王海東,李慶立,陳文武,李清秀,賀 峰,劉紹鵬

(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥品食品學(xué)院,江蘇 徐州 221006)

幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β(1-4)糖苷鍵連接成的高分子聚合物,廣泛存在于自然界,據(jù)統(tǒng)計(jì),幾丁質(zhì)全球年生物合成量超過10億噸,是僅次于纖維素的第二大可再生資源,主要存在海洋中,還有來源于養(yǎng)殖的蝦蟹和昆蟲的殼,真菌細(xì)胞壁,藻類等[1]。幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物為殼聚糖、幾丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖等,可廣泛應(yīng)用于制藥、食品和工業(yè)原料等領(lǐng)域[2]。對(duì)幾丁質(zhì)的研究主要集中在提高幾丁質(zhì)的降解效率[3],尋找更高效的幾丁質(zhì)降解酶[4]、幾丁質(zhì)脫乙酰酶[5],而以幾丁質(zhì)降解脫乙酰的產(chǎn)物殼聚糖為原料發(fā)酵生成酒精的研究,尚沒有相關(guān)報(bào)道,筆者希望通過篩選獲得直接發(fā)酵殼聚糖產(chǎn)生酒精的菌株,為幾丁質(zhì)的降解和綜合利用做有益的探索。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 品

采集徐州市云龍湖底淤泥作為樣品,以其中的自然菌種為篩選對(duì)象。

1.1.2 試 劑

殼聚糖Chitosan,上海伊卡生物技術(shù)有限公司,水溶,脫乙酰度≥95%,分子量≤50 kD;

質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的重鉻酸鉀溶液,配制方法為稱取5 g的重鉻酸鉀AR溶于50 mL水中,加10 mL濃硫酸,冷卻,加水至100 mL,pH自然[6]。

1.1.3 培 養(yǎng) 基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:殼聚糖10 g,蛋白胨10 g,115 ℃,瓊脂15 g,水1 000 mL,滅菌30 min。

篩選培養(yǎng)基:殼聚糖10 g,瓊脂15 g,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.5 g,水1 000 mL,pH自然,115 ℃,滅菌30 min[7-8]。

發(fā)酵培養(yǎng)基:殼聚糖100 g,水1 000 mL,分裝在100 mL發(fā)酵瓶中,每瓶50 mL,pH自然,115 ℃滅菌30 min。

1.1.4 儀 器

恒溫?fù)u床BDY-100B,上海予卓?jī)x器有限公司;分光光度計(jì)T6,上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 產(chǎn)酒精菌株的高通量篩選

稱取淤泥樣品1 g,加入10 mL無菌水,梯度稀釋106倍涂布基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板,30 ℃,培養(yǎng)2 d。待長(zhǎng)出菌落后,把篩選培養(yǎng)基融化,冷卻至45 ℃左右,倒在平板上,覆蓋在菌落上層,30 ℃,避光培養(yǎng)3 h[9]。因內(nèi)含2,3,5-氯化三苯基四氮唑TTC作為顯色劑,如果環(huán)境菌株具有降解殼聚糖的呼吸酶活力,會(huì)發(fā)生紅色或粉紅色顯色反應(yīng),以完成菌種的高通量初篩。

劃線分離有顏色反應(yīng)的菌株,挑取單菌落接種到發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃搖床培養(yǎng),觀察是否有大量氣泡產(chǎn)生,用重鉻酸鉀溶液檢測(cè)是否產(chǎn)生酒精進(jìn)一步驗(yàn)證[10-11],完成對(duì)菌種的復(fù)篩。

1.2.2 菌株鑒定

菌株提取總DNA后交由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行ITS序列鑒定和Blast比對(duì),結(jié)合菌株的形態(tài)和發(fā)酵特性分析菌株的種屬。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

