俞 敏,謝王玲,夏元丹,章銀軍

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310014)

果膠低聚糖(POS)是一種新型功能性糖源,通常由2～20個半乳糖醛酸通過α-1,4-糖苷鍵連接而成[1],部分半乳糖醛酸也以甲酯形式存在[2]。研究表明:其具有良好的生理活性,例如抑制尿路致病微生物生長[3],促進(jìn)人類結(jié)腸腺癌細(xì)胞凋亡[4],抗肥胖、抗毒性、抗感染、抗菌和抗氧化作用[5]。POS可以通過酸水解、氧化法和化學(xué)合成法等化學(xué)法制備得到[6],也可以通過酶作用于特定原料制備得到[7]。相比于化學(xué)法,酶降解法具有選擇性好、副反應(yīng)少和操作方便等優(yōu)勢[8]。果膠裂解酶(PL)作為果膠解聚酶的一種,可通過催化果膠半乳糖醛酸殘基的C-4和C-5發(fā)生氫的反式消去反應(yīng)來完成糖苷鍵裂解,產(chǎn)生不飽和果膠低聚糖(UPO),其富含的不飽和雙鍵對低聚糖產(chǎn)物的生物活性具有顯著影響[9]。目前,國內(nèi)外對果膠低聚糖的研究主要體現(xiàn)在植物體促生長誘導(dǎo)活性和動物體促雙歧桿菌增殖、減毒抗癌方面[10],對于其抑菌活性的研究很少,但已有研究表明POS對常見細(xì)菌具有明顯的抑菌效果[11-12]。因此,研究POS的抑菌性及其與一般市售防腐劑的復(fù)配有利于開發(fā)新的抑菌防腐劑,為食品防腐提供有價值的天然抑菌防腐劑。

桔皮果渣是一種常見的農(nóng)廢資源,其果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖然高達(dá)20%[13],但因其含水率和酸度較高,極易造成微生物迅速繁殖,如不及時處理,不僅容易造成嚴(yán)重的環(huán)境污染,也會產(chǎn)生大量的資源浪費(fèi)[14-15]。本研究通過單因素及正交試驗優(yōu)化PL酶解桔皮果渣提取UPO工藝,并對UPO進(jìn)行單一和復(fù)配抑菌活性研究,實現(xiàn)桔皮果渣的高效增值和可持續(xù)發(fā)展,也為天然抑菌防腐劑的開辟提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)均由本實驗室提供。

細(xì)菌培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基):牛肉膏3 g;蛋白胨10 g;氯化鈉5 g;瓊脂15～20 g;水1 000 mL;pH 7.0～7.2;121 ℃下滅菌20 min。

1.1.2 其他材料與試劑

桔皮,衢州果膠有限公司;果膠裂解酶酶液(酶活4 000 U/mL;酶活單位定義(U):在40 ℃,pH 6.8條件下,每分鐘水解1%果膠,使235 nm處吸光值增加0.01的酶量定義為1個果膠裂解酶酶活單位,酶活力單位由U/mL表示),本實驗室自備;活性干酵母,安琪酵母股份有限公司;DNS試劑[16]:稱取182 g酒石酸鉀鈉,加蒸餾水定容至500 mL,加熱溶解后于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3 g,氫氧化鈉21.0 g,苯酚5.0 g,無水亞硫酸鈉5.0 g,加熱攪拌至全部溶解,加水稀釋至1 000 mL,儲于棕色瓶中,7～10 d后使用;所有試劑均為分析純,上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外可見分光光度儀,日本島津公司;ZHWY-2112B型恒溫?fù)u床,上海智城分析儀器制造有限公司;10/5/3/1 kDa超濾膜,美國Millipore公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不飽和果膠低聚糖(UPO)的酶法提取及質(zhì)量濃度測定

將新鮮桔皮于沸水中煮沸10 min滅原酶活,過濾烘干,用高速粉碎機(jī)粉碎成粉末后過50目篩備用。取10 g干桔皮粉末加入水100 mL,用4 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為1.2,水浴恒溫85 ℃條件下加熱1 h后用兩層紗布過濾溶液,調(diào)節(jié)溶液(果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%)pH后加入果膠裂解酶液,于搖床中反應(yīng)一段時間后離心過濾得到桔皮果渣酶解粗提液。采用DNS法[17]測定還原糖質(zhì)量濃度,利用紫外可見分光光度儀測定235 nm下的吸光值。還原糖得率計算公式為

