孫世輝,許恒,張金民,王波清,劉振華

(1.河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)教研室，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院2016級(jí)中醫(yī)二班，河北 保定 071000；3.中國(guó)人民解放軍陸軍第八十二集團(tuán)軍醫(yī)院中醫(yī)科，河北 保定 071000)

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH )是骨科常見病、難治病,高發(fā)于20～40歲中青年人[1],據(jù)報(bào)道[2]，中國(guó)的患病人數(shù)已超過(guò)500萬(wàn)且病例基數(shù)每年以15萬(wàn)～20萬(wàn)例的比例增長(zhǎng)。ONFH自然進(jìn)展快，若不及時(shí)干預(yù)治療,多數(shù)患者可在1～4年內(nèi)發(fā)展為股骨頭塌陷、髖關(guān)節(jié)繼發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎,嚴(yán)重者需要接受髖關(guān)節(jié)置換術(shù)[3-5]。股骨頭壞死危險(xiǎn)因素很多，包括糖皮質(zhì)激素的頻繁使用、酗酒、股骨頸骨折、股骨頭骨骺滑脫、髖關(guān)節(jié)脫位、鐮狀細(xì)胞貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等因素。但其具體發(fā)病機(jī)制至今仍不明確,對(duì)此,國(guó)內(nèi)外學(xué)者提出了各種學(xué)說(shuō):血運(yùn)障礙、脂質(zhì)代謝紊亂、骨內(nèi)壓增高、骨細(xì)胞凋亡、基因多態(tài)性、免疫因素等[6-8]。ONFH屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”“骨蝕”的范疇。陽(yáng)和湯(Yanghe Tang,YHT)方出自清代著名中醫(yī)外科醫(yī)家王洪緒的著作《外科證治全生集》，該湯劑由熟地、肉桂、白芥子、姜炭、生甘草、麻黃、鹿角膠等中藥組成。近年來(lái)被廣泛用于膝骨關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、腰椎間盤突出癥、骨質(zhì)疏松癥等多種骨傷科常見疾病的治療[9]。有研究[10]表明，陽(yáng)和湯能抑制骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)，修復(fù)軟骨損傷，可能與降低炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。據(jù)現(xiàn)有臨床研究結(jié)果[11-12]，運(yùn)用陽(yáng)和湯加減方對(duì)早期的股骨頭壞死具有良好的臨床療效，且54例臨床對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示結(jié)果差異顯著。然而目前，YHT治療ONFH的藥理分子機(jī)制尚未清楚，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接法，在臨床驗(yàn)證的基礎(chǔ)上初步探究YHT干預(yù)ONFH的核心化合物、靶點(diǎn)與關(guān)鍵通路，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究作鋪墊。

1 資料與方法

1.1 YHT化合物信息的收集和中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

本研究以YHT方中藥物組合(熟地、肉桂、白芥子、姜炭、生甘草、麻黃、鹿角膠)為檢索詞，運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)對(duì)中藥相關(guān)活性成分進(jìn)行檢索，并按照口服吸收利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18的推薦篩選指標(biāo)，進(jìn)一步篩選高活性化合物。

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢YHT中主要成分的作用靶點(diǎn)，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行基因名的轉(zhuǎn)換與校正，使靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化，并將YHT的化合物與靶點(diǎn)的關(guān)系信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.2 YHT治療ONFH的潛在作用靶點(diǎn)的獲取

基于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)，選擇物種為“Homo sapiens”，以“osteonecrosis of the femoral head”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到ONFH的相關(guān)靶點(diǎn)基因。運(yùn)用Venny 2.1在線繪圖工具，對(duì)化合物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與疾病預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行交集映射，獲取陽(yáng)和湯治療ONFH的潛在靶點(diǎn)，研究流程如圖1所示。

圖1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接法的研究流程

1.3 YHT治療ONFH的核心化合物的篩選

為了進(jìn)一步篩選YHT治療ONFH的核心化合物，將YHT治療ONFH的核心作用靶點(diǎn)映射到相應(yīng)的化學(xué)成分上，并在Cytoscape 3.7.1構(gòu)建了YHT化合物與核心作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，篩選出核心化合物。

