張 露, 徐 亮, 涂宗財(cái), 2*, 周祺溟, 周雯娜

1. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國(guó)家淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西省淡水魚(yú)高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330022 2. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047

引 言

糖基化反應(yīng)，又叫美拉德反應(yīng)，是還原糖的醛基和蛋白質(zhì)、核苷酸和脂質(zhì)的氨基之間發(fā)生的一種自發(fā)的非酶促反應(yīng)[1]，通常包括初期、中期和晚期三個(gè)階段，最后會(huì)形成一系列晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)。 在食品加工工業(yè)，常通過(guò)糖基化反應(yīng)提高蛋白質(zhì)的功能特性(如起泡性、乳化性、抗氧化性等)，改善食品的風(fēng)味、色澤和口感[2-3]。 但食品體系或食品蛋白在糖基化過(guò)程中也會(huì)形成對(duì)人體有害的AGEs，降低氨基酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4]。 研究發(fā)現(xiàn)，堅(jiān)果、谷類產(chǎn)品、高溫加工的罐頭產(chǎn)品、烤肉、餅干和蛋糕通常含有相對(duì)較高的AGEs[1]。 長(zhǎng)期攝入富含AGEs的食物，會(huì)導(dǎo)致AGEs在機(jī)體中的積累，加速血管中膠原蛋白的交聯(lián)，促進(jìn)活性氧和活性碳自由基的形成，增強(qiáng)胰島素抵抗，促進(jìn)促炎癥反應(yīng)等，從而增加阿爾茨海默病、糖尿病、炎癥、心血管疾病、視網(wǎng)膜病變等系列慢性疾病的發(fā)病率[5]。 添加AGEs抑制劑降低食品在熱加工過(guò)程中AGEs的形成是提高食品安全，促進(jìn)人體健康的有效方法之一。

AGEs抑制劑包括合成和天然化合物兩類，其中植物來(lái)源的天然AGEs抑制劑因其種類多、效果較好、副作用小等優(yōu)點(diǎn)已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[6]。 Oral等[7]研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮提取物、歐洲布什蔓越莓汁提取物、咖啡酸、兒茶素、鞣花單寧等植物提取物和多酚類化合物可有效降低餅干焙烤過(guò)程中呋喃和丙烯酰胺的形成； 添加0.2%的白藜蘆醇、表兒茶素和迷迭香酸，可使餅干中熒光性AGEs的形成量降低28.60%～62.05%[8]。 異槲皮素(槲皮素-3-O-葡萄糖苷)是普遍存在于植物中的功能性次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有降血壓、抗氧化、保肝、抗增殖、抗利尿、抗癌等多種生物活性[9]，前期研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能有效抑制BSA-葡萄糖體系在37 ℃條件下的糖基化反應(yīng)，降低AGEs的形成，但糖苷形式的槲皮素——異槲皮素，能否有效抑制食品蛋白在熱處理?xiàng)l件下的糖基化反應(yīng)需進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，熒光光譜法因其具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、樣品用量少、操作簡(jiǎn)便，同時(shí)又可以提供較多的物理參數(shù)的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于小分子和蛋白質(zhì)的相互作用研究。 因此本文以α-La-果糖體系為研究模型，通過(guò)分析熒光性AGEs相對(duì)含量的變化，研究熱處理?xiàng)l件下，異槲皮素對(duì)α-La-果糖體系糖基化反應(yīng)的影響，然后通過(guò)內(nèi)源熒光、同步熒光和三維熒光光譜技術(shù)研究異槲皮素對(duì)α-La的構(gòu)象結(jié)構(gòu)、微環(huán)境的影響及其相互作用機(jī)制，最后從α-La結(jié)構(gòu)變化和分子間相互作用的角度探討異槲皮素抑制α-La糖基化的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

果糖、異槲皮素(北京索萊寶科技有限公司)； NaH2PO4和Na2HPO4(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)； α-La(美國(guó)Sigma公司)。

F-7000熒光光譜儀(日本日立公司)； 天平FA1104N電子分析天平(丙林電子科技有限公司)； PE28 PH計(jì)(梅特勒-托力多儀器(上海)有限公司)。

1.2 糖基化α-La制備

根據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道方法制備糖基化體系。 采用0.2 mol·L-1、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制20 mg·mL-1的α-La和果糖溶液。 α-La和果糖溶液按等體積比加入帶蓋玻璃瓶中，然后分別加入不同濃度的異槲皮素溶液，使反應(yīng)體系中異槲皮素的濃度分別為12.20，24.39，36.58，48.78和73.17 μmol·L-1。 用乙醇代替異槲皮素和用PBS代替果糖的反應(yīng)體系分別設(shè)為控制組和樣品空白組。 最后，所有混合體系于55 ℃下反應(yīng)36 h，4 ℃冷卻后，測(cè)定其熒光性AGEs的相對(duì)含量。

