何 諾 謝林森 董 麗 任江龍

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450007

腦梗死占全部腦血管病的60%～80%，是中老年人致殘、致死的主要病因，且近年來發(fā)病率呈遞增趨勢，極大危害患者生命健康，加強對其研究意義重大[1-2]。溶栓是腦梗死的重要治療策略，能及時恢復(fù)腦部血流灌注，挽救缺血半暗帶腦組織，但長期臨床工作經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，不同個體對溶栓治療反應(yīng)性不同，獲得預(yù)后效果亦不盡相同，而造成這一現(xiàn)象的原因與機制目前尚未闡明[3]。小而密低密度脂蛋白膽固醇(small and dense low density lipoprotein cholesterol，sdLDL)為低密度脂蛋白膽固醇亞組分之一，在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，是腦卒中的危險因子，但是否會影響溶栓治療效果仍不明確[4]。微小RNA-424(microRNA-424，miR-424)屬于微小RNA-16家族成員，對細(xì)胞周期、細(xì)胞表型具有調(diào)控作用，過表達(dá)的miR-424能靶向趨化因子配體16，減輕氧葡萄糖剝奪對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞造成的損傷，在缺血性腦卒中中起潛在的保護作用，故推測可能與腦梗死溶栓治療效果及預(yù)后有關(guān)[5-6]。胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)是由70個氨基酸組成的單鏈多肽，具有調(diào)節(jié)代謝、促細(xì)胞增殖等廣泛的生物學(xué)作用，低表達(dá)的IGF-1與高血壓、腦血管事件發(fā)生有關(guān)，并且是腦卒中后體力活動程度的獨立影響因素，但與腦梗死溶栓治療預(yù)后效果關(guān)聯(lián)性的研究較少[7-9]。本研究選取129例腦梗死患者，探討血清sdLDL、miR-424、IGF-1表達(dá)與腦梗死溶栓治療預(yù)后效果的關(guān)聯(lián)性及預(yù)測價值。

1 資料和方法

1.1一般資料選取2018-03—2020-02鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院治療的129例腦梗死患者為研究對象，年齡46～83(65.01±8.76)歲；女60例，男69例；體重指數(shù)20～25(22.39±1.10)kg/m2；大面積腦梗死35例，中面積腦梗死41例，小面積腦梗死53例；不穩(wěn)定斑塊患者69例，穩(wěn)定斑塊患者60例。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：符合腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；首次發(fā)生腦梗死；入組前未接受過抗凝、溶栓等相關(guān)治療；發(fā)病至入院時間<4.5 h。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：腦出血患者；入組前3個月有泌尿系統(tǒng)、消化道出血史及大型手術(shù)史者；短暫性腦缺血發(fā)作者；入組前接受過相關(guān)治療者；有出血傾向者；合并急性感染類疾病者；急性心包炎者；肝、腎功能嚴(yán)重障礙者。

1.3方法

1.3.1 主要試劑、儀器：sdLDL試劑盒公司(浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司)；IGF-1試劑盒公司(上海仁捷生物)；PCR試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)；引物合成(北京擎科)；實時定量PCR儀(美國ABI7500)。

1.3.2 sdLDL、miR-424、IGF-1檢測方法：于溶栓治療前抽取患者肘部靜脈血5 mL，以15 cm半徑，3 000 r/min離心10 min，分離上清待測。采用直接清除法檢測血清sdLDL，采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測血清IGF-1，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。采用實時定量PCR檢測血清miR-424表達(dá)，應(yīng)用Trizol試劑提取總RNA，采用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR定量試劑盒及實時定量PCR儀進行反應(yīng)，內(nèi)參U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-424正向引物：5′-GGCTAGTCAGCAGCAAT TCATGT-3′；反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGA GGT-3′；反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，40個循環(huán)，檢測基因相對表達(dá)量=2-△△Ct。

