李汶霖，李淑凝，沈海娥，章曾思琦，田喜鳳，王 洋

藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia，簡稱賈第蟲)，是一種世界性分布的條件致病性原蟲，屬于雙滴蟲目，六鞭毛科，賈第蟲屬，具有2個細胞核，是一種非常原始的單細胞真核生物,具有較大的研究價值[1]。賈第蟲通過具有抵抗力但無運動能力的包囊經(jīng)糞口傳播感染宿主，在小腸轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞\動能力的滋養(yǎng)體，滋養(yǎng)體依靠鞭毛在腸腔中游動，依靠腹吸盤吸附在腸粘膜上并不斷增殖，損傷腸絨毛，影響宿主的消化吸收，引起藍氏賈第鞭毛蟲病(Giardiasis，簡稱賈第蟲病)，主要癥狀為腹瀉[2]。賈第蟲病有較強的傳染性以及較高的發(fā)病率，在醫(yī)療衛(wèi)生條件差的國家和地區(qū)常呈暴發(fā)性流行，常引起旅行者產(chǎn)生腹瀉，被稱為“旅行者病”[3]。在我國南方患病率更高，近年相關(guān)報道南方人群賈第蟲總體感染率為1.20%，慢性腹瀉和飼養(yǎng)寵物是藍氏賈第鞭毛蟲感染的危險因素，由于衛(wèi)生水平的提高，我國賈第蟲感染率總體上處于較低水平[4]。賈第蟲具有極其復(fù)雜的細胞骨架系統(tǒng)，是與致病相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)——鞭毛和腹吸盤的主要蛋白成分，因而賈第蟲復(fù)雜的細胞骨架系統(tǒng)與賈第蟲的致病性相聯(lián)系[5-8]。

賈第素是賈第蟲一種特有的骨架蛋白[9-10]，分為α、β、γ、δ 4大類，其中α賈第素家族是其中數(shù)量最多的一族，有21個成員，按照發(fā)現(xiàn)時間命名，從α-1到α-19(α-7 細分為 3 種變體)[11-13]。目前認為，目前α賈第素是高等真核生物膜聯(lián)蛋白Annexin的類似物[14]，膜聯(lián)蛋白是一種保守的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，該蛋白廣泛存在于各種動植物中，被認為有可能參與細胞骨架運動、細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞繁殖與分裂、膜的融合等多種的細胞生理活動。但是大多數(shù)真核生物僅有一種或幾種膜聯(lián)蛋白家族成員，作為一種低等真核生物，賈第蟲擁有如此眾多膜聯(lián)蛋白類似物成員，這些成員在具體功能和發(fā)揮作用的方式上有何不同，至今尚無解釋。明確未知功能蛋白的亞細胞定位，對于推測理解其功能具有很大的意義。α-19賈第素是α賈第素家族研究較少的一個成員[15]，是該家族中為數(shù)不多未被定位的賈第素，國內(nèi)也沒有相關(guān)的研究。本研究擬從α-19賈第素蛋白的克隆表達入手，制備α-19賈第素特異性單克隆抗體并鑒定其亞細胞定位，從而為α-19賈第素相關(guān)功能以及疾病防治的研究提供材料。

1 材料與方法

1.1材料 C2株第賈第蟲、小鼠骨髓瘤細胞系(Sp2/0)、原核表達質(zhì)粒pET-28α(+)、大腸桿菌E.coliRosetta(DE3)菌株均由實驗室保存；大腸桿菌E.coliTOP10菌株購自昂羽上海生物技術(shù)有限公司；兔抗His-Tag多克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體、Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG抗體、Ni—NTA預(yù)裝柱和Protein G Sefinose預(yù)裝柱購自上海生工生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、XhoⅠ購自寶生物工程(大連)公司；2×Pfu PCR MasterMix、血液基因組DNA提取試劑盒、DNA片段凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、DAB顯色試劑盒購自天根生物科技公司； PAGE凝膠快速制備試劑盒購自雅酶生物公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、融合用PEG1450、HT和HAT培養(yǎng)基購自Sigma-Aldrich公司；引物合成及測序工作、抗原肽合成和KLH偶連工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2儀器 奧林巴斯CKX31倒置顯微鏡、上海智誠ZHJH—C1112B超凈工作臺、Sigma 3K30臺式低溫高速離心機、Heraeus X1R臺式低溫高速離心機、HH—W恒溫水浴箱、SHELLAB2406 CO2孵箱、9512AA2Y低溫循環(huán)水浴、伯樂iMARK酶標儀、Omega Lum W 化學發(fā)光多色熒光成像系統(tǒng)、Scandrop2000超微量核酸蛋白測定儀、伯樂T100PCR擴增儀、DYY一6C穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、雅馬拓SQ510C高壓蒸汽滅菌鍋、ZHWY一100D氣浴振蕩搖床、Leica SP8 STED 3×激光掃描共聚焦顯微鏡。

