邵勝利，楊熹

0 引言

全球癌癥調(diào)查報(bào)告指出每年約有180萬新發(fā)結(jié)直腸癌病例和86萬結(jié)直腸腫瘤特異性死亡病例，分別占總發(fā)病例數(shù)和總死亡例數(shù)的10%和9%[1]。腫瘤進(jìn)展是腫瘤特異性死亡的主要原因之一，多種機(jī)制參與了腫瘤進(jìn)展，包括增長(zhǎng)信號(hào)的自給自足、對(duì)抑制生長(zhǎng)信號(hào)不敏感、規(guī)避凋亡、無限的自我復(fù)制能力、持續(xù)的血管生成及組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移及炎性反應(yīng)[2]。肝細(xì)胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α,HNF4A）又稱NR2A1是配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的核受體超家族成員之一，其在肝臟、腎、胰腺、胃腸道中表達(dá)。Pearson等研究發(fā)現(xiàn)HNF4A突變新生兒與未突變的新生兒相比，突變者與新生兒出生體重及新生兒低血糖密切相關(guān)[3]，Chen等研究表明HNF4A調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化并且是小鼠腸道干細(xì)胞更新所必須的[4]。HNF4A是主要的肝特異性基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，并且在多種腫瘤中具有抑癌特性，HNF4A參與了肝癌的發(fā)生與發(fā)展，HCV感染后miR-122通過STAT3介導(dǎo)HNF4A的轉(zhuǎn)錄抑制促進(jìn)了肝炎向肝纖維化及肝癌的轉(zhuǎn)變[5]，HNF4A與WNT/β-catenin之間的雙向負(fù)反饋促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）[6]，也有研究表明HNF4A參與了小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤、白血病、食管癌等惡性腫瘤的進(jìn)展[7-9]。直到最近HNF4A在腸道中的作用才開始被研究，HNF4A不但維持了正常腸道上皮的完整性也是病理?xiàng)l件下失調(diào)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[8]，但是HNF4A在結(jié)直腸癌中的作用仍存在爭(zhēng)議，有研究表明HNF4A缺乏的小鼠與對(duì)照小鼠比較腸道息肉與腫瘤的發(fā)生率顯著減少，并且HNF4A保護(hù)了腫瘤細(xì)胞免受活性氧的損害[10]，相反Saandi等研究指出CDX2通過抑制HNF4A功能，促進(jìn)了結(jié)腸惡性腫瘤的進(jìn)展[11]。但HNF4A如何調(diào)節(jié)結(jié)直腸腫瘤進(jìn)展的機(jī)制尚未被解釋，本研究基于既往報(bào)道HND4A在結(jié)直腸腫瘤中的爭(zhēng)議及不足擬探究HNF4A在結(jié)直腸腫瘤進(jìn)展中的具體機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)

結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系SW480、HT-29、SW620及LoVo購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，其中SW480與SW620培養(yǎng)于L-15培養(yǎng)基、HT-29培養(yǎng)于MoCoy’s 5a培養(yǎng)基、LoVo培養(yǎng)于F-12K培養(yǎng)基，所有培養(yǎng)基加入10%胎牛血清及1%的青霉素鏈霉素雙抗、所有細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、含5%CO2的溫箱中。

1.2 試劑

L-15、McCoy’s 5a、F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%的胰蛋白酶、雙抗（×100）購自武漢博士德生物有限公司；HNF4A、CD133、CD44、EpCAM、MMP2、MMP9、GADPH一抗及辣根過氧化物酶二抗購自美國Cell Signaling Technology公司；TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司，Superscript反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR GreenⅠqPCR試劑盒購自北京Transgen Biotech公司。細(xì)胞培養(yǎng)皿、移液槍頭、六孔板等耗材購自武漢啟動(dòng)子生物有限公司。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染

HNF4A質(zhì)粒、shHNF4A（短發(fā)夾RNA）或空載體由本實(shí)驗(yàn)室既往構(gòu)建并保存[12]；通過HNF4A高表達(dá)、敲降質(zhì)粒或空載體與慢病毒包裝試劑（磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒）共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞上清液，并通過0.45 μm過濾器過濾，將收集的病毒感染預(yù)先鋪板的細(xì)胞，72 h后加入嘌呤霉素篩選，挑選能穩(wěn)定增殖的單克隆進(jìn)行Western blot和qPCR檢測(cè)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）

將培養(yǎng)細(xì)胞的六孔板使用PBS清洗兩次，按照TRIzol（美國Invitrogen公司）試劑提取RNA操作步驟從細(xì)胞中分離總RNA。使用Superscript反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒制備cDNA，使用SYBR GreenⅠqPCR試劑盒在ABI 7300系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）。將基因表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH表達(dá)水平。HNF4A引物：F:5’-CACGGGCAAACACTACGGT-3’，R:5’-TTGACCTTCGAGTGCTGATCC-3’；GAPDH引物：F:5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，R:5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

