陳華強(qiáng)

(廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司,廣東 肇慶 516100)

腺苷(Adenosine)是人體細(xì)胞的一種內(nèi)源性嘌呤核苷。在生理生化過程中起著重要的調(diào)控作用,在神經(jīng)傳遞中起重要作用[1-2];也是合成腺嘌呤、三磷酸腺苷(ATP)和阿糖腺苷的重要中間體,在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。有研究表明:枯草芽孢桿菌添加檸檬酸鈉,可降低糖耗速度,明顯降低丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的酶活,減少了糖酵解途徑的通量,增加了HMP途徑的通量[3-4],提高了腺苷的產(chǎn)量。另外,由微生物的補(bǔ)救途徑[5]推測,次黃嘌呤作為腺苷合成前體物,在發(fā)酵過程添加次黃嘌呤可提高腺苷生產(chǎn)得率。筆者研究發(fā)酵培養(yǎng)基中檸檬酸鈉和次黃嘌呤的添加量及添加方式對其生產(chǎn)腺苷的影響,通過工藝優(yōu)化,提高了腺苷發(fā)酵水平。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌 種

AR090(Bacillussubtilis,組氨酸和黃嘌呤缺陷)廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司腺苷生產(chǎn)菌株。

1.1.2 培 養(yǎng) 基

斜面培養(yǎng)基:牛肉膏10 g/L,酵母膏5 g/L,蛋白胨4 g/L,NaCl 2.5 g/L,瓊脂25 g/L,pH 7～7.2,0.1 MPa,滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母浸膏20 g/L,KH2PO43 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,MnSO4·7H2O 0.01 g/L,MgSO4·7H2O 0.3 g/L,(NH4)2SO45 g/L,黃嘌呤0.03 g/L,0.1 MPa,滅菌20 min。

搖瓶培養(yǎng)基:葡萄糖80 g/L,(NH4)2SO415 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,KH2PO41.2 g/L,玉米漿膏100 g/L,酵母浸粉30 g/L,黃嘌呤0.05 g/L,pH 7～7.2,0.1 MPa,滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖140 g/L,(NH4)2SO45 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,KH2PO41.2 g/L,玉米漿膏120 g/L,酵母浸粉50 g/L,黃嘌呤0.05 g/L,pH 7～7.2,0.1 MPa,滅菌20 min。

1.1.3 儀器和設(shè)備

5 L自控發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備有限公司,配備pH和DO電極各1支;722N型分光光度計:上海精密科學(xué)儀器有限公司;SBA-40E生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所;Agilent 1200高效液相色譜儀,美國Agilent公司。

1.2 培養(yǎng)方法

菌種培養(yǎng):取甘油種劃線于斜面培養(yǎng)基,32 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 h,待用。

種子液的制備:將斜面種用無菌水洗脫,接種于5 L自控罐,裝液量3 L∶5 L,培養(yǎng)溫度34 ℃,pH為7,DO控制在體積分?jǐn)?shù)30%左右培養(yǎng)9～10 h。

發(fā)酵培養(yǎng):按10%接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度36 ℃,流加氨水控制pH為7,DO控制在體積分?jǐn)?shù)30%左右培養(yǎng)48 h。

搖瓶培養(yǎng):250 mL三角瓶裝培養(yǎng)基20 mL,接入10%種子液,培養(yǎng)溫度34 ℃,轉(zhuǎn)速180 r/min,搖床培養(yǎng)48 h。

1.3 分析方法

菌體質(zhì)量濃度的測定:用722N分光光度計測定600 nm波長的吸光度。

測定細(xì)胞干重:取5 mL發(fā)酵液,3 000 r/min離心,把沉淀在100 ℃下烘至恒重,稱重。

葡萄糖質(zhì)量濃度的測定:采用SBA-40E生物傳感器進(jìn)行檢測發(fā)酵上清液。

腺苷產(chǎn)量的測定:參考文獻(xiàn)[6-9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 檸檬酸鈉對腺苷發(fā)酵的影響

張鑫喆等[7-8]研究表明:添加檸檬酸鹽能增加HMP途徑的碳流量,有利于核苷類物質(zhì)的合成。通過搖瓶試驗(yàn),在發(fā)酵培養(yǎng)基添加2 g/L的檸檬酸鈉,每隔4 h取樣檢測,觀察檸檬酸鈉對細(xì)胞生長、腺苷產(chǎn)量及葡萄糖消耗速度的影響如圖1所示。由圖1可知:添加檸檬酸鈉提高了腺苷的發(fā)酵水平,48 h時比不添加檸檬酸鈉的腺苷產(chǎn)量提高了27.8%。與此同時,發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗速度降低,48 h的殘?zhí)菫?.5 g/L,對比原工藝,其48 h的殘?zhí)菫?.7 g/L,對菌體生長影響不明顯。