式中:C1為果渣中果膠質(zhì)量濃度,μg/mL;C2為酶解液中還原糖質(zhì)量濃度,μg/mL;V1為酶解前液體體積,mL;V2為酶解后液體體積,mL。

1.3.2 酶法提取UPO條件優(yōu)化

單因素試驗:以酶解液中還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗,分別研究pH(3.2,4.2,5.2,6.2,7.2)、酶解溫度(30,40,45,50,60 ℃)、反應(yīng)時間(1,3,5,7,9 h)和酶添加量(添加量20,40,80,120,160 U/mL)對酶解液中還原糖質(zhì)量濃度的影響。

正交試驗:選取影響還原糖質(zhì)量濃度的4個因素(pH、酶添加量、酶解溫度、反應(yīng)時間),以酶解液中還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo)進(jìn)行四因素三水平的正交試驗,其結(jié)果如表1所示。

表1 正交試驗設(shè)計表

1.3.3 UPO的分離純化

在酶解液中添加2%的活化安琪酵母,于30 ℃下發(fā)酵反應(yīng)24 h,除去酶解液中部分單糖,離心后取上清液,向其緩慢倒入95%乙醇溶液直至溶液乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%,靜置24 h,沉淀多聚寡糖。經(jīng)酵母發(fā)酵、乙醇沉淀初步處理后的酶解液通過分子質(zhì)量(Mw)分別為1,3,5,10 kDa的超濾膜繼續(xù)分離,得到5種不同分子質(zhì)量段的酶解濾液U1(010 kDa)。

1.3.4 抑菌活性測定

試驗菌株經(jīng)活化培養(yǎng)后,用已滅過菌的移液管移取10 mL無菌生理鹽水至斜面試管內(nèi),在無菌操作條件下用接種環(huán)小心將菌苔洗下。倒入帶有玻璃珠的燒瓶內(nèi),將菌懸液打散,保證活菌數(shù)的均一性,稀釋得到活菌數(shù)為1×107～1×108cfu/mL的菌懸液。

1) 不同分子質(zhì)量段的UPO的抑菌活性測定

采用牛津杯法[18]測定不同分子質(zhì)量段UPO的抑菌圈直徑。首先吸取0.2 mL菌懸液至無菌固體培養(yǎng)基平板上,并用無菌涂布棒涂布均勻,然后將3個無菌牛津杯平穩(wěn)放置于培養(yǎng)基表面上,保證各牛津杯之間距離相當(dāng)。用移液槍移取200 μL配置好的一定濃度的UPO溶液至牛津杯中,以pH 6.8的緩沖液作為空白對照。每個分子質(zhì)量段低聚糖溶液重復(fù)做3次,最后將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)皿測量抑菌圈直徑大小,并取3組實驗值的平均值作為記錄。

2) UPO與市售防腐劑的復(fù)配實驗

取抑菌效果最佳分子質(zhì)量段的UPO(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%)與市售防腐劑(山梨酸鉀、苯甲酸鈉和乳酸鏈球菌素;質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%)以1∶1體積比復(fù)配,比較復(fù)配抑菌劑與單一組分抑菌劑的抑菌效果。采用牛津杯法測定抑菌圈直徑。由于一般食品防腐劑均在酸性條件下具備良好的抑菌活性[19],故本實驗抑菌劑均于pH 4.2的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中溶解,同時以pH 4.2的緩沖液作為空白對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶法提取UPO條件優(yōu)化

果膠裂解酶(PL)通過β-消除反應(yīng)作用于果膠底物,在新形成的非還原性末端的C-4和C-5原子間形成一個雙鍵,該產(chǎn)物在235 nm處存在最大光吸收值。此外,PL在降解果膠的過程中,先降解成不飽和多聚寡糖,再解聚為不飽和低聚寡糖和部分單糖,因此,酶解液中還原糖質(zhì)量濃度的多少可以作為果膠水解程度的參考指標(biāo)如圖1所示。