藥物篩選成功轉(zhuǎn)染的結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系，取約1×103個(gè)細(xì)胞接種于軟瓊脂或平板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后取出，棄上清液、PBS清洗2遍，純甲醇固定15 min，結(jié)晶紫染色拍照。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞系經(jīng)胰酶消化后取約1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，分別于0、24、48、72和96 h后加入CCK-8反應(yīng)底物，經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處的吸光度值。

1.7 遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)

使用Transwell聚碳酸酯膜和Boyden室測(cè)定法測(cè)定HNF4A對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞系的遷移和侵襲能力的影響。將200 μl無血清培養(yǎng)基中的1×105個(gè)細(xì)胞加入到小室的上部。下腔室填充有10%FBS的相應(yīng)培養(yǎng)基，并在37℃、5%CO2下孵育48 h，在室溫下使用4%多聚甲醛將Transwell膜固定30 min，PBS洗滌3次，Giemsa染色30 min，用棉簽從插入物中除去未遷移的細(xì)胞。使用顯微鏡計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞并定量。對(duì)于侵襲測(cè)定，在接種細(xì)胞之前，用Matrigel包被聚碳酸酯膜，之后與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)步驟相同。

1.8 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)蛋白酶抑制劑的NP-40冰上裂解30 min，收集蛋白裂解液，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，樣品于100℃水浴15 min，在SDS-PAGE凝膠上分離大約15 μg蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，之后根據(jù)蛋白Marker剪膜，根據(jù)檢測(cè)蛋白分子量，分別孵育一抗（1:1000），4℃過夜，以TBST緩沖液漂洗3次后，在室溫下孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1:5000）2 h，再次TBST洗膜后曝光顯影。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究均設(shè)計(jì)了對(duì)照實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)最少重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）。組間和組間比較分別用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LoVo、SW620高表達(dá)HNF4A及HT-29、SW480敲降HNF4A的穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建

通過Western blot檢測(cè)了結(jié)直腸癌細(xì)胞系中HNF4A基礎(chǔ)表達(dá)情況，HNF4A在LoVo及SW620中表達(dá)較低，在HT-29及SW480中表達(dá)較高，見圖1A。進(jìn)一步構(gòu)建了HNF4A高表達(dá)的LoVo及SW620細(xì)胞系，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示構(gòu)建的目的細(xì)胞系中HNF4A表達(dá)明顯升高，見圖1B，同樣的結(jié)果在qPCR中也得到了證實(shí)，見圖1D；在HT-29及SW480中轉(zhuǎn)染HNF4A敲降的慢病毒后Western blot和qPCR結(jié)果顯示HNF4A表達(dá)明顯降低，見圖1C、1E。

2.2 HNF4A抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的克隆、增殖能力及降低干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

圖1 HNF4A高表達(dá)的LoVo、SW620細(xì)胞系及HNF4A敲降的HT-29、SW480細(xì)胞系的構(gòu)建Figure 1 Construction of LoVo,SW620 cell lines with high expression of HNF4A and HT-29,SW480 cell lines with knockdown of HNF4A

圖2 HNF4A抑制結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的克隆、增殖能力及降低干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)Figure 2 HNF4A inhibited cloning and proliferation of colorectal cancer cells and decreased expression of stem cell markers

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，平板中轉(zhuǎn)染HNF4A的細(xì)胞相對(duì)轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比克隆形成數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PLoVo=0.002,Psw620=0.007）；見圖2A～B；同樣在軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)中得到了相同的結(jié)論（PLoVo=0.009;Psw620=0.001），見圖2C～D。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HNF4A組與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖能力降低，見圖2E～F。我們進(jìn)一步通過Western blot驗(yàn)證了結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，結(jié)果顯示，HNF4A過表達(dá)組與空白轉(zhuǎn)染組相比干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD44及EpCAM表達(dá)降低，見圖2G。

2.3 敲降HNF4A促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的克隆、增殖及增強(qiáng)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

將慢病毒轉(zhuǎn)染的HT-29和SW480細(xì)胞行軟瓊脂及平板克隆實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)和Western blot法檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物。結(jié)果顯示，平板及軟瓊脂中轉(zhuǎn)染shHNF4A的細(xì)胞相對(duì)轉(zhuǎn)染sh-control的細(xì)胞相比克隆形成數(shù)目明顯增多（PHT-29＜0.001;Psw480＜0.001）見圖3A～B與（PHT-29=0.015;Psw480＜0.001）圖3C～D；CCK-8結(jié)果顯示敲降HNF4A的細(xì)胞系增殖能力升高，見圖3E～F；Western blot結(jié)果顯示，HNF4A敲降組干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD44及EpCAM表達(dá)升高，見圖3G。