以體積分?jǐn)?shù)1%固定接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基,開展單因素實(shí)驗(yàn),確定發(fā)酵殼聚糖生成酒精的最適pH、溫度、時(shí)間和轉(zhuǎn)速等參數(shù),設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化,以獲得最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.2.4 乙醇質(zhì)量濃度的測(cè)定

1) 乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取0.25 mL優(yōu)級(jí)無水乙醇于100 mL容量瓶中,加水至刻度線,該溶液含乙醇質(zhì)量濃度2 mg/mL。取6支刻度一致的10 mL比色管,編號(hào)為1～6,每支比色管中加入重鉻酸鉀溶液2 mL,分別加入乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0,1,2,4,6,8 mL,加水至刻度線,配制不同質(zhì)量濃度的乙醇溶液,100 ℃水浴10 min,流水冷卻5 min,以1號(hào)管作對(duì)比,用1 cm比色皿,于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度,以乙醇濃度與對(duì)應(yīng)吸光度A的工作曲線[12-13]。

2) 發(fā)酵液中酒精質(zhì)量濃度的測(cè)定

取發(fā)酵液0.5 mL于10 mL比色管中,加入2 mL重鉻酸鉀溶液,加水至刻度線,空白管以1號(hào)管作空白,于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度,平行3次,取平均值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出乙醇的質(zhì)量濃度[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選與鑒定

經(jīng)多輪初篩和復(fù)篩,得到一株能夠發(fā)生顏色反應(yīng)的菌株,劃線分離得到單菌落,菌株命名為K-6。對(duì)菌株的ITS序列,NCBI收錄號(hào)為MT501695,進(jìn)行Blast比對(duì)分析,結(jié)果顯示與收錄的S.cerevisiae釀酒酵母菌株MUCL28071的ITS序列有最高99.18%的相似度。菌株的菌落形態(tài)呈圓形,表面凸起,光滑濕潤(rùn),粘稠,容易挑起,乳白色泛黃,顏色質(zhì)地均勻,不透明,邊緣整齊,特征如圖1所示。

圖1 菌株K-6的菌落特征Fig.1 The colony characteristics of strain K-6

經(jīng)過顯微鏡檢測(cè),其形態(tài)為單個(gè)菌,卵圓形,可觀察到出芽生殖,無菌絲,形態(tài)如圖2所示。

圖2 菌株K-6的顯微鏡下形態(tài)Fig.2 The microscopic morphology of strain K-6

將篩選培養(yǎng)基融化冷卻至42 ℃左右,用接種針取少量菌,接入培養(yǎng)基混勻傾倒平板,30 ℃培養(yǎng)觀察,發(fā)現(xiàn)其能夠穩(wěn)定產(chǎn)生紅色反應(yīng)(圖3),推測(cè)菌株K-6能夠利用殼聚糖作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),有呼吸酶作用[15-16],能夠還原TTC產(chǎn)生紅色不溶物質(zhì)三苯甲月替(TTF)。

圖3 菌株K-6的TTC篩選培養(yǎng)基顏色反應(yīng)Fig.3 The color reaction of TTC screening medium of strain K-6

將菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃,發(fā)酵瓶培養(yǎng),觀測(cè)到有大量氣體產(chǎn)生,并有輕微酒精氣味散出,初步確定發(fā)酵液中應(yīng)該有酒精成分產(chǎn)生;同時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液與重鉻酸鉀溶液能夠產(chǎn)生明顯的綠色特征反應(yīng),相互驗(yàn)證確定發(fā)酵液體中有酒精組分生成,說明菌株K-6能夠以可溶性殼聚糖為底物直接發(fā)酵產(chǎn)生酒精。通過ITS分子鑒定,結(jié)合菌落形態(tài),生殖方式,顯色反應(yīng),以及可發(fā)酵產(chǎn)生酒精的特性,可確定菌株K-6應(yīng)屬于釀酒酵母S.cerevisiae。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基,選定溫度、pH、發(fā)酵時(shí)間和攪拌轉(zhuǎn)速4個(gè)因素做單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn),采用比色法,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定產(chǎn)生酒精的質(zhì)量濃度。以溫度為變量因素,自然pH、時(shí)間3 d和轉(zhuǎn)速150 r/min為條件實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖4所示。