1.4 PPI蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的建立與核心靶點(diǎn)的篩選

為進(jìn)一步了解核心靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將1.3篩選出的共同靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo sapiens”，置信度設(shè)置大于0.700，獲取PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息。然后導(dǎo)出PPI網(wǎng)絡(luò)的蛋白質(zhì)互作信息TSV文件，然后將TSV文件數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1中，運(yùn)用插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，以節(jié)點(diǎn)度值、介值中心度均超過(guò)平均值為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出陽(yáng)和湯治療ONFH的核心靶點(diǎn)。

1.5 DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋與通路富集

為了進(jìn)一步明確核心靶點(diǎn)基因的生物學(xué)功能和陽(yáng)和湯方治療ONFH的主要通路，將以上得到的藥物與疾病共同靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)，選擇靶基因列表與物種為“homo sapiens”，校正靶基因名稱為“offcial gene symbol”，設(shè)定閾值P<0.01,進(jìn)行基因本體功能GO富集，具體包括生物過(guò)程BP、細(xì)胞成分CC、分子功能MF的富集分析；同時(shí)進(jìn)行KEGG通路富集分析，最后運(yùn)用RStudio 3.6.3軟件對(duì)GO與KEGG富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理，并繪制“化合物—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖”。然后通過(guò)Cytoscape軟件的GlueGO插件獲取KEGG富集通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 核心化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接分析

從RSCB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)中獲取ONFH關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白Hypoxia-inducible factor 1-alpha(HIF-1a)和vascular endothelial growth factor A(VEGFA)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，使用Autodock Tools軟件對(duì)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行水分子刪除和加氫處理，并計(jì)算電荷，保存為pdbqt格式文件。從ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心化合物的3D結(jié)構(gòu)的Mol2格式文件，使用Autodock Tools軟件對(duì)小分子進(jìn)行平衡電荷處理，利用Pymol處理蛋白小分子結(jié)構(gòu)，并設(shè)置GirdBox，確定對(duì)接口袋，最后選擇Genetic Algorithm Parameters算法進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽(yáng)和湯主要活性成分的篩選與化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢陽(yáng)和湯化合物，依據(jù)OB≥30%，DL≥0.18，篩選出119個(gè)主要化合物。將得到的119個(gè)化合物通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，去除重復(fù)值，共得到226個(gè)作用靶點(diǎn)，借助Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖2)，其中網(wǎng)絡(luò)共有995條邊和301個(gè)節(jié)點(diǎn)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，在所有活性成分中，degree值排前六位的節(jié)點(diǎn)的化合物包括槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、油酸(oleic acid)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇 (beta-sitosterol)、甘草查爾酮A (Licochalcone A)，這些化合物在此網(wǎng)絡(luò)中具有更高自由度和更活躍的作用關(guān)系。

倒三角形節(jié)點(diǎn)為化合物，實(shí)心圓形節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)圖2 YHT化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2 YHT治療ONFH的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖3 YHT和ONFH靶點(diǎn)映射

根據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索ONFH的相關(guān)治療靶點(diǎn)，共得到284個(gè)靶點(diǎn)。借助Venny在線軟件，將YHT中主要活性成分的作用靶點(diǎn)與ONFH的靶點(diǎn)相互映射，得到40個(gè)交集靶點(diǎn)，具體內(nèi)容見表1。并繪制韋恩圖(圖3)，40個(gè)共同靶點(diǎn)即是陽(yáng)和湯治療ONFH的潛在作用靶點(diǎn)。

表1 藥物與疾病的40個(gè)潛在靶點(diǎn)信息

2.3 YHT治療ONFH的核心化合物的篩選

將YHT治療ONFH的40個(gè)潛在靶點(diǎn)，映射到相應(yīng)的化學(xué)成分上,并運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件，建立了YHT—化合物—潛在靶點(diǎn)—疾病網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4所示，為了進(jìn)一步篩選關(guān)鍵化合物和目標(biāo)，對(duì)圖3網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯玫焦?jié)點(diǎn)值(degree)、中心介度值(between centrality，BC)和緊密中心性(closeness centrality，CC)3個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，篩選標(biāo)準(zhǔn)所依據(jù)的參數(shù)是高于3個(gè)參數(shù)均值的2倍[13]，篩選出8個(gè)核心化合物，見表2。

圖4 YHT—化合物—潛在靶點(diǎn)—疾病網(wǎng)絡(luò)

