王清華，呂晨，王捷，馬佳文，劉國祥

（1.太原師范學院 生物系，山西 晉中 030619；2.中國科學院水生生物研究所 中國科學院藻類生物學重點實驗室，湖北 武漢 430072）

0 引言

柵藻屬（Scenedesmus）隸屬于綠藻門（Chlorophyta）環(huán)藻目（Sphaeropleale），為該目柵藻科（Scenedesmaceae）的模式屬，主要營淡水浮游生活。該屬由 Meyen建于 1829年［1］，Carl在 1849年將鈍形柵藻Scenedesmus obtusus定為該屬的模式種［2］。柵藻屬自建立之后有超過300個物種被記錄，為了便于區(qū)分，不同分類學者都建立了不同的屬下分類系統并進行描述。Komárek和Fott在《Chlorococcales》中將柵藻屬分為柵藻亞屬（Subg.Scenedesmus）和鏈帶藻亞屬（Subg.Desmodesmus），亞屬之下又包含6個組，并認為只有100～ 150個種較為可靠［3］。

1999年，An等基于ITS序列研究了廣義柵藻屬，發(fā)現該屬可明顯分為兩個不同的支系，于是將鏈帶藻亞屬（Subg.Desmodesmus）提升為屬級分類單位［4］。之后又有多個屬下分類單位或物種被提升至屬級，如尖帶藻屬（Acutodesmus）、考 馬 斯 藻 屬（Comasiella）、扇 帶 藻 屬（Pectinodesmus）以及喬帶藻屬（Chodatodesmus）等［5-8］。如今的柵藻屬幾乎僅包含Komárek和Fott分類系統中的柵藻亞屬（Subg.Scenedesmus）中的狹義柵藻組（Gruppe Scenedesmus sensu stricto）。其形態(tài)描述為群體多由2，4或8個細胞組成，外具膠被，群體平面平直或彎曲，細胞依其長軸線形或交錯地排成1列或2列，細胞橢圓形、圓柱形或卵圓形，直或稍微彎曲，末端鈍圓，細胞壁完全光滑，且有時稍有加厚。

我國記錄的柵藻類植物種類豐富，諸多學者對該類群在我國的分布及多樣性調查做出過重要貢獻。1999年，謝樹蓮等系統整理了分布于我國的52種柵藻屬植物，并依據數量分類將它們分為5個類群［9］。依據《中國淡水藻志》第十五卷，我國記錄柵藻屬植物共81種，但主要采用了Komárek和Fott的分類系統，而其中形態(tài)符合當前柵藻屬定義的物種僅包含7種，2變種［10］。當前部分種已被轉移至其他屬或被證實為同種異名，如盤狀柵藻（Scenedesmus disciformis）、卵形柵藻（Scenedesmus ovalternus）、鈍形柵藻交錯變種（Scenedesmus obtusus var.alternans）等［11］。因此，急需對我國現有的柵藻屬進行重新修訂。

本研究基于采自我國內蒙古自治區(qū)阿爾山國家森林公園的1株柵藻屬植物，通過形態(tài)學與系統發(fā)育學研究相結合的手段，最終鑒定其為我國柵藻屬新記錄種，擬命名為亨氏柵藻（Scenedesmus hindakii Hegewald&Hanagata），并進一步對我國的柵藻屬系統進行了探討。

1 材料方法

1.1 標本采集與培養(yǎng)

藻株采自內蒙古自治區(qū)阿爾山國家森林公園（47°16′55″N，120°24′45″E）。使用浮游生物網（20 μm孔徑）撈取水樣，并置于采樣瓶（60 mL）中帶回實驗室進行研究。藻株的分離純化使用單細胞挑取法，即在倒置顯微鏡（Nikon SMZ800N）下用毛細管挑取得到單個群體，將其接入含有BBM液體培養(yǎng)基的96孔板中，經逐級擴大培養(yǎng)后得到單藻種，藻株編號為LXD60。分離得到的藻株培養(yǎng)于25℃恒溫培養(yǎng)箱（博迅 BSG-400）中，光暗比為12∶12。

1.2 顯微形態(tài)獲取

藻體的形態(tài)描述和顯微拍照使用顯微鏡奧林巴斯 BX53（Olympus Cop，日本），觀察模式為微分干涉（Differentical interference contrast，DIC）。