1.3 熒光光譜分析

1.3.1 AGEs抑制活性測(cè)定

采用日立F-7000熒光光譜儀測(cè)定樣品中熒光性AGEs的相對(duì)含量[10]。 樣品用0.2 mol·L-1、pH 7.4的PBS稀釋6倍后測(cè)定其在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm處的熒光強(qiáng)度，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均設(shè)為2.5 nm，掃描速度為1 200 nm·min-1。 AGEs抑制率的計(jì)算公式為

(1)

其中FIs為含有α-La、果糖和異槲皮素的反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度；FIc，F(xiàn)Ib和FInb分別為控制組、空白組和樣品空白組的熒光強(qiáng)度。

1.3.2 內(nèi)源熒光光譜

采用日立F-7000熒光光譜儀測(cè)定α-La內(nèi)源熒光光譜的變化[11]，掃描參數(shù)為： 激發(fā)波長(zhǎng)，280 nm； 發(fā)射波長(zhǎng)，300～400 nm； 激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度，5.0 nm； 掃描速度，1 200 nm·min-1。 測(cè)定前用0.2 mmol·L-1，pH 7.4的PBS將所有樣品稀釋30倍。

1.3.3 同步熒光光譜

采用日立F-7000熒光光譜儀分析298 K條件下不同濃度異槲皮素對(duì)α-La同步熒光光譜的影響。 波長(zhǎng)間隔(Δλ)為15 nm時(shí)的掃描范圍為260～350 nm，Δλ為60 nm時(shí)的掃描范圍為250～350 nm，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為1 200 nm·min-1，α-La的濃度為0.3 mg·mL-1，異槲皮素的濃度范圍為0.0 ～25.97 μmol·L-1。

1.3.4 三維熒光光譜

根據(jù)前期研究方法[12]，2.0 mL 0.3 mg·mL-1的α-La與10 μL 0.5 mmol·L-1的異槲皮素在25 ℃下混勻后，靜置5 min，然后測(cè)定其在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍均為200～600 nm時(shí)的熒光光譜，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均為5.0 nm，掃描速率為12 000 nm·min-1。

1.3.5 抑制動(dòng)力學(xué)研究

采用熒光滴定的方法[13]，分別測(cè)定298, 304和310 K時(shí)，不同濃度異槲皮素對(duì)α-La在300～400 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜的影響。 激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5.0 nm, 掃描速度為1 200 nm·min-1。 混合體系中，α-La的濃度為0.3 mg·mL-1，異槲皮素的濃度從3.32 μmol·L-1增加到25.97 μmol·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 AGEs抑制能力分析

蛋白糖基化過(guò)程中形成的AGEs包括熒光性AGEs和非熒光性AGEs組成，因此，很多研究者采用熒光光譜技術(shù)評(píng)價(jià)樣品抑制蛋白糖基化過(guò)程中AGEs形成的能力，熒光強(qiáng)度越高，表明反應(yīng)體系中AGEs形成的相對(duì)含量越高，抑制率就越低。 異槲皮素對(duì)α-La-果糖體系中AGEs形成的影響如圖1所示，當(dāng)異槲皮素的濃度為12.20，24.39，36.58，48.78和73.17 μmol·L-1時(shí)，其對(duì)AGEs形成的抑制率分別為11.97%，54.79%，74.66%，78.90%和86.25%，而陽(yáng)性對(duì)照品氨基胍鹽酸鹽在濃度為24.39和36.58 μmol·L-1時(shí)，對(duì)AGEs形成的抑制率為38.21%和58.72%，低于異槲皮素，表明異槲皮素能有效抑制α-La糖基化過(guò)程中AGEs的形成。

