劉群偉，邵詠妮，陳小婉，蔣林華

上海理工大學(xué)上海市現(xiàn)代光學(xué)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光電信息與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院，上海 200093

引 言

重金屬是自然界中危害較重的一類污染物，一般指密度≥4 g·cm-3的金屬。 絕大多數(shù)的重金屬具有致癌性，會(huì)破壞人體器官，對人體造成極大的危害。 在重金屬中，鉛(Pb)是三種最常見的重金屬之一。 重金屬危害的持久性、不易降解以及隨著食物鏈的富集危害性逐漸增強(qiáng)的特點(diǎn)，使得我們不得不重視重金屬污染的問題。 藻類植物作為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，最先受到重金屬的影響。 有研究表明Pb對氮和硫具有很高的親和力，Pb離子可以替代微藻細(xì)胞內(nèi)化合物分子中的其他金屬離子。 因此，Pb可能會(huì)改變代謝過程中的酶或其他成分，從而最終影響細(xì)胞的分子組成。 另外，Pb可以置換金屬離子，如光合機(jī)構(gòu)中的Mg2+，F(xiàn)e2+，Ca2+或與光合作用中的酶相互作用，導(dǎo)致該過程的抑制，最終致使初級生產(chǎn)力下降，間接改變細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)成分。

研究鉛對藻類的影響，為風(fēng)險(xiǎn)評估、水質(zhì)管理、金屬生物修復(fù)和生物燃料生產(chǎn)提供了重要的數(shù)據(jù)。 但是，大多數(shù)用于這些評估的方法都是耗時(shí)和破壞性的，而且需要相對較多的細(xì)胞。 此外，評估還涉及繁瑣的操作，如細(xì)胞的采集和破壞以及生物化學(xué)提取，這可能會(huì)帶來更多隨機(jī)和系統(tǒng)的誤差。 光譜技術(shù)在微藻細(xì)胞方面的應(yīng)用彌補(bǔ)了以上的不足，其中拉曼、近紅外技術(shù)等在該領(lǐng)域已經(jīng)取得了不少的成果。 如，Wu等[1]通過單細(xì)胞激光拉曼光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)對微藻體內(nèi)油脂的直接定量分析。 Collins等[2]采用共焦拉曼顯微鏡技術(shù)觀察雨生紅球藻在不同生長狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)葉綠素、類胡蘿卜素以及蝦青素的組成變化。 此外，Brown等[3]采用近紅外反射光譜技術(shù)對微藻體內(nèi)的脂質(zhì)進(jìn)行快速檢測。 Wagner等[4]利用中紅外光譜技術(shù)對微藻體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及碳水化合物的含量進(jìn)行了定量檢測。 盡管拉曼、紅外光譜技術(shù)在微藻物質(zhì)成分研究方面取得了一定的進(jìn)展，但仍然存在一些問題，如拉曼信號靈敏度低，易受到熒光干擾[5]； 而近紅外光譜的信噪比低，測量靈敏度較低[6]。

在基于光譜技術(shù)的微藻成分檢測方面，拉曼技術(shù)是通過譜線的強(qiáng)度反映分子內(nèi)部的振動(dòng)情況，主要用于鑒定分子中存在的官能團(tuán)。 太赫茲技術(shù)則可以通過檢測分子間和骨架間的振動(dòng)直接反映分子的結(jié)構(gòu)[7]。 與傳統(tǒng)光譜檢測相比，太赫茲具有較高的分辨率，更為重要的是許多生物大分子的振動(dòng)頻率處在太赫茲波段，諸多研究已經(jīng)實(shí)現(xiàn)通過太赫茲檢測多肽、DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子[7]。 傅里葉變換紅外光譜中引入原子的振動(dòng)和分子的化學(xué)鍵，產(chǎn)生包含不同大分子特征帶的吸收譜。 每個(gè)分子都有自己的光譜特征對波段位置、寬度和強(qiáng)度的分析提供了有關(guān)細(xì)胞組成和生理狀態(tài)的信息。 然而，該技術(shù)較少應(yīng)用于包括Pb在內(nèi)的重金屬對藻類物質(zhì)成分的影響研究，并且在使用有限的單變量比較的光譜分析方面進(jìn)行的研究很少[8]。 因此太赫茲、遠(yuǎn)紅外光譜技術(shù)在研究微藻體內(nèi)大分子物質(zhì)變化上存在一定的優(yōu)勢。