1.3 分子標記獲取

將適量藻液收集于2 mL凍存管中，利用MiniBeadBeater（Model607EUR，美國）震蕩破碎細胞。基因組提取使用商品化試劑盒（Axy-Prep，蘇州，中國）。選擇18S、ITS和tufA三個分子標記進行PCR擴增。18S引物參考Medlin等［12］，ITS 引物參考 Bhattacharya等［13］，tufA 序列引物參考Famà等［14］。擴增產物經檢測后送往擎科生物（武漢）進行測序。序列提交至GenBank數據庫。

1.4 系統發(fā)育學分析

分別使用18S+ITS聯合序列以及tufA基因序列進行系統發(fā)育分析，近緣序列參考Wang等研究結果［15］。序列比對、校正以及序列串聯分別使用軟件 Mafft7.0［16］、MEGA 6.0［17］和 SequenceMatrix［18］。數據集的堿基組成分析、堿基轉換與顛換比分析分別使用MEGA 6.0和Bioedit 7.0［19］進行。系統發(fā)育分析最大似然法（ML）使用軟件 IQ-TREE web server［20］，貝葉斯法（BI）利用軟件 MrBayes 3.2.1［21］。

2 結果

2.1 形態(tài)觀察

柵藻屬Scenedesmus Meyen，1892。

模式種：鈍形柵藻Scenedesmus obtusus Meyen 1892。

亨氏柵藻Scenedesmus hindakii Hegewald&Hanagata，2000：46，Fig.5。

群體多由4細胞組成，群體平面平直或彎曲（圖1（a）—（b））。細胞交錯排列成2行，相連細胞多以細胞側壁1/2至1/4處（即亞頂端）相連，培養(yǎng)狀態(tài)常解散成單細胞（圖1（c））。細胞橢球形或長圓柱狀，末端鈍圓，細胞壁光滑，群體外具膠被。色素體周生片狀或杯狀，具一個明顯的蛋白核，蛋白核外具淀粉鞘。通過似親孢子進行無性繁殖（圖1（d））。

圖1 亨氏柵藻a—b：四細胞群體c：培養(yǎng)狀態(tài)單細胞d：似親孢子（標尺=10 μm）Fig.1 Scenedesmus hindakii.a—b.4 cell coenobia.c.Single cells in culture.d.autosporangia.（Scale bar=10 μm）

細胞大?。海? μm ～ 11.5 μm）×（4 μm ～7.5 μm）；四細胞群體寬：18 μm ～ 22 μm。

生境：溫帶地區(qū)池塘等靜水水體。

標本采集地：內蒙古自治區(qū)阿爾山國家森林公園。

2.2 系統發(fā)育學分析

圖2顯示基于18S聯合ITS分子標記的系統發(fā)育樹，數據集共有序列28條，矩陣經手動校正后長度為2 001 bp，包含217 bp簡約信息位點（10.84%），263 bp可變位點（13.14%），以及1 738 bp的保守位點（86.86%）。外類群選用水網藻科藻株。

圖2 柵藻科基于18S rDNA和ITS序列的系統樹Fig.2 Phylogenetic analysis of Scenedesmaceae by 18S+ITS genes

圖3顯示基于tufA基因的柵藻科系統發(fā)育樹，數據集共有序列27條，矩陣經手動校正后長度為736 bp，包含207 bp簡約信息位點（28.12%），243 bp可變位點（33.02%）以及493 bp保守位點（66.98%）。外類群選用2株水網藻科藻株。

圖3 柵藻科基于葉綠體tufA基因的系統樹Fig.3 Phylogenetic analysis of Scenedesmaceae by tufA sequence

系統樹中以“*”標示的類群，代表由原Komárek和Fott分類系統中柵藻屬中獨立出來的屬。目前對于柵藻屬的定義僅包含柵藻亞屬（Subg.Scenedesmus）的 狹 義 柵 藻 組（Gruppe Scenedesmus sensu stricto），其主要形態(tài)描述為細胞橢圓形、圓柱形或卵圓形，直或稍微彎曲，末端鈍圓，細胞壁完全光滑。該類群區(qū)別于部分細胞表面具棘刺、脊、齒狀凸起（鏈帶藻屬Desmodesmus），細胞呈紡錘形（四鏈藻屬Tetradesmus）或細胞呈狹紡錘形、表面具縱向肋紋（扇帶藻屬Pectinodesmus）的種。目前的柵藻屬類群在系統樹中以紅色陰影部分表示。