圖1 異槲皮素對(duì)α-La-果糖體系中AGEs形成的影響

2.2 內(nèi)源熒光光譜分析

異槲皮素對(duì)糖基化α-La內(nèi)源熒光強(qiáng)度的影響如圖2所示。 天然α-La具有最大熒光強(qiáng)度，糖基化后α-La的熒光從3 386降低至2 357。 說(shuō)明糖基化反應(yīng)能顯著降低了α-La的內(nèi)源熒光，可誘導(dǎo)蛋白構(gòu)象的展開(kāi)，降低其內(nèi)源熒光強(qiáng)度[14]。 但隨著異槲皮素濃度從12.20 μmol·L-1增加到48.78 μmol·L-1時(shí)，糖基化α-La的內(nèi)源熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明異槲皮素能夠降低糖基化反應(yīng)誘導(dǎo)的α-La構(gòu)象變化，這可能是其抑制AGEs形成的原因之一。 Zhang等也表明，緩解糖基化誘導(dǎo)的蛋白構(gòu)象變化是天然提取物[10]和黃酮類化合物[11]抑制蛋白糖基化的機(jī)制之一。 但當(dāng)樣品濃度為73.17 μmol·L-1時(shí)，最大熒光強(qiáng)度值出現(xiàn)下降，這可能是因?yàn)辄S酮類化合物本身可與蛋白發(fā)生相互作用，猝滅其內(nèi)源熒光。 當(dāng)黃酮的相對(duì)濃度過(guò)高的時(shí)候，α-La的糖基化反應(yīng)被完全抑制，反應(yīng)體系中多余的黃酮類化合進(jìn)一步猝滅蛋白質(zhì)的的熒光，改變其構(gòu)象。

圖2 不同濃度異槲皮素對(duì)糖基化α-La內(nèi)源熒光光譜Fig.2 Influence of isoquercetin on the intrinsicfluorescence spectra of glycated α-La

2.3 同步熒光光譜分析

同步熒光光譜可以檢測(cè)蛋白質(zhì)的主要熒光性發(fā)色團(tuán)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度主要來(lái)源于色氨酸，其次為酪氨酸，因此，可以通過(guò)同步熒光光譜技術(shù)分析異槲皮素對(duì)α-La中熒光性氨基酸殘基附近微環(huán)境變化的影響。 如圖3所示，Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時(shí)的最大熒光發(fā)射光譜的變化分別反應(yīng)酪氨酸和色氨酸微環(huán)境的變化。 酪氨酸[圖3(a)]和色氨酸[圖3(b)]殘基的最大熒光強(qiáng)度均隨著異槲皮素濃度的增加而明顯降低，其中對(duì)色氨酸的熒光猝滅效果明顯高于酪氨酸，其熒光強(qiáng)度分別從1 213和6 925降至827.4和3 700。 另外，色氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象，而酪氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)沒(méi)有明顯的變化。 以上結(jié)果表明，α-La的熒光猝滅的主要貢獻(xiàn)者是色氨酸，異槲皮素與α-La的結(jié)合會(huì)改變色氨酸微環(huán)境的極性，使其暴露在更加親水的環(huán)境中，增加其周圍微環(huán)境的親水性[13]。 這可能是因?yàn)樯彼岜壤野彼釋?duì)其周圍極性的變化更敏感，如芹菜素、柚皮素、山柰酚和染料木素與β-乳球蛋白的相互作用使色氨酸的熒光發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移，但是對(duì)酪氨酸的最大發(fā)射波長(zhǎng)無(wú)影響[15]。

2.4 三維熒光光譜分析

三維熒光光譜技術(shù)可以研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。 異槲皮素對(duì)天然α-La的三維熒光光譜的影響如圖4所示，Rayleigh(Ex=Em)峰是瑞利散射峰，峰1(Ex=280 nm，Em=330 nm)為色氨酸殘基的分光特性峰，主要表明蛋白質(zhì)的多肽骨架結(jié)構(gòu)的變化。 從圖4(a)和(b)可以看出，α-La與異槲皮素相互作用后，Rayleigh峰和峰1的熒光強(qiáng)度顯著降低，這可能歸因于色氨酸熒光團(tuán)微環(huán)境的變化以及α-La內(nèi)多肽骨架結(jié)構(gòu)的變化[13]。

圖3 α-La與不同濃度異槲皮素作用的同步熒光光譜

2.5 抑制動(dòng)力學(xué)分析

2.5.1 熒光猝滅動(dòng)力學(xué)

熒光光譜是研究小分子配體和蛋白受體間相互作用的強(qiáng)有力的工具，已廣泛被用于研究生物大分子和小分子間的相互作用機(jī)制[13, 15]。 由圖5(a)所示，α-La的熒光強(qiáng)度隨異槲皮素濃度的增加逐漸降低，且發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)了明顯的藍(lán)移，表明異槲皮素改變了α-La的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，有效猝滅了α-La的內(nèi)源熒光，其熒光猝滅機(jī)制可通過(guò)Stern-Volmer方程計(jì)算

(2)

式(2)中，F(xiàn)和F0分別為含和不含異槲皮素時(shí)α-La的熒光強(qiáng)度; [Q]是異槲皮素的濃度;Kq為熒光猝滅速率常數(shù);KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù);τ0為沒(méi)有猝滅劑的情況下α-La的平均熒光壽命。