本研究中我們采用太赫茲、遠(yuǎn)紅外光譜技術(shù)對Pb脅迫下斜生柵藻體內(nèi)淀粉、類胡蘿卜素含量變化進(jìn)行研究。 采用傅里葉紅外光譜儀采集微藻的光譜信號，同時(shí)結(jié)合主成分分析(PCA)方法，對Pb脅迫不同時(shí)間點(diǎn)的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。 同時(shí)比較了以重金屬濃度與時(shí)間為變量的條件下，斜生柵藻細(xì)胞內(nèi)淀粉、類胡蘿卜素含量變化趨勢。 探究了傅里葉光譜技術(shù)的微藻細(xì)胞內(nèi)生物大分子檢測的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

儀器與儀器設(shè)備： 紫外分光光度計(jì)(uv1902pc)、真空傅里葉變換紅外光譜儀(BRUKER Vertex 70v/80v)、高速冷凍離心機(jī)(GL-20G-Ⅱ)。 斜生柵藻(FACHB-12)購于中科院武漢水生生物研究所、BG11培養(yǎng)基、調(diào)節(jié)pH至7.4的去離子水1 L、標(biāo)準(zhǔn)硝酸鉛溶液、電熱鼓風(fēng)干燥箱(BGZ-30)。

1.2 方法

1.2.1 藻的培養(yǎng)

使用BG11培養(yǎng)基將斜生柵藻以1∶3的比例擴(kuò)大培養(yǎng)。 無菌條件下，在洗凈且經(jīng)壓力蒸汽滅菌器(XFS-280MB)高溫高壓滅菌的2 000 mL的三角錐形瓶中，按照3.4 g·L-1的比例加入BG11培養(yǎng)基，接入斜生柵藻藻種，搖勻，置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中光照強(qiáng)度在4 000 Lux，光周期為12L∶12D。 每日固定時(shí)間點(diǎn)搖勻錐形瓶4次，通氣培養(yǎng), CO2濃度為2%, 培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，pH值為7.0。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

取處于生長穩(wěn)定期的斜生柵藻，使用血球計(jì)數(shù)板(北京索萊寶科技有限公司)獲取微藻生長穩(wěn)定期的生長狀態(tài)，初始藻密度為3.6×106個(gè)·mL-1。 實(shí)驗(yàn)使用8個(gè)洗凈且經(jīng)壓力蒸汽滅菌器(XFS-280MB)高溫高壓滅菌的2 000 mL的三角錐形瓶，設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)組A，B和C，一個(gè)對照組CK，另外每組設(shè)置兩個(gè)平行組，向?qū)嶒?yàn)組和對照組中加入相同密度的斜生柵藻以及相同的標(biāo)準(zhǔn)BG11培養(yǎng)基。 其中實(shí)驗(yàn)組A，B和C中分別加入0.5，5和20 mg·L-1的Pb(NO3)2溶液，對照組CK不做處理，將實(shí)驗(yàn)組和對照組置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱中光照強(qiáng)度在4 000 Lux，光周期為12L∶12D。 每日固定時(shí)間點(diǎn)搖勻錐形瓶4次，通氣培養(yǎng), CO2濃度為2%, 培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，pH值為7.0。

1.2.3 斜生柵藻細(xì)胞生長的測定

根據(jù)斜生柵藻的光學(xué)特性，參照文獻(xiàn)[8], 用UV-分光光度計(jì)(uv1902pc)分別測定斜生柵藻650 nm處的吸光度(D650)。 然后再利用顯微鏡計(jì)數(shù)藻細(xì)胞，得出藻細(xì)胞和吸光度之間的線性關(guān)系(圖1)。 根據(jù)該關(guān)系可在后續(xù)試驗(yàn)中利用藻液吸光度來表示斜生柵藻的生長情況。

圖1 藻細(xì)胞密度與吸光度(D650)之間的線性關(guān)系Fig.1 Linear relationship between algal cell densityand absorbance (D650)

1.2.4 紅外光譜的采集與處理

每間隔3 h分別取各實(shí)驗(yàn)組A，B，C和CK對照組搖勻后的60 mL樣品，使用高速冷凍離心機(jī)(GL-20G-Ⅱ)，在環(huán)境溫度下以4 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min收獲30 mL細(xì)胞懸浮液，再用30 mL蒸餾水將沉淀洗滌、離心，此操作重復(fù)兩次。 然后將濃縮至1 mL的藻類溶液加入到直徑為2 cm的聚乙烯模具中，并使用電熱鼓風(fēng)干燥箱(BGZ-30)在40 ℃下干燥2.5 h，用于生物組成測定。 此時(shí)，將樣品制成厚度為20 μm的薄膜。