1.3.3 溶栓治療：入組者均接受靜脈溶栓治療。阿替普酶(Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG，批注文號S20160055)0.9 mg/kg，10%劑量在最初1 min內(nèi)靜脈推注，剩余劑量在1 h內(nèi)靜滴，并密切關(guān)注患者生命體征變化，酌情給予吸氧、脫水、腦保護劑等對應(yīng)治療，24 h后復(fù)查頭部CT，無出血后予以阿司匹林100 mg/次，1次/d，口服治療，并長期維持。

1.3.4 療效標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale，NIHSS)[11]評估臨床療效，基本痊愈：NIHSS評分降低91%～100%；好轉(zhuǎn)：NIHSS評分降低46%～90%；進步：NIHSS評分降低18%～45%；無效：未至上述標(biāo)準(zhǔn)?；救?好轉(zhuǎn)為療效良好，其余為療效不佳。

1.3.5 預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)溶栓30 d后采用改良的Rankin量表(modified Rankin Scale，mRS)評分[12]評估腦梗死患者預(yù)后，0～2分為預(yù)后良好，3～5分為預(yù)后不良。

1.4觀察指標(biāo)(1)比較不同腦梗死面積患者血清sdLDL、miR-424、IGF-1水平。(2)比較不同斑塊性質(zhì)患者血清sdLDL、miR-424、IGF-1水平。(3)比較不同溶栓效果患者血清sdLDL、miR-424、IGF-1水平。(4)比較不同溶栓預(yù)后患者血清sdLDL、miR-424、IGF-1水平。(5)分析sdLDL、miR-424、IGF-1預(yù)測腦梗死預(yù)后的截斷值、敏感度、特異度。(6)分析預(yù)后不良患者sdLDL、miR-424、IGF-1間的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果

2.1不同腦梗死面積患者各指標(biāo)水平比較不同腦梗死面積患者血清sdLDL、miR-424、IGF-1表達(dá)存在顯著差異(P<0.05)，且隨腦梗死面積增大，miR-424、IGF-1水平持續(xù)降低，sdLDL表達(dá)水平持續(xù)增高(P<0.05)。見表1。

2.2不同斑塊性質(zhì)患者各指標(biāo)水平比較不穩(wěn)定斑塊腦梗死患者miR-424、IGF-1水平低于穩(wěn)定斑塊患者，sdLDL表達(dá)水平高于穩(wěn)定斑塊患者(P<0.05)。見表2。

2.3不同溶栓效果患者各指標(biāo)水平比較療效良好者miR-424、IGF-1水平高于療效不佳者，sdLDL水平低于療效不佳者(P<0.05)。見表3。

2.4不同溶栓預(yù)后患者各指標(biāo)水平比較預(yù)后良好者miR-424、IGF-1水平高于預(yù)后不良者，sdLDL水平低于預(yù)后不良者(P<0.05)。見表4。

表1 不同腦梗死面積患者各指標(biāo)水平比較Table 1 Index levels of patients with different cerebral infarction

表2 不同斑塊性質(zhì)患者各指標(biāo)水平比較Table 2 Index levels of patients with different plaque

表3 不同溶栓效果患者各指標(biāo)水平比較Table 3 Index levels of patients with different thrombolytic

表4 不同溶栓預(yù)后患者各指標(biāo)水平比較

2.5sdLDL、miR-424、IGF-1對腦梗死預(yù)后的預(yù)測價值預(yù)測腦梗死預(yù)后不良的AUC、截斷值、敏感度、特異度：sdLDL分別為0.787(95%CI：0.707～0.854)、>2.38 mmol/L、81.25%、70.80%；miR-424分別為0.806(95%CI：0.727～0.870)、≤6.61、93.75%、61.06%；IGF-1分別為0.751(95%CI：0.667～0.823)、≤106.25 ng/mL、81.25%、64.60%(P<0.05)；sdLDL+miR-424+IGF-1預(yù)測腦梗死預(yù)后不良的AUC、敏感度、特異度依次為0.896(95%CI：0.830～0.943)、75.00%、92.92%(P<0.05)。見圖1～2。

圖1 各指標(biāo)單獨預(yù)測ROC曲線Figure 1 The ROC curve predicted by each indicator separately