1.3 方 法

1.3.1α-19賈第素的原核表達[16-17]根據(jù)GenBank上WB株賈第蟲α-19賈第素基因序列(XM_001704791.1)設(shè)計上游引物(5′-CATGCCATGGCCATGGGTTGTGCCGCATCAACTC-3′) 和下游引物(5′-CCGCTCGAGGTCGCCGCGGGGAGTC-3′)，上、下游引物分別含有NcoⅠ、XhoⅠ酶切位點(為下劃線部分)。提取賈第蟲全基因組DNA，以其為模板， PCR擴增目的序列，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，重復(fù)30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。膠回收試劑盒回收目的片段PCR產(chǎn)物。膠回收產(chǎn)物經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后與同樣酶切的 pET-28α(+)載體按摩爾比 4∶1混合，16 ℃連接反應(yīng) 4 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTOP10感受態(tài)細胞，通過卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，陽性克隆提質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果正確的克隆送生物公司測序。

1.3.2α-19賈第索重組蛋白的誘導表達和鑒定 將測序鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達菌株E.coliRosetta(DE3)，涂于卡那霉素和氯霉素的雙抗平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單菌落轉(zhuǎn)接于含雙抗的液體LB培養(yǎng)基中。37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，再將所得菌株進行檢測，序列正確者進行接下來的操作，按1%的接種量轉(zhuǎn)移到3管3 mL新鮮雙抗LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃震蕩培養(yǎng)，當OD600值達到0.6時3管分別加入終濃度0.1 mmol/L、0.5 mmol/L和1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于30 ℃誘導表達5 h。12 000 r/min離心1 min收集菌液，用無菌水重懸，按比例加入4×SDS 上樣緩沖液煮沸裂解獲得全菌體蛋白，以未經(jīng)誘導的轉(zhuǎn)化菌為對照，Western blot和SDS-PAGE雙重鑒定目的蛋白表達結(jié)果是否正確。Western blot以兔抗 His-Tag兔源多克隆抗體(1∶1 000)為一抗， 以HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000)為二抗，經(jīng)DAB顯色觀察結(jié)果。

1.3.3α-19賈第素抗原肽的設(shè)計[18]根據(jù)GenBank提供的α-19賈第素的蛋白序列，通過Clustal_X軟件將α-19賈第素的氨基酸序列與其他α賈第素家族成員進行同源性比較，選擇同源性最低的區(qū)段，采用DNASTAR、SYFPEITHI，Bcepred等生物學軟件和網(wǎng)站分析所選肽段的抗原活性， 應(yīng)用BLAST比對分析抗原肽與其他賈第蟲蛋白的同源性。設(shè)計好的抗原肽由生工生物公司合成并與KLH偶聯(lián)。

1.3.4小鼠免疫 取3只7周齡左右健康雌性BALB/c小鼠，首次免疫時將合成抗原肽與KLH偶聯(lián)，用等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，以50 μg/只劑量對小鼠進行多點皮下注射。初此免疫后每間隔2周免疫1次，共免疫5次。在第5次免疫后1周后，斷尾采血，收集少量血清進行效價測定。然后對血清效價最高的免疫小鼠進行加強免疫。在進行加強免疫3 d后，取脾臟細胞準備融合[19-21]。

1.3.5細胞融合及雜交瘤細胞株的篩選 以PEG1450為融合劑，將小鼠脾細胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞(Sp2/0)按照10∶1比例進行細胞融合。以BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞，分裝于96孔板，在HAT選擇培養(yǎng)基中于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。5 d后更換新鮮HAT營養(yǎng)液，8 d后用HT培養(yǎng)基更換HAT培養(yǎng)基。待細胞覆蓋孔底面積約1/4～1/3時，用合成抗原肽0.5 μg包被酶標版，間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清中抗體效價，陽性判斷標準(OD陽/OD陰>2.5∶1),以Sp2/0的培養(yǎng)上清與正常BALB/c小鼠的血清作為陰性對照。對檢出的陽性孔進行2～3輪有限稀釋亞克隆培養(yǎng)，直至所有克隆化細胞孔檢測陽性率達100%時，即可確定獲得分泌特異性單抗的雜交瘤細胞株，及時擴大培養(yǎng)并凍存。