采集光譜時(shí)，為了消除大氣水蒸氣的吸收貢獻(xiàn)，在真空腔內(nèi)以4 cm-1(0.12 THz)的分辨率采集THz光譜，并且每次測量是64次樣品掃描和64次背景掃描的平均值，使用Bruker 66v/s傅里葉變換光譜儀在1～20 THz的范圍內(nèi)。 實(shí)驗(yàn)每3h進(jìn)行一次，在每個(gè)樣品的不同點(diǎn)收集8組數(shù)據(jù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所采集的試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel2018，The Unscrambler X和origin2018數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度的Pb2+處理對斜生柵藻生長的影響

圖2為使用UV-分光光度計(jì)(uv1902pc)在不同時(shí)間段采集實(shí)驗(yàn)組A，B，C與對照組CK中斜生柵藻的650 nm處的吸光度(D650)值，直接反應(yīng)了各個(gè)時(shí)間點(diǎn)斜生柵藻的生長狀態(tài)。 主要表現(xiàn)在低質(zhì)量濃度生長較快，高質(zhì)量濃度使斜生柵藻生長減慢。 在脅迫的24 h內(nèi)(圖2)，從整體上看CK對照組生長最快，0.5和5 mg·L-1低質(zhì)量濃度脅迫的斜生柵藻生長狀況區(qū)別不大。 說明低質(zhì)量濃度的Pb離子對斜生柵藻的生長抑制程度比較小。 而在20 mg·L-1質(zhì)量濃度的Pb離子脅迫的情況下，相對于對照組斜生柵藻生長狀況是抑制程度較大的。 斜生柵藻在不同重金屬離子影響下生長呈現(xiàn)差異性，很大程度上是由于在高質(zhì)量濃度下，重金屬在細(xì)胞膜上反應(yīng)，影響細(xì)胞的分裂與滲透性。 在細(xì)胞內(nèi)部，重金屬離子替換活性金屬或鍵合巰基、氨基和羰基基團(tuán)而使必需酶失去活性，從而制約了細(xì)胞的生長代謝[9]。

圖2 重金屬離子對柵藻生長的影響Fig.2 Effect of heavy metal ions on the growth of Scenedesmus

2.2 斜生柵藻的太赫茲光譜的光學(xué)特性

2.2.1 斜生柵藻在不同濃度Pb2+脅迫下同一時(shí)間點(diǎn)淀粉與類胡蘿卜素的含量變化

光譜可以反映生物化學(xué)成分的變化，對于不同脅迫條件下的斜生柵藻，微藻內(nèi)碳水化合物和類胡蘿卜素含量發(fā)生變化時(shí)所對應(yīng)的傅里葉光譜一般呈現(xiàn)出不同的趨勢。 在圖3顯示1～20 THz的斜生柵藻幾種大分子物質(zhì)的吸收峰位置中，主要有碳水化合物和類胡蘿卜素，其類別可通過振動(dòng)光譜法鑒定。 以下是它們在光譜的太赫茲和遠(yuǎn)紅外部分的不同頻率區(qū)域的吸光度： 9.1，10.5和17.3 THz用于碳水化合物(淀粉)[8, 10]，16.7 THz用于類胡蘿卜素(β-胡蘿卜素)[11-12]。

圖3 Pb脅迫斜生柵藻24 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對照組的對比

如圖3所示，對照組為不含重金屬的BG-11培養(yǎng)基，另外還有三個(gè)重金屬濃度的實(shí)驗(yàn)組： 0.5，5和20 mg·L-1。 培養(yǎng)周期為24h時(shí)，每脅迫三小時(shí)檢測一次FTIR，然后構(gòu)建坐標(biāo)系，將淀粉的特征峰(9.1，10.5和17.3 THz)與類胡蘿卜素的特征峰(16.7 THz)所對應(yīng)的峰值作為y值，時(shí)間點(diǎn)作為x軸繪制二維坐標(biāo)圖4(a，b，c和d)。 由圖可知，在脅迫12 h內(nèi)，各濃度脅迫下的淀粉含量變化程度差異不大，隨著脅迫時(shí)間增加至24 h，實(shí)驗(yàn)組中斜生柵藻細(xì)胞內(nèi)的淀粉與類胡蘿卜素在不斷的積累，20 mg·L-1脅迫下的斜生柵藻累積的淀粉與類胡蘿卜素始終多于0.5和5 mg·L-1的實(shí)驗(yàn)組，另外0.5和5 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組之間淀粉與類胡蘿卜素含量變化程度差異不大。