圖2 各指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測ROC曲線Figure 2 The ROC curve predicted by each indicator jointly

2.6預(yù)后不良患者sdLDL、miR-424、IGF-1間的關(guān)聯(lián)性腦梗死預(yù)后不良患者sdLDL水平與miR-424、IGF-1存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，miR-424與IGF-1間存在正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。見圖3～5。

3 討論

微小RNA是18～25個核酸組成的短單鏈RNA，主要通過與3’非編碼區(qū)發(fā)生序列互補，以抑制轉(zhuǎn)錄或降解微小RNA，亦可靶向5’非編碼區(qū)與外顯子，并能與DNA序列發(fā)生堿基配對，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄[13-14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)部分微小RNA參與缺

圖3 sdLDL與miR-424的相關(guān)性Figure 3 Correlation between sdLDL and miR-424

圖4 sdLDL與IGF-1的相關(guān)性Figure 4 Correlation between sdLDL and IGF-1

圖5 miR-424與IGF-1的相關(guān)性Figure 5 Correlation between miR-424 and IGF-1

血性腦卒中的發(fā)病，并能影響患者預(yù)后，故成為臨床研究的熱點[15]。本研究顯示miR-424大面積腦梗死<中面積腦梗死<小面積腦梗死，不穩(wěn)定斑塊腦梗死患者miR-424水平低于穩(wěn)定斑塊患者，提示miR-424與斑塊性質(zhì)和腦梗死面積有關(guān)，可能是腦梗死的一種保護因子。在缺血性腦卒中動物模型中miR-424呈低表達(dá)，并伴神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而采用一定措施上調(diào)miR-424表達(dá)，可減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[16]，且MiR-424可通過轉(zhuǎn)錄因子NFIA信號傳導(dǎo)，增強抑制性修飾的組蛋白3賴氨酸27三甲基化，從而防止小鼠腦缺血/再灌注后發(fā)生星形膠質(zhì)變[17]，均證實了MiR-424在腦梗死中起保護作用。一方面，MiR-424通過靶向細(xì)胞周期蛋白，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和激活，從而預(yù)防腦梗死；另一方面，MiR-424與梗死體積呈負(fù)相關(guān)，能通過淋巴細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6途徑，抑制中性粒細(xì)胞的外周炎癥反應(yīng)，降低急性腦梗死的嚴(yán)重程度，故呈現(xiàn)出保護因子作用[18]。同時本研究發(fā)現(xiàn)療效良好者miR-424高于療效不佳者，預(yù)后良好者miR-424高于預(yù)后不良者，表明miR-424還與腦梗死溶栓治療效果及預(yù)后有關(guān)。miR-424能在低氧條件下介導(dǎo)血管新生，能促進腦梗死后血管重建，并能減輕血管內(nèi)皮功能的損傷，抑制頸動脈再狹窄，從而增加腦部血流供應(yīng)，增強溶栓效果，改善患者預(yù)后[19-20]。進一步的ROC分析顯示miR-424預(yù)測腦梗死預(yù)后不良的AUC為0.806，呈現(xiàn)出較高的預(yù)測價值，當(dāng)截斷值≤6.61時，有足夠的證據(jù)(敏感度、特異度分別為93.75%、61.06%)提示患者預(yù)后不良。