表2 關(guān)鍵化合物的相關(guān)信息

2.4 潛在靶點(diǎn)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選

將化合物與疾病映射得到的40個(gè)交集靶點(diǎn)信息，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置置信度大于0.700，導(dǎo)出TSV格式文件并導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治雠c可視化處理(圖5)，該網(wǎng)絡(luò)由40個(gè)節(jié)點(diǎn)、117條邊組成。利用Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯浩骄鵧egree為21.8，大于平均degree的節(jié)點(diǎn)有20個(gè)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的degree篩選出前20個(gè)靶點(diǎn)(靶點(diǎn)信息見表3)，其中選取degree值排在前五的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)，包括IL6、TNF、TP53、VEGFA、CASP3，與ONFH直接相關(guān)的重要靶點(diǎn)包括VEGFA、CASP3、HIF-1α、IL6、TNF等。

表3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中degree值排前20的作用靶點(diǎn)信息

顏色越深代表其蛋白的相互作用越強(qiáng)，IL6、TNF、VEGFA、TP53、CASP3為PPI網(wǎng)絡(luò)的核心作用靶點(diǎn)。圖5 YHT治療ONFH潛在靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用

2.5 潛在靶點(diǎn)的GO生物功能注釋與KEGG通路富集分析

基因本體GO是生物信息學(xué)領(lǐng)域廣泛使用的本體，包含生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)，分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)40個(gè)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，選擇物種為“Home sapiens”，據(jù)P≤0.01的標(biāo)準(zhǔn)保留結(jié)果，并借助Rstudio軟件對(duì)BP、MF和CC的Pvalue值排10的條目進(jìn)行可視化分析(圖6)，其中縱坐標(biāo)表示參與富集分析的靶點(diǎn)信息，橫坐標(biāo)表示富集個(gè)數(shù)。與ONFH直接相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程BP terms涉及“凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)，血管生成的正調(diào)控(positive regulation of angiogenesis)” 。細(xì)胞組分CC terms主要涉及細(xì)胞外空間(extracellular space)和細(xì)胞外區(qū)域(extracellular region)等，與ONFH間接相關(guān)的分子功能MF包括“細(xì)胞因子活性(cytokine activity)和酶結(jié)合(enzyme binding)等”。

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)40個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，根據(jù)P<0.01保留結(jié)果，通過(guò)Rstudio軟件數(shù)據(jù)的可視化處理，獲取Pvalue排前20的KEGG通路氣泡圖(圖7)，其中HIF-1信號(hào)通路是重要低氧反應(yīng)信號(hào)，使軟骨細(xì)胞的代謝轉(zhuǎn)向節(jié)氧途徑并激活軟骨無(wú)氧酵解,以適應(yīng)缺氧環(huán)境[14]，TNF 信號(hào)通路與股骨頭壞死局部壞死性炎癥相關(guān)[15]，PI3K-Akt 信號(hào)通路參與ONFH的成骨細(xì)胞增殖和分化[16]，P53信號(hào)通路與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的細(xì)胞吞噬作用相關(guān)[17]。

BP生物學(xué)過(guò)程;MF分子功能;CC細(xì)胞組分。圖6 潛在靶點(diǎn)GO富集

通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件的GlueGO插件，獲取KEGG富集通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖8)。KEGG富集通路網(wǎng)絡(luò)圖中展示的每一個(gè)節(jié)點(diǎn)是具有代表性的富集通路，節(jié)點(diǎn)的連線反映了通路之間的共有基因數(shù)，代表了通路之間的相關(guān)性，節(jié)點(diǎn)的顏色則反映了該節(jié)點(diǎn)的富集分類情況，經(jīng)過(guò)GlueGO匯總分析，獲得了7個(gè)KEGG富集分類組，其中與股骨頭壞死相關(guān)的聚類分組有：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)，IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)，流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)。這三組聚類均可直接或間接引起股骨頭壞死性炎癥或股動(dòng)脈血流循環(huán)障礙，進(jìn)而引發(fā)股骨頭壞死。

圓點(diǎn)的面積越大，代表通路上富集的基因數(shù)目越多圖7 潛在靶點(diǎn)的KEGG通路富集

圖8 KEGG富集通路網(wǎng)絡(luò)聚類

2.6 構(gòu)建YHT治療ONFH的成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖

將潛在靶點(diǎn)、潛在靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的61個(gè)化合物與關(guān)聯(lián)的62個(gè)KEGG信號(hào)通路的關(guān)系信息，導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，構(gòu)建陽(yáng)和湯治療ONFH的成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖9)，綜合體現(xiàn)了陽(yáng)和湯“多成分—多靶點(diǎn)—多通路”對(duì)ONFH的治療干預(yù)作用，表4展示了與ONFH治療的相關(guān)重要通路與靶點(diǎn)信息，包括HIF-1信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、P53 信號(hào)通路[14-17]。