實(shí)驗(yàn)表明，Pb脅迫下實(shí)驗(yàn)組A，B和C中類胡蘿卜素和碳水化合物增加，Pb離子對碳水化合物和類胡蘿卜素的累積有促進(jìn)作用。 并且A，B和C實(shí)驗(yàn)組中類胡蘿卜素和碳水化合物的累積關(guān)系也與其脅迫Pb離子濃度存在正相關(guān)性。 這與解毒機(jī)制有關(guān)，光合作用的變化可能是鉛直接抑制光合機(jī)制引起的，或間接通過增加活性氧ROS產(chǎn)生的，或兩者結(jié)合而成。 大分子組分的變化與鉛對光合效率的抑制是一致的，因?yàn)楫?dāng)光合作用受到損害時(shí)，細(xì)胞優(yōu)先合成，與蛋白質(zhì)相比，碳水化合物和類胡蘿卜素等是不那么復(fù)雜的分子。 綜上所述一定濃度的重金屬Pb促進(jìn)了斜生柵藻中類胡蘿卜素和碳水化合物的累積，而且促進(jìn)效果20，5和0.5 mg·L-1依次遞減。

2.2.2 基于太赫茲光譜的PCA分析

對兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(12和24 h)全光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA處理，圖5(a)代表12 h時(shí)樣本數(shù)據(jù)PCA處理結(jié)果，樣本中PC-1和PC-2分別為85%和12%，其中5與20 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組聚類明顯，對照組、0.5 mg·L-1聚類效果相對較差。 圖5(b)代表24 h時(shí)樣本數(shù)據(jù)PCA處理結(jié)果，樣本中PC-1和PC-2分別為87%和9%; 24 h實(shí)驗(yàn)組樣本整體聚類明顯。

PCA圖中，12與24 h各脅迫條件下的樣本數(shù)據(jù)都存在一定差異，另外整體上24 h的樣本數(shù)據(jù)聚類效果更好，這與脅迫時(shí)間有關(guān)，另外 24 h脅迫過程中有12 h的無光合作用階段不能忽略，在無光照情況下，微藻體內(nèi)色素、碳水化合物等多種物質(zhì)的合成均會(huì)受到影響[13]，如暗環(huán)境下影響脂肪酸合成，葉綠素a、核酸等含量減少。 另外鉛濃度的增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)碳水化合物和脂類含量增加，蛋白質(zhì)和磷酸化水平下降。 因此，由于多種物質(zhì)的復(fù)雜變化，24 h的PCA圖與12 h的PCA圖存在一定的差異。

3 結(jié) 論

利用太赫茲、遠(yuǎn)紅外技術(shù)對Pb脅迫下斜生柵藻物質(zhì)含量變化進(jìn)行了研究。 通過對比各個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣本在淀粉(9.1，10.5和17.3 THz)與類胡蘿卜素(16.7 THz)特征吸收峰位處的吸光度值，對微藻內(nèi)淀粉與類胡蘿卜素含量的趨勢變化進(jìn)行了研究。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在脅迫24 h內(nèi)，0～9 h時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組A，B，C與對照組的特征吸收峰值差異不大，主要是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)脅迫時(shí)間短，且微藻細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)合成需一定時(shí)間。 9 h開始A，B，C與對照組中微藻細(xì)胞物質(zhì)變化得差異逐漸顯現(xiàn)，隨脅迫時(shí)間增長至24 h，實(shí)驗(yàn)組A，B，C特征吸收峰逐漸遞增，并且實(shí)驗(yàn)組C，B和A依次增大，這與隨著鉛脅迫濃度的增加，碳水化合物和脂類含量增加相一致。 研究中分別使用0.5，5和20 mg·L-1濃度的重金屬脅迫微藻，實(shí)驗(yàn)中測定出的微藻光合效率表明，鉛脅迫抑制了藻類的光合作用，細(xì)胞優(yōu)先合成碳水化合物和類胡蘿卜素等分子。 隨著鉛濃度的增加，碳水化合物和類胡蘿卜素增加，這個(gè)結(jié)果與微藻得到的光譜圖中淀粉(9.1，10.5和17.3 THz)與類胡蘿卜素(16.7 THz)的特征吸收峰值隨時(shí)間變化的趨勢一致。 通過主成分分析，其中12和24 h下數(shù)據(jù)的聚類效果明顯，說明可以利用太赫茲、遠(yuǎn)紅外光譜識別鉛脅迫下藻類內(nèi)部物質(zhì)成分的變化。 太赫茲、遠(yuǎn)紅外光譜可作為一種快速，無損方法，用于對鉛脅迫下藻體細(xì)胞成分的變化研究，從而實(shí)現(xiàn)水體污染程度的判定。

圖4 重金屬脅迫下(a，b，c，d)9.1，10.5，16.7和17.3 THz吸收峰值Fig.4 9.1，10.5，16.7 and 17.3 THz absorption peak under heavy metal stress (a, b, c, d)

圖5 不同時(shí)間[12 h (a)和24 h (b)]樣本PCA對比Fig.5 Comparison of sample PCA at the same time [12 h (a), 24 h(b)]