以異槲皮素濃度[Q]為橫坐標(biāo)，F(xiàn)0/F為縱坐標(biāo)繪制的Stern-Volmer曲線如圖5(b)所示，根據(jù)方程計(jì)算的KSV和Kq如表1所示，KSV隨著反應(yīng)溫度的升高而降低，Kq在298，304和310 K時(shí)的值分別為6.07×1012，5.33×1012和5.14×1012L·mol-1·s-1，且遠(yuǎn)高于生物大分子最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)(2×1012L·mol-1·s-1)，表明異槲皮素是通過(guò)靜態(tài)方式猝滅α-La的內(nèi)源熒光[16]。

圖4 異槲皮素對(duì)α-La三維熒光光譜的影響Fig.4 Three-dimensional fluorescence spectra of α-La without (a) and with (b) isoquercetin

圖5 (a)不同濃度異槲皮素對(duì)α-La熒光發(fā)射光譜的影響； (b)F0/F與異槲皮素濃度[Q]之間的Stern-Volmer圖； (c)log[(F0-F)/F]與log[Q]的double logarithmic圖； (d)lnKa與1/T的van’t Hoff圖

2.5.2 結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)

基于靜態(tài)猝滅機(jī)理，可采用double logarithmic方程(3)計(jì)算結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

(3)

結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)n如表1所示，異槲皮素和α-La的Ka值隨溫度升高逐漸減小，并且與KSV的變化一致，說(shuō)明隨溫度的升高，異槲皮素-α-La復(fù)合物的穩(wěn)定性降低，說(shuō)明異槲皮素與α-La的結(jié)合是一個(gè)放熱的過(guò)程。 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為1.368，1.472，1.128，接近于1。 說(shuō)明異槲皮素在α-La上是只有一個(gè)或者一類結(jié)合位點(diǎn)的[13]。

用van’t Hoff方程計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)中的焓變(ΔHo)，熵變(ΔSo)和自由能變化(ΔGo)來(lái)研究異槲皮素-α-La復(fù)合物的形成過(guò)程中的熱力學(xué)變化，即

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R

(4)

ΔGo=ΔHo-TΔSo

(5)

其中R是氣體常數(shù)(8.314 J·mol-1·K-1)，T是實(shí)驗(yàn)溫度(288，298和310 K)，Ka是通過(guò)式(2)得到的結(jié)合常數(shù)。 根據(jù)方程(4)繪制以lnKa為縱坐標(biāo)，以1/T為橫坐標(biāo)的直線[圖5(d)]，得到的ΔHo，ΔSo和ΔGo如表1所示。 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ΔHo<0，ΔSo<0表明氫鍵和范德華力是分子間的主要作用力； ΔHo>0，ΔSo>0表明疏水相互作用是分子間的主要作用力； ΔHo>0，ΔSo<0表明靜電相互作用是分子間的主要作用力[15]。 異槲皮素與α-La相互作用的ΔHo和ΔSo分別為-458.79和-1.39 kJ·mol-1，均小于0，且|ΔHo|<|TΔSo|，這進(jìn)一步驗(yàn)證了異槲皮素與α-La的結(jié)合是一個(gè)放熱的過(guò)程，范德華力和氫鍵是其主要驅(qū)動(dòng)力。 另外，ΔGo<0，表明異槲皮素-α-La復(fù)合物的形成是一個(gè)自發(fā)的過(guò)程[16]。

表1 槲皮素與α-La相互作用的熒光猝滅常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 1 The fluorescence quenching constants, binding sites, binding constant andthermodynamic parameters for the interaction of isoquercetin with α-La

3 結(jié) 論

通過(guò)熒光光譜技術(shù)研究了異槲皮素抑制α-La-果糖模型中AGEs形成的能力。 研究結(jié)果表明，異槲皮素可以顯著抑制α-La糖基化過(guò)程中AGEs的形成，減弱糖基化反應(yīng)誘導(dǎo)的α-La構(gòu)象變化。 同時(shí)，異槲皮素與α-La的相互作用會(huì)顯著猝滅α-La的內(nèi)源熒光，改變?chǔ)?La的構(gòu)象，使色氨酸暴露在更加親水的環(huán)境中，增加其微環(huán)境的極性。 分子間相互作用研究發(fā)現(xiàn)，異槲皮素與α-La作用后按照1∶1的摩爾比結(jié)合形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，且通過(guò)靜態(tài)的方式猝滅α-La熒光團(tuán)； 異槲皮素-α-La復(fù)合物的形成是一個(gè)自發(fā)的放熱過(guò)程，范德華力和氫鍵是其主要作用力。 本研究結(jié)果證明，異槲皮素可作為天然的糖基化抑制劑用于食品加工工業(yè)，減少食品熱加工過(guò)程中AGEs的產(chǎn)生，提高食品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和安全性。