基于18S+ITS序列以及tufA基因的系統發(fā)育分析結果均表明，目前的柵藻屬在柵藻科中呈單系分支，且均獲得較高的支持值（99/1、96/1），而本研究采自內蒙古阿爾山的藻株LXD60與保藏于德國藻類培養(yǎng)保藏中心（哥根廷）的藻株Scenedesmus hindakii SAG47.68具最近的親緣關系，分子證據也證實藻株LXD60為Scenedesmus hindakii，擬命名為亨氏柵藻。

3 討論

亨氏柵藻由Hegewald和Hanagata建于2000年，該種曾被錯誤的鑒定為Schroederiella apiculata。Hegewald和Hanagata認為亨氏柵藻雖然群體彎曲但并未連成環(huán)形，不符合Schroederiella屬的形態(tài)描述，且其親緣關系與Scenedesmus raciborskii、S.ovalternus和 S.obtusus相近，因此認為該種應屬于柵藻屬。本研究所采集藻株形態(tài)與Hegewald和Hanagata所描述一致，即群體多呈彎曲狀但并未連接成環(huán)，兩側細胞連接于細胞同一側亞頂端部位，使群體細胞呈交錯排列。亨氏柵藻群體彎曲與S.arcuatus、S.raciborskii和S.curvatus類似，但是它們的細胞排列方式不同。就細胞排列方式而言，亨氏柵藻與鈍形柵藻更為相似，但鈍形柵藻群體呈平面狀，且二者具有不同的系統發(fā)育學位置［5］。

依據《中國淡水藻志》第十五卷，其中形態(tài)符合當前柵藻屬定義的物種僅包含7種，2變種［9］，分別為光滑柵藻（S.ecornis），盤狀柵藻（S.disciformis），鈍形柵藻（S.obtusus），卵形柵藻（S.ovalternus），凸頂柵藻（S.producto-capitatus），單列柵藻（S.linearis），阿庫柵藻（S.acunae）以及鈍形柵藻交錯變種（S.obtusus var.alternans）和凸頂柵藻印度變種（S.productocapitatus var.indicus）。其中卵形柵藻和鈍形柵藻交錯變種已被視為鈍形柵藻的同種異名［22］。單列柵藻被認為是橢形柵藻（新擬）（S.ellipticus）的異名［11］。另依據《中國淡水藻類：系統、分類及生態(tài)》及其他研究［23-28］記錄的形態(tài)符合當前柵藻屬定義的有扁盤柵藻（S.platydiscus）、彎曲柵藻（S.arcuatus）、雙對柵藻（S.bijuga）、雙對柵藻交錯變種（S.bijugavar.alternans）、雙對柵藻錯亂變種（S.bijugusvar.irregularis）、雙對柵藻極小變型（S.bijugatusf.tenuissimus）等。其中扁盤柵藻和彎曲柵藻認為是彎曲考馬斯藻（Comasiella arcuata）的異名［7，11］，雙對柵藻是斜生四鏈藻（Tetradesmusobliquus=Scenedesmus obliquus）的異名，雙對柵藻交錯變種被認為是卵形柵藻的異名，雙對柵藻錯亂變種是鈍形柵藻的異名，雙對柵藻極小變型認為是單列柵藻的異名［3，10］。朱雅茹和王全喜報道了采自長三角地區(qū)的柵藻屬中國新紀錄植物［29］，其中符合當前柵藻屬形態(tài)的光滑柵藻盤狀變種（S.ecornisvar.disciformis）被認為是鈍形柵藻盤狀變型（S.obtususf.disciformis）（=盤狀柵藻S.disciformis）的異名［11］。因此，目前中國紀錄的柵藻屬植物共有6種，1變種，1變型（表1）。

表1 中國記錄柵藻屬植物Table 1 The record of genus Scenedesmus in China

國外基于分子標記對柵藻科的研究將部分類群逐步轉移出廣義柵藻屬，獨立成新屬（如疣帶藻屬Verrucodesmus、喬帶藻屬、扇帶藻屬等），但廣義柵藻屬中仍有大量物種分類地位未經確認，新的柵藻屬也尚未有系統綜合性的研究。我國對于柵藻屬的研究也僅停留于經典形態(tài)學分類階段，缺少分子數據報道。柵藻屬目前面臨從形態(tài)分類向分子系統分類過渡，屬內多數種類因缺少關鍵序列而無法最終確認其分類地位。今后的研究需要獲得相關物種的有效序列信息，以從系統發(fā)育學的角度厘清其進化關系。