2.4 高表達(dá)HNF4A抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移侵襲

圖3 敲降HNF4A促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的克隆、增殖能力及增強(qiáng)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)Figure 3 Knockdown of HNF4A promoted cloning and proliferation of colorectal cancer cells and enhanced expression of stem cell markers

圖4 HNF4A抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移侵襲能力Figure 4 HNF4A inhibited migration and invasion of colorectal cancer cells

對(duì)過表達(dá)HNF4A的LoVo及SW620細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞行Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移侵襲能力，結(jié)果顯示：與對(duì)照相比，高表達(dá)HNF4A的LoVo細(xì)胞遷移能力降低（PLoVo=0.001,Psw620=0.032），見圖4A～B；在侵襲實(shí)驗(yàn)中觀察到了同樣的結(jié)論（PLoVo=0.004,Psw620=0.024），見圖4C～D。

2.5 敲降HNF4A增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移侵襲

對(duì)敲降HNF4A的HT-29及SW480細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移侵襲能力的改變，結(jié)果顯示：與對(duì)照相比，敲降HNF4A的HT-29細(xì)胞遷移能力升高（PHT-29=0.008,Psw480=0.007），見圖5A～B；在侵襲實(shí)驗(yàn)中觀察到了同樣的結(jié)論（PHT-29=0.004,Psw480=0.020），見圖5C～D。

2.6 HNF4A調(diào)節(jié)MMP2和MMP9的表達(dá)

R2基因分析平臺(tái)分析結(jié)果顯示：HNF4A水平與MMP2 及MMP9 存在密切相關(guān)性（均P＜0.001），見圖6A～B。為進(jìn)一步驗(yàn)證該相關(guān)性，在HNF4A高表達(dá)和HNF4A敲降的細(xì)胞中進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，過表達(dá)HNF4A抑制了MMP2和MMP9的表達(dá)，敲降HNF4A促進(jìn)了MMP2與MMP9的表達(dá)，見圖6C～D。

3 討論

結(jié)直腸癌依賴于復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)持續(xù)的生長(zhǎng)，侵襲和轉(zhuǎn)移。HNF4A是一種核受體，可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和代謝中的多種過程。HNF4A在多種腫瘤中的失調(diào)使其成為腫瘤有希望的治療靶標(biāo)[13]。目前有多種研究已經(jīng)建立了HNF4A與大腸癌之間的聯(lián)系，Kriegsmann通過對(duì)1021例非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)本包括472例肺腺癌和82例結(jié)直腸癌的肺轉(zhuǎn)移進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示HNF4A在原發(fā)性肺腺癌中比結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移灶中明顯升高（19%:0%），提出HNF4A可以作為結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移與肺腺癌的鑒別診斷指標(biāo)[14]，這項(xiàng)研究同樣提示了HNF4A在轉(zhuǎn)移灶中的低表達(dá)。除此之外，還有研究證明HNF4A在腫瘤組織中明顯上調(diào)并且可以靶向調(diào)節(jié)參與調(diào)節(jié)活性氧的氧化還原酶相關(guān)基因中的新功能進(jìn)而使癌細(xì)胞免受氧化還原的傷害[10]。正是其作為抑癌基因或原癌基因的作用的爭(zhēng)議削弱了其在癌癥治療中的潛在應(yīng)用，這也是目前研究尚待解決的問題。

圖5 敲降HNF4A增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移侵襲能力Figure 5 Knockdown of HNF4A enhanced migration and invasion of colorectal cancer cells

圖6 HNF4A調(diào)節(jié)MMP2與MMP9的表達(dá)Figure 6 HNF4A regulated expression of MMP2 and MMP9

本研究證明了HNF4A在大腸癌中充當(dāng)抑癌基因來抑制腫瘤的進(jìn)展，證明了HNF4A抑制了結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的克隆、增殖及遷移侵襲能力，并進(jìn)一步探討了HNF4A通過下調(diào)MMP2及MMP9的表達(dá)調(diào)節(jié)結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，在HNF4A敲降的細(xì)胞中得出了同樣的結(jié)論。

增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞干性、較強(qiáng)的遷移與侵襲能力是腫瘤局部進(jìn)展與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，所以干預(yù)上述過程有可能成為腫瘤的治療策略，本研究表明HNF4A調(diào)節(jié)了結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的干性進(jìn)而增強(qiáng)了細(xì)胞的克隆與增殖能力，并影響了遷移和侵襲能力，提出了HNF4A調(diào)節(jié)結(jié)直腸腫瘤進(jìn)展的新機(jī)制，為結(jié)直腸腫瘤治療提供新的可能靶點(diǎn)。