表4 ONFH相關(guān)重要通路與靶點(diǎn)信息

箭頭節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)；方塊節(jié)點(diǎn)代表KEGG通路；圓節(jié)點(diǎn)代表化合物成分。圖9 成分—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)分析得到的關(guān)鍵化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間發(fā)生相互作用的正確性，故運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬藥物結(jié)合的分子對(duì)接法，對(duì)兩者進(jìn)行幾何匹配和能量匹配的預(yù)測(cè)，并篩選出最佳的分子結(jié)合方式。HIF-1a與VEGFA是治療ONFH的關(guān)鍵蛋白[19-22]，將表2中的8個(gè)核心化合物(未從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)找到3’-Hydroxy-4’-O-Methylglabridin MOL2格式的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息)和其他4個(gè)重要化合物，與以上兩個(gè)關(guān)鍵蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能小于0代表化合物與蛋白可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越低，發(fā)生作用的可能性越大。以結(jié)合能≤-5 kcal/mol作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別選擇結(jié)合能最小的分子對(duì)接模式進(jìn)行展示。22種對(duì)接方式的結(jié)合能見表5，結(jié)果可見槲皮素與HIF-1α對(duì)接的結(jié)合能最低，豆甾醇與VEGFA對(duì)接的結(jié)合能最低，圖10顯示了這兩種對(duì)接方式的計(jì)算機(jī)模擬圖。

表5 主要化合物與HIF-1α和VEGFA蛋白的結(jié)合力

結(jié)合能小于0代表化合物與蛋白可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能越低，發(fā)生作用的可能性越大。

A 槲皮素與HIF-1α的對(duì)接模式圖，結(jié)合鍵的類型為H鍵;B 槲皮素結(jié)構(gòu)式;C 豆甾醇與VEGFA的對(duì)接模式圖，結(jié)合鍵的類型為H鍵； D 豆甾醇結(jié)構(gòu)式。圖10 兩種對(duì)接方式計(jì)算機(jī)模擬

3 討論與分析

本研究通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索到陽(yáng)和湯方中主要活性化合物119個(gè)，經(jīng)過(guò)Uniprot基因校正后，得到226個(gè)靶點(diǎn)基因。進(jìn)一步地，從方劑—化合物—潛在靶點(diǎn)—疾病網(wǎng)絡(luò)獲取了八個(gè)核心化合物分子，分別是槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇、Gancaonin B、甘草查爾酮A、shinpterocarpin、3’-Hydroxy-4’-O-Methylglabridin。從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得ONFH的284個(gè)疾病靶點(diǎn)，通過(guò)交集映射獲得陽(yáng)和湯治療ONFH的潛在作用靶點(diǎn)40個(gè)。通過(guò)對(duì)40個(gè)潛在靶點(diǎn)的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出與ONFH直接相關(guān)的重要靶點(diǎn)：VEGFA、CASP3、HIF-1α、IL-6、TNF。分子對(duì)接結(jié)果可見 quercetin與HIF-1α、Stigmasterol與VEGFA的兩種分子結(jié)合方式是最容易發(fā)生的。最后通過(guò)對(duì)40個(gè)核心靶點(diǎn)的GO功能注釋和KEGG富集分析，預(yù)測(cè)陽(yáng)和湯可能通過(guò)HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等途徑，調(diào)控ONFH進(jìn)程中的免疫炎癥反應(yīng)、骨代謝和血液循環(huán)供應(yīng)，從而達(dá)到干預(yù)治療ONFH的作用。

陽(yáng)和湯治療股骨頭壞死的潛在靶點(diǎn)中，活化胱天蛋白酶(caspase)3在成骨細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,與骨形成密切相關(guān)。caspase 等多種與骨細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因,導(dǎo)致ONFH[18]。HIF-1α對(duì)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)起著重要作用，HIF-1α可能激活部分下游基因,使軟骨細(xì)胞的代謝轉(zhuǎn)向節(jié)氧途徑并激活軟骨無(wú)氧酵解,以適應(yīng)缺氧環(huán)境[19]。VEGF水平上調(diào)后與其受體結(jié)合,啟動(dòng)VEGF下游通路,進(jìn)而調(diào)控ONFH區(qū)血管新生。主要體現(xiàn)于兩方面：VEGF調(diào)控破骨細(xì)胞能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成血管作用，VEGF還介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移,對(duì)于壞死區(qū)域血管新生至關(guān)重要[20-22]。