1.3.6含mAb腹水的制備及純化 選取效價最高的3株陽性雜交瘤細胞，用不含血清的培養(yǎng)液混勻，腹腔注射BALB/c小鼠，每只5×105個。接種雜交瘤細胞后約10～15 d，抽取腹水，用Protein G預(yù)裝柱通過親和層析純化抗體。

1.3.7mAb結(jié)合力和特異性的驗證 將α-19賈第素原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliRosetta(DE3)，經(jīng)最適濃度IPTG誘導表達后全菌體裂解物上樣，對照組為未誘導的轉(zhuǎn)化菌裂解物，通過 Western blot驗證所制備抗體的結(jié)合能力；利用賈第蟲滋養(yǎng)體全裂解物通過Western blot 驗證具有較好結(jié)合力的抗體的抗原特異性。

1.3.8免疫熒光鑒定α-19賈第素的亞細胞定位[21-22]將對數(shù)生長期的賈第蟲滋養(yǎng)體接種于放有無菌蓋玻片和改良TYI-S-33培養(yǎng)基的12孔板中，37 ℃培養(yǎng)4 h，取出蓋玻片，室溫條件下用4% 的多聚甲醛固定，PBS洗滌后再滴加 0.5% 的聚乙二醇單辛基苯基醚(Triton X 100)室溫透化，5% BSA溶液室溫封閉1 h。加入1∶200稀釋的小鼠抗α-19賈第素單克隆抗體，置于濕盒中4 ℃過夜孵育。次日用PBS洗滌后放入1∶2 000稀釋的Alexa Fluor 488標記山羊抗鼠IgG中，室溫避光孵育1 h。DAPI封片劑封片后共聚焦顯微鏡觀察熒光定位。

2 結(jié) 果

2.1α-19賈第素基因的克隆和原核表達載體構(gòu)建

以賈第蟲基因組DNA為模版克隆a-19賈第素編碼區(qū)，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約1 260 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小相符(圖1)。將α-19賈第素雙酶切后連入原核表達質(zhì)粒pET-28α(+)，提取質(zhì)粒NcoI和XhoI酶切鑒定后電泳結(jié)果顯示可見約1 260 bp的α-19賈第素目的片段、5 300 bp的載體pET28α(+)2條電泳條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2α-19賈第素的誘導表達和鑒定 轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的菌液加入終濃度0.1、0.5、1.0 mmol/L 的IPTG 30 ℃誘導5 h后取少量菌液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示誘導組在約49 kD處出現(xiàn)目的條帶，在0.5 mmol/L的IPTG誘導下，重組蛋白表達最明顯，而未加IPTG 誘導的pET28α(+)-α-19轉(zhuǎn)化菌則無此條帶(圖3),Western blot證實該條帶為α-19-His tag重組蛋白(圖4)。

1為未誘導轉(zhuǎn)化菌；2、3、4分別為IPTG為1 mmol/L、0.5 mmol/L、0.1 mmol/L誘導的轉(zhuǎn)化菌；M為蛋白分子量標準

1、2、3分別為IPTG為1 mmol/L、0.5 mmol/L、0.1 mmol/L誘導的轉(zhuǎn)化菌；4為未誘導轉(zhuǎn)化菌；M為蛋白分子量標準

2.3α-19賈第素mAb的制備 采用多種生物信息學軟件和網(wǎng)站對α-19賈第素蛋白序列進行分析，最終選定一段18aa的短肽(364-381aa)作為抗原肽，序列為IDRPKDPAAGPEAENGPA。將該段合成抗原肽與KLH偶聯(lián)后，免疫BALB/c小鼠，4 次免疫結(jié)束后，間接 ELISA 法檢測小鼠血清抗體效價最高達1∶64 000，滿足細胞融合條件。細胞融合后經(jīng)多輪亞克隆篩選獲得3株產(chǎn)生抗體效價比較高的單克隆細胞株α-19-3-7-3-5、α-19-3-14-3-2、α-19-3-17-1-1。將3株雜交瘤細胞分布接種小鼠腹腔獲得腹水，親和層析純化獲得3種單克隆抗體用于下一步結(jié)合力和特異性驗證實驗。

2.4α-19 mAb結(jié)合性和特異性鑒定 采用原核表達的α-19賈第素蛋白驗證mAb的結(jié)合能力，賈第蟲滋養(yǎng)體全裂解物驗證α-19 mAb的特異性。結(jié)合性實驗結(jié)果顯示3-7-3-5、3-14-3-2、3-17-1-1雜交瘤產(chǎn)生的抗體均能和α-19賈第素重組蛋白結(jié)合；特異性實驗顯示3-7-3-5雜交瘤產(chǎn)生的抗體特異性良好，與賈第蟲滋養(yǎng)體裂解物反應(yīng)僅出現(xiàn)α-19賈第素單一條帶，3-14-3-2雜交瘤產(chǎn)生的抗體出現(xiàn)非特異條帶，3-17-1-1雜交瘤產(chǎn)生的抗體未能與賈第蟲裂解物中的天然α-19賈第素蛋白發(fā)生反應(yīng)(如圖5、圖6)，故選擇3-7-3-5用于定位研究。