由圖1(a)可知:酶添加量為20～40 U/mL時,還原糖質(zhì)量濃度增加較快;酶添加量為40～120 U/mL時,還原糖質(zhì)量濃度增加緩慢;酶添加量為120～160 U/mL時,還原糖質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定。反應(yīng)時間越長,底物濃度越低,水解產(chǎn)物增多,不利于酶解反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行[20]。因此,酶添加量達(dá)到一定值時,還原糖質(zhì)量濃度上升速度變慢,逐漸趨于平穩(wěn),考慮后續(xù)生產(chǎn)成本因素,確定PL酶添加量為120 U/mL。由圖1(b)可知:當(dāng)pH上升至6.2時,還原糖質(zhì)量濃度最大,達(dá)到880 μg/mL,之后呈下降趨勢。由圖1(c)可知:PL酸酶法水解桔皮果渣的適宜溫度在40～50 ℃,當(dāng)溫度為45 ℃時,還原糖質(zhì)量濃度達(dá)到最高785 μg/mL,隨后還原糖質(zhì)量濃度隨溫度升高逐漸減少,引起這一結(jié)果的原因是PL在40～50 ℃酶活較高且穩(wěn)定性好,而當(dāng)溫度超過50 ℃時,PL酶活力明顯下降,導(dǎo)致酶解反應(yīng)減弱,還原糖質(zhì)量濃度減少。由圖1(d)可知:反應(yīng)時間為1～5 h時,還原糖質(zhì)量濃度隨著反應(yīng)時間增加而明顯增加,當(dāng)反應(yīng)時間為5 h時,還原糖質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定,之后還原糖質(zhì)量濃度雖有所增加,但上升趨勢緩慢,由此確定PL酶解的最適反應(yīng)時間為5 h。

2.2 酶法水解桔皮果渣正交試驗

在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗分析不同因素間的相互關(guān)系,最終確定PL酶解桔皮果渣的最佳酶解條件,其結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗結(jié)果

通過前期實驗確定反應(yīng)體系中果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,故正交實驗設(shè)計只考慮pH、酶添加量、反應(yīng)時間和酶解溫度4個因素,正交試驗結(jié)果如表2所示。以還原糖質(zhì)量濃度為指標(biāo),由極差分析可知:各因素對桔皮果渣酶解程度影響的主次順序為C>D>A>B,即反應(yīng)時間>酶解溫度>酶添加量>pH,反應(yīng)時間對還原糖質(zhì)量濃度的影響最為顯著。確定PL酶解果渣的最佳條件是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的果膠溶液,加酶量160 U/mL,反應(yīng)pH 6.2,溫度40 ℃,反應(yīng)時間5 h。對最佳酶解工藝條件進(jìn)行驗證試驗,得到還原糖質(zhì)量濃度為1 067 μg/mL(得率為72.9%)。

2.3 不同分子質(zhì)量段的UPO的抑菌活性

不同分子質(zhì)量段的果膠低聚糖產(chǎn)物往往會產(chǎn)生不同的抑菌效果,通過對比抑菌圈直徑,分析不同分子質(zhì)量段UPO(U1,U2,U3,U4,U5)對3種常見食品污染細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)抑菌活性的影響如圖2所示。

圖2 不同分子質(zhì)量段的UPO抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of unsaturated pectin oligosaccharides with different molecular weights

由圖2分析可知:不同分子質(zhì)量段UPO對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有一定的抑菌作用,但抑菌效果也存在明顯差異,其中U2(1 kDa

2.4 UPO與市售防腐劑的復(fù)配實驗

選取具有最佳抑菌效果的UPO(分子質(zhì)量段為U2),通過對比抑菌圈直徑,分析其與3種市售防腐劑單獨(dú)使用和復(fù)配使用,分別對3種常見食品污染細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)抑菌活性的影響如表3所示。

表3 UPO與食品防腐劑復(fù)配抑菌活性

由表3可知:UPO及市售食品防腐劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果存在差異。單一組分的抑菌效果表明了苯甲酸鈉和乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強(qiáng),而山梨酸鉀則對大腸桿菌具有較好的抑制效果。UPO的抑菌性能相比于3種市售食品防腐劑較弱,但在與3種防腐劑復(fù)配后,復(fù)配抑菌劑產(chǎn)生的抑菌圈直徑明顯增大,超過3種防腐劑單獨(dú)作用時的抑菌效果。可見UPO在與某種有缺陷的防腐劑復(fù)配使用后,有一定的增強(qiáng)該防腐劑抑菌效果的能力。因此,UPO有望與市售食品防腐劑復(fù)配使用,解決化學(xué)防腐劑的高毒性和生物防腐劑的高成本問題。

3 結(jié) 論

通過單因素及正交試驗,確定了PL酶解桔皮果渣的最佳工藝條件為pH 6.2,酶添加量160 U/mL,果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,酶解溫度40 ℃,時間5 h,對最佳酶解工藝條件進(jìn)行驗證試驗,得到還原糖質(zhì)量濃度為1 067 μg/mL(得率為72.9%)。不同分子質(zhì)量段的UPO對常見食品污染細(xì)菌的抑菌實驗表明:其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有一定的抑菌作用,其中U2(1 kDa