陽(yáng)和湯治療股骨頭壞死的機(jī)制，主要是通過(guò)影響骨質(zhì)代謝、血液循環(huán)、炎癥與免疫調(diào)節(jié)等三方面來(lái)發(fā)揮藥理作用，基于KEGG通路富集和GO功能注釋發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)和湯方治療ONFH的通路富集結(jié)果顯示，其核心靶點(diǎn)基因參與的通路主要涉及：調(diào)節(jié)骨代謝的PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)；調(diào)節(jié)機(jī)體“免疫-炎癥系統(tǒng)”平衡的TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)；與血液循環(huán)供應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路包括HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)，血管生成的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of angiogenesis)。

血管生成在ONFH疾病修復(fù)過(guò)程中起著重要作用[23]，HIF-1α已被證明是最主要的組織缺氧的調(diào)節(jié)因子[24]。HIF-1信號(hào)通路與VEGF信號(hào)通路在ONFH中呈現(xiàn)互相調(diào)節(jié)作用，骨組織的缺血缺氧使得HIF-1α激活和表達(dá)，HIF-1α激活的靶點(diǎn)包括：VEGF、一氧化氮合成酶(NOS)、促紅細(xì)胞生成素(Epo)。VEGF可表達(dá)在生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞中，可調(diào)控原始松質(zhì)骨中血管的生成；Epo是強(qiáng)有力的造血生長(zhǎng)因子,除外誘導(dǎo)形成成熟的紅細(xì)胞集落，還可激活成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞增殖[25]，并直接促進(jìn)小鼠骨折模型的骨痂形成及軟組織修復(fù)[26]；HIF-1α還可激活NOS的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)血管生成和血管舒張[27]。股骨頭局部缺血損傷后，骺軟骨是HIF-1途徑激活的作用位點(diǎn)，并參與了血液重建[28]。此外，研究[29]發(fā)現(xiàn)HIF-1α轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能在兔股骨頭內(nèi)，促進(jìn)血管新生和BMCs的成骨分化能力。因此預(yù)測(cè)陽(yáng)和湯可通過(guò)HIF-1信號(hào)通路，促進(jìn)股骨頭供血?jiǎng)用}的舒張和吻合支的生成，來(lái)干預(yù)股骨頭壞死的進(jìn)程。

PI3K-Akt信號(hào)通路是骨質(zhì)恢復(fù)再生的重要信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的增殖分化而促進(jìn)骨重塑的過(guò)程。PI3K-Akt信號(hào)通路在增加成骨細(xì)胞增殖活性的同時(shí),也可通過(guò)糖原合成激酶3β實(shí)現(xiàn)對(duì)Wnt/β-catenin的調(diào)控，從而加強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化增殖[30]。有研究發(fā)現(xiàn)減弱PI3K-Akt信號(hào)通路能抑制成骨細(xì)胞的增殖,但能增加成骨細(xì)胞的分化[31]。 此外，PI3K-Akt信號(hào)通路可通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞釋放兩種關(guān)鍵的因子M-CSF和RANKL，來(lái)觸發(fā)破骨細(xì)胞分化，當(dāng)RANKL結(jié)合受體后,下游信號(hào)(NF-κB、JNK、p38 MAPK)會(huì)被激活誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化。而c-fos、活化T細(xì)胞核因子1等可通過(guò)調(diào)控下游激酶(NF-κB、p38 MAPK)的表達(dá)對(duì)破骨細(xì)胞的分化造成影響，下游激酶(NF-κB、p38 MAPK)通過(guò)被c-fos、活化T細(xì)胞核因子1的調(diào)控，而表達(dá)對(duì)破骨細(xì)胞的分化的影響[32-33]。故預(yù)測(cè)陽(yáng)和湯或可通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路，調(diào)控髖關(guān)節(jié)骨質(zhì)代謝，促進(jìn)壞死骨質(zhì)的代謝和新骨的再生。