IGF-1受垂體生長激素的調(diào)控，大部分由肝臟分泌，以內(nèi)分泌的形式釋放入血，IGF-1的生物學(xué)作用受IGF結(jié)合蛋白及IGF-1受體的調(diào)節(jié)[21]。本研究顯示大面積腦梗死患者IGF-1<中面積腦梗死患者IGF-1<小面積腦梗死患者IGF-1，不穩(wěn)定斑塊腦梗死患者IGF-1水平低于穩(wěn)定斑塊患者，提示IGF-1與斑塊性質(zhì)和腦梗死面積有關(guān)，對腦梗死的發(fā)病及病情具有保護作用。SHAHEEN等[22]研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者IGF-1顯著低于正常人群，血清IGF-1水平降低是缺血性腦卒中的獨立危險因素，從側(cè)面證實IGF-1對腦梗死發(fā)病的保護作用。IGF-1作為一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，能促進神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂和分化，調(diào)節(jié)突觸及軸突髓鞘的形成，參與神經(jīng)功能的維持和調(diào)節(jié)，且在缺氧缺血狀態(tài)下，IGF-1能降低血糖水平，抑制蛋白質(zhì)分解，保護神經(jīng)元免受氨基酸和高血糖毒性損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[23]。同時本研究發(fā)現(xiàn)療效良好者IGF-1水平高于療效不佳者，預(yù)后良好者IGF-1水平高于預(yù)后不良者，說明IGF-1與溶栓治療效果及預(yù)后有關(guān)。與健康人群相比，腦卒中患者IGF-1功能受損，檢測入院時IGF-1可作為腦卒中恢復(fù)情況的生物標(biāo)志物[24]。本研究后續(xù)ROC分析發(fā)現(xiàn)IGF-1預(yù)測腦梗死預(yù)后不良的AUC為0.751，低于miR-424，可為臨床選取合適指標(biāo)預(yù)測腦梗死患者預(yù)后提供參考。

sdLDL對血管壁具有高侵入性，對氧化具有較低耐受性，對低密度脂蛋白受體具有低親和性，并在血漿中擁有更長的停留時間，故有更強的致動脈粥樣硬化作用[25]。本研究顯示大面積腦梗死患者sdLDL>中面積腦梗死患者sdLDL>小面積腦梗死患者sdLDL，不穩(wěn)定斑塊腦梗死患者sdLDL表達(dá)水平高于穩(wěn)定斑塊患者，與QIAO等[26]研究相似，提示sdLDL可能作為一個危險因素參與了腦梗死的發(fā)病及病情進展。sdLDL可侵入血管壁，介導(dǎo)血管局部的炎癥反應(yīng)，降低斑塊穩(wěn)定性，并損傷血管內(nèi)皮，促進血小板的聚集，增加急性腦血管病發(fā)生風(fēng)險，且由于其與低密度脂蛋白受體親和力較低，不易被快速結(jié)合清除，從而長期、慢性作用于血管壁與血管內(nèi)皮，參與腦梗死的發(fā)病[27]。本研究顯示療效良好者sdLDL水平低于療效不佳者，預(yù)后良好者sdLDL水平低于預(yù)后不良者，提示sdLDL與腦梗死靜脈溶栓效果及預(yù)后有關(guān)。sdLDL影響靜脈溶栓效果的機制可能與降低復(fù)流率有關(guān)，而影響患者預(yù)后的機制除與降低復(fù)流率有關(guān)外，還與其介導(dǎo)的動脈粥樣硬化，可能再次引發(fā)急性腦梗死有關(guān)。進一步的ROC分析顯示，sdLDL預(yù)測腦梗死預(yù)后不良的AUC、截斷值、敏感度、特異度為0.787，低于miR-424，且低于sdLDL+miR-424+IGF-1預(yù)測AUC的0.896，提示聯(lián)合檢測sdLDL、miR-424、IGF-1可提高預(yù)后預(yù)測效能，具有更高的可靠性。同時預(yù)后不良患者sdLDL水平與miR-424、IGF-1呈負(fù)相關(guān)，miR-424與IGF-1呈正相關(guān)，表明3個指標(biāo)可相互影響，共同參與腦梗死的發(fā)病和病情進展，并影響患者預(yù)后。

血清sdLDL、miR-424、IGF-1表達(dá)與腦梗死斑塊性質(zhì)、梗死面積、溶栓治療效果、預(yù)后有關(guān)，并能相互影響參與腦梗死發(fā)病與病情的進展，檢測三者表達(dá)有望成為預(yù)測患者預(yù)后新的生物標(biāo)志物。本研究不足之處在于，未具體明確各指標(biāo)鑒別不同斑塊性質(zhì)、不同梗死面積的價值，有待后續(xù)的進一步分析。