌株應(yīng)有擴(kuò)增條帶約1.0 kb，而對(duì)照菌株沒(méi)有，在圖3 II中可見(jiàn)到轉(zhuǎn)化子1、2、3、4、5、6有篩選標(biāo)記潮霉素同目的基因Bem46下游1.0 kb序列相連接。引物III擴(kuò)增整個(gè)基因、連接入的質(zhì)粒及下游1.0 kb序列，在對(duì)照菌株無(wú)質(zhì)粒的連接，條帶為2.3 kb，而在轉(zhuǎn)化子由于有質(zhì)粒連接進(jìn)入故條帶明顯增大，為7.2 kb，圖3 III中說(shuō)明轉(zhuǎn)化子1、2、3、4、5、6均為正確的轉(zhuǎn)化子，有質(zhì)粒成功連接進(jìn)入。 通過(guò)I、II和III對(duì)引物驗(yàn)證表明轉(zhuǎn)化子1、2、3、4、5、6均為構(gòu)建成功的熒光定位菌株，可用來(lái)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3激光共聚焦顯微鏡觀察熒光分布結(jié)果 觀察發(fā)現(xiàn)在煙曲霉處于孢子狀態(tài)時(shí)，綠色熒光彌漫分布于孢子內(nèi)，見(jiàn)圖4A。在孢子發(fā)芽出現(xiàn)芽管時(shí)，可見(jiàn)到綠色熒光在孢子壁一側(cè)，靠近發(fā)芽部位，且可隨著芽管的出現(xiàn)熒光沿芽管向前延伸見(jiàn)圖4B。在菌絲狀態(tài)時(shí)，可見(jiàn)綠色熒光呈彌散分布見(jiàn)圖4C所示1處，但可見(jiàn)到在菌絲即將膨大出芽形成新分支處，熒光有聚集現(xiàn)象，如圖4C所示2和3處。

A 孢子狀態(tài)下Bem46基因定位菌株熒光分布情況

B 處于孢子發(fā)芽成芽管狀態(tài)時(shí)Bem46基因熒光分布情況

C 處于菌絲狀態(tài)時(shí)Bem46基因熒光定位情況(1：菌絲，2，3：分支膨大處)注：圖片左側(cè)均為光鏡背景，右側(cè)為熒光背景，左右兩側(cè)為同一視野。

2.4RT-PCR法檢測(cè) 對(duì)照株Ku80及ΔBem46中極性生長(zhǎng)相關(guān)基因Bem1和Bud5的表達(dá)，由圖5A可見(jiàn)Bem1基因在煙曲霉ΔBem46中的表達(dá)量為0.67±0.052，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.430,P<0.001)，說(shuō)明由于Bem46基因的缺失，Bem1基因表達(dá)量下降為正常時(shí)的0.67倍。由圖5B可見(jiàn)Bud5基因在煙曲霉ΔBem46中的表達(dá)量為0.881±0.07，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.168,P<0.05)。說(shuō)明由于Bem46基因的缺失，Bud5基因表達(dá)量下降為正常時(shí)的0.881倍。

A為Bem1基因，B為Bud5基因；①為P<0.05

3 討 論

近年來(lái)雖然在侵襲性曲霉病的診斷技術(shù)和抗真菌藥物的研發(fā)上取得了一定的進(jìn)步，然而侵襲性曲霉病的發(fā)病率和致死率仍然比較高，煙曲霉是侵襲性曲霉病最常見(jiàn)的致病菌[10]，為開發(fā)治療曲霉菌相關(guān)疾病的新方法，因而對(duì)最常見(jiàn)的煙曲霉生理生化性質(zhì)及其同煙曲霉的致病性的研究更有必要[11]。絲狀真菌的感染周期包括2個(gè)主要階段：入侵(生長(zhǎng))和擴(kuò)散(發(fā)展)。孢子在宿主身上沉積后，營(yíng)養(yǎng)體的萌發(fā)、極性伸展和分枝是造成菌絲快速有效入侵的前提[12]。