M為蛋白分子量標準； 1、2為3-14-3-2及其對照組；3、4為3-7-3-5及其對照組；5、6為3-17-1-1及其對照組；1、3、5為0.5 mmol/L IPTG誘導5h的轉(zhuǎn)化菌；2、4、6為未經(jīng)誘導的轉(zhuǎn)化菌

M為蛋白分子量標準； 1、2、3為賈第蟲滋養(yǎng)體裂解物；1為α-19-3-7-3-5；2為α-19-3-14-3-2；3為α-19-3-17-1-1

2.5α-19賈第素在賈第蟲滋養(yǎng)體的亞細胞定位 賈第蟲滋養(yǎng)體爬片用α-19mAb 3-7-3-5的一抗和Alexa Fluor 488標記山羊抗鼠的二抗處理后，在共聚焦顯微鏡下觀察賈第素α-19賈第素的分布。結(jié)果顯示，綠色熒光集中分布于滋養(yǎng)體的一對腹鞭毛上(圖7)。

1為綠色熒光顯示α-19賈第素定位；2為DAPI染色；3為2和3疊加；4為光鏡下視野；5為熒光與光鏡疊加

3 討 論

本研究首先對α-19賈第素進行了原核表達，但表達出來的重組α-19賈第素蛋白并未直接用作免疫原去制備單克隆抗體，而是用于α-19 mAb體外結(jié)合能力的驗證。為了保證產(chǎn)生的抗體能夠用于免疫熒光實驗，我們通過多種生物信息學網(wǎng)站和軟件對α-19賈第素蛋白的天然抗原決定簇部位以及空間構(gòu)象進行分析，選出了幾段備選肽段。但α賈第素家族成員之間具有很高的同源性，為了避免交叉反應(yīng)，我們又將備選肽段在各賈第素家族成員間進行序列比對，最后確定出了這個最理想的抗原肽用于mAb的制備。相對于多克隆抗體，單克隆抗體在諸多方面有著明顯的優(yōu)勢，其特異性高、不易產(chǎn)生交叉反應(yīng)或假陽性反應(yīng)，背景染色較淺，制備成功后可獲得恒定的再生源，是進行定位研究的首選，但其制作過程繁瑣、制備技術(shù)要求高、穩(wěn)定性差、成本高、周期長也增加了單克隆制備的難度。本實驗主要應(yīng)用免疫熒光技術(shù)進行亞細胞定位，所需抗體特異度較高，抗體用量較多，要求定位結(jié)果的一致性和標準化，而單克隆抗體正是最優(yōu)的選擇[19-22]。

賈第蟲的骨架蛋白中的α-賈第素家族是一類含有酸性磷脂的鈣依賴性膜結(jié)合蛋白，共有21個成員，其在蛋白表達水平、亞細胞定位以及生物學功能上有很大差異[23-24]，某些α賈第素如α-4、α-8、α-11等因表達過量可以影響細胞的分裂增殖分化而導致細胞死亡[25-26]，說明α賈第素家族成員都具有至關(guān)重要的生物學功能，但是各種成員間的功能又不完全相同，明確每一種賈第素的具體功能將是一個非常有有趣的工作，對于全面理解膜聯(lián)蛋白成員的功能具有重要意義。隨著α-19賈第素定位的確立，α-賈第素家族21種賈第素定位基本被闡述清楚，其中腹鞭毛定位的賈第素種類最多，包括α-5、α-9、α-10、α-17以及我們鑒定的α-19賈第素[27]。鞭毛是賈第蟲滋養(yǎng)體最重要的運動器官，參與蟲體的吸附和脫離小腸粘膜表面的過程，甚至還被證明參與蟲體的攝食[28]。為何如此眾多的α賈第素成員定位于腹鞭毛，而其它鞭毛定位的α賈第素成員相對較少？這些定位相同的賈第素在功能上有何差異？目前這些問題的答案均無相關(guān)報道，有待于進一步研究。

在本研究中，我們成功制備了針對α-19賈第素的特異性單克隆抗體，并利用免疫熒光技術(shù)證實α-19賈第素定位于一對腹鞭毛，這些結(jié)果為該賈第素的功能研究提供了必要的實驗材料和支持。

利益沖突：無