圖1 添加檸檬酸鈉對腺苷發(fā)酵的影響Fig.1 The effect of sodium citrate on cell growth, adenosine production and glucose consumption rate

2.2 添加檸檬酸鈉對腺苷發(fā)酵的影響

通過搖瓶試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,比較腺苷的葡萄糖得率系數(shù)、葡萄糖比消耗速率和腺苷比生成速率,其結(jié)果如表1所示。添加檸檬酸鈉的工藝的腺苷比生成速率比對照工藝要大,葡萄糖比消耗速率相對較小,說明添加檸檬酸鈉時能增加HMP途徑的碳流量,有利于提高腺苷產(chǎn)量和糖苷轉(zhuǎn)化率。

表1 添加檸檬酸鈉對腺苷產(chǎn)量和耗糖影響

綜合表1數(shù)據(jù)分析,在5 L發(fā)酵自控罐添加檸檬酸鈉進(jìn)行工藝實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基檸檬酸鈉的添加量為2 g/L,對比發(fā)酵過程的產(chǎn)量、OD600和葡萄糖質(zhì)量濃度如圖2所示。添加檸檬酸鈉發(fā)酵批次的腺苷產(chǎn)量為26.5 g/L,相對于不添加檸檬酸鈉的產(chǎn)量(22.3 g/L)提高了18.83%,且葡萄糖消耗速度相對較慢,轉(zhuǎn)化率得到了提高,但對細(xì)胞生長沒有影響,與搖瓶試驗(yàn)結(jié)果一致。

圖2 5 L發(fā)酵罐試驗(yàn)對比Fig.2 Comparison of adenosine fermentation test in 5 L fermentor

2.3 添加次黃嘌呤對腺苷發(fā)酵的影響

由微生物的補(bǔ)救途徑[5]推測,次黃嘌呤作為腺苷合成前體物,在發(fā)酵過程添加次黃嘌呤可提高腺苷生產(chǎn)得率。試驗(yàn)設(shè)計在腺苷發(fā)酵24 h后,進(jìn)行添加次黃嘌呤的搖瓶試驗(yàn)。由圖3可知:在24 h和36 h后,分2次添加次黃嘌呤腺苷,添加3 g/L的次黃嘌呤的腺苷產(chǎn)量最高,可達(dá)14.9 g/L,比優(yōu)化前(11.6 g/L)提高了28.45%。

在5 L發(fā)酵自控罐添加次黃嘌呤和檸檬酸鈉的腺苷進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計培養(yǎng)基添加檸檬酸鈉,發(fā)酵過程添加前體物次黃嘌呤,可進(jìn)一步提高腺苷的生產(chǎn)效率。發(fā)酵培養(yǎng)基添加為2 g/L檸檬酸鈉,發(fā)酵過程在24 h和36 h分別加入次黃嘌呤3 g/L,測定發(fā)酵液的腺苷產(chǎn)量、OD600和葡萄糖質(zhì)量濃度如圖4所示。添加檸檬酸鈉和次黃嘌呤的發(fā)酵工藝腺苷的產(chǎn)量為31.1 g/L,對比原發(fā)酵工藝(22.3 g/L)提高了39.46%,糖苷轉(zhuǎn)化率提高了35%以上;對比只添加檸檬酸鈉的發(fā)酵工藝(26.5 g/L),也提高了17.36%。

圖3 不同質(zhì)量濃度次黃嘌呤對腺苷發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of different concentrations of hypoxanthine on adenosine fermentation

圖4 添加次黃嘌呤和檸檬酸鈉的腺苷發(fā)酵工藝Fig.4 Fermentation process of adenosine supplemented with hypoxanthine coupled with sodium citrate

3 結(jié) 論

添加檸檬酸鈉和次黃嘌呤的發(fā)酵工藝明顯提高了腺苷產(chǎn)量,糖苷轉(zhuǎn)化率也相應(yīng)得到了提高。添加檸檬酸鈉使EMP途徑的葡萄糖代謝通量減少,必然增加了HMP途徑中葡萄糖代謝的通量,從而提高發(fā)酵的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率,筆者試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[3-4]相同。研究表明:培養(yǎng)基添加檸檬酸鈉(2 g/L)工藝,腺苷的產(chǎn)量為26.5 g/L,相對于不添加檸檬酸鈉的產(chǎn)量(22.3 g/L)提高了18.83%;進(jìn)一步提出了添加檸檬酸鈉并補(bǔ)充次黃嘌呤前體的發(fā)酵工藝,對比原發(fā)酵工藝,腺苷的產(chǎn)量提高了39.46%,糖苷轉(zhuǎn)化率提高了35%以上。