目前對(duì)于Bem46基因的研究主要集中在模式生物。在瘧原蟲該基因主要定位于子孢子中獨(dú)特的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，在裂殖過(guò)程中，形成較少的裂殖子，降低子孢子的感染力[13]。Kempken團(tuán)隊(duì)在模式絲狀真菌N.crassa的研究表明Bem46基因在細(xì)胞型特異性菌絲的形成中扮演重要角色，這表明該基因在維持細(xì)胞極性中有一定作用，該基因缺陷株顯示子囊孢子萌發(fā)成菌絲表現(xiàn)出極性的缺失[7]。他們還發(fā)現(xiàn)Bem46基因定位于核周內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并在靠近質(zhì)膜處形成斑點(diǎn)，可利用Bem46基因的保守區(qū)域進(jìn)行真菌菌屬的鑒定[14]。并且N.crassa中Bem46基因的過(guò)度表達(dá)可影響吲哚生物合成基因的調(diào)控，它能與中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體MTR共域化[15]。致病真菌煙曲霉基因組同N.crassa基因組同源性較高，我們推測(cè)煙曲霉中N.crassa的Bem46同源基因可能有類似作用，這對(duì)于我們深入了解其致病有重要意義。前期我們構(gòu)建了煙曲霉Bem46基因的缺陷株，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)ΔBem46發(fā)芽速度較對(duì)照菌株滯后，我們推測(cè)該基因可能和煙曲霉的發(fā)芽有關(guān)[8]。在此研究基礎(chǔ)上，我們利用含有熒光報(bào)告基因eGFP的pUCGH質(zhì)粒，構(gòu)建了煙曲霉Bem46基因定位菌株。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)煙曲霉處于孢子狀態(tài)時(shí)，熒光的分布是彌散的，沒(méi)有明確的定位點(diǎn)。但是隨著煙曲霉孢子的生長(zhǎng)發(fā)育，當(dāng)其開始發(fā)芽時(shí)，我們注意到熒光向孢子一側(cè)細(xì)胞壁聚集，并且隨著芽管的出現(xiàn)，熒光定位從側(cè)壁處突出，沿芽管方向延伸逐漸形成菌絲，而后彌漫擴(kuò)散在整個(gè)菌絲中，并沒(méi)有定位在細(xì)胞壁或者分隔等特殊部位。但是隨著菌絲的增多、分支，在側(cè)壁新的分支形成處可見(jiàn)局部膨大部位熒光聚集。在煙曲霉整個(gè)孢子形成菌絲過(guò)程中我們可看到熒光隨極性生長(zhǎng)點(diǎn)位置的變動(dòng)，從而推斷該基因可能同煙曲霉極性生長(zhǎng)相關(guān)。有研究表明在裂殖酵母中Bem46被認(rèn)為是酵母菌Bem1和Bud5雙突變體的溫度敏感抑制基因，而Bud5是酵母出芽所必須的基因，它同芽管形成基因Bem1相互作用[14]。在構(gòu)巢曲霉中BemA基因缺失導(dǎo)致菌絲頂端形態(tài)異常，分生孢子囊泡產(chǎn)生后發(fā)育停滯，定位研究表明，BemA在菌絲頂端形成了一個(gè)清晰的帽狀結(jié)構(gòu)，類似于釀酒酵母極性體[16]。由上可見(jiàn)Bem1和Bud5兩基因同極性生長(zhǎng)密切相關(guān)，鑒于熒光定位顯示煙曲霉中Bem46基因同極性生長(zhǎng)有關(guān)，我們推測(cè)該Bem46基因可能影響極性生長(zhǎng)相關(guān)基因Bem1和Bud5的表達(dá)情況。據(jù)此，我們通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR觀察了煙曲霉Bem46基因敲除后對(duì)此兩基因表達(dá)的影響。我們的研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉Bem46基因敲除株中，Bem1和Bud5兩種基因表達(dá)量均有下調(diào)。因而我們認(rèn)為Bem46基因在煙曲霉中可以影響B(tài)em1及Bud5基因的表達(dá)，但具體的作用機(jī)制尚不清楚，可能Bem46基因通過(guò)參與Bem1及Bud5所在的極性生長(zhǎng)傳導(dǎo)通路從而影響了該兩基因。

總之，我們通過(guò)構(gòu)建煙曲霉Bem46基因熒光定位株，初步了解了該基因在煙曲霉極性生長(zhǎng)中定位情況，發(fā)現(xiàn)其可能同煙曲霉的極性生長(zhǎng)相關(guān)，并對(duì)極性生長(zhǎng)相關(guān)基因Bem1及Bud5的表達(dá)有影響，該結(jié)果提示進(jìn)一步深入研究Bem46基因以何種方式參與極性生長(zhǎng)相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，完成對(duì)極性生長(zhǎng)相關(guān)基因的調(diào)控。

利益沖突：無(wú)