圖4 最適發(fā)酵溫度單因素實(shí)驗(yàn)Fig.4 Single factor experiment of optimum fermentation temperature

從圖4中發(fā)現(xiàn):溫度為32 ℃時(shí),酒精質(zhì)量濃度最高為20.5 mg/mL,菌株K-6發(fā)酵酒精的最適溫度為32 ℃。

選擇pH為變量因素,溫度30 ℃、時(shí)間3 d和轉(zhuǎn)速150 r/min為條件做實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖5所示。當(dāng)pH為6時(shí),酒精質(zhì)量濃度最高19.8 mg/mL,從而可確定菌株K-6發(fā)酵酒精的最適pH為6。

圖5 最適發(fā)酵pH單因素實(shí)驗(yàn)Fig.5 Single factor experiment of optimum fermentation pH

選擇發(fā)酵時(shí)間為變量因素,溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min和自然pH做單因素實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖6所示。在5 d時(shí)發(fā)酵基本結(jié)束,酒精質(zhì)量濃度最高為23.6 mg/mL,從而可確定菌株K-6發(fā)酵酒精的最適發(fā)酵時(shí)間為5 d。

圖6 最適發(fā)酵時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)Fig.6 Single factor experiment of optimum fermentation time

選擇攪拌轉(zhuǎn)速為實(shí)驗(yàn)變量因素,溫度30 ℃、時(shí)間3 d和pH自然條件下開展單因素實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖7所示。在100 r/min時(shí),酒精質(zhì)量濃度最高為18.6 mg/mL,從而可確定菌株K-6發(fā)酵酒精的最適發(fā)酵轉(zhuǎn)速為100 r/min。

圖7 最適發(fā)酵轉(zhuǎn)速單因素實(shí)驗(yàn)Fig.7 Single factor experiment of optimum fermentation mixing speed

以確定的單因素最適發(fā)酵條件為基礎(chǔ),選定因素的3個(gè)水平如表1所示,設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)以確定最優(yōu)發(fā)酵條件,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 因素水平表Table 1 Table of Factors level

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of L9(34)

根據(jù)F檢驗(yàn)4個(gè)因素都不是顯著影響因素,所以按照實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定A1B2C3D3為最優(yōu)發(fā)酵條件,即溫度30 ℃,pH 6,轉(zhuǎn)速150 r/min和時(shí)間6 d,D因素的極差R最大,即發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精生成的影響相對(duì)比較明顯,最后采用最優(yōu)條件進(jìn)行發(fā)酵,酒精質(zhì)量濃度可以達(dá)到29.1 mg/mL。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)成功篩選獲得一株菌K-6,證明其能夠直接發(fā)酵殼聚糖生成酒精,經(jīng)ITS分子鑒定,結(jié)合菌落形態(tài),生殖方式,顯色反應(yīng),以及可發(fā)酵產(chǎn)生酒精的特性,確定其屬于S.cerevisiae釀酒酵母菌,并通過實(shí)驗(yàn)確定了其生成酒精的最優(yōu)發(fā)酵條件。以殼聚糖為原料發(fā)酵生成酒精,為幾丁質(zhì)的綜合利用找到了一個(gè)可能的新方向,接下來將繼續(xù)研究酵母菌株K-6發(fā)酵產(chǎn)生酒精的酶系構(gòu)成和催化機(jī)制,通過誘變菌株,構(gòu)建工程菌或者采用固定化酶技術(shù)等途徑,以期進(jìn)一步提高酒精發(fā)酵效率和發(fā)酵穩(wěn)定性,并嘗試探索從幾丁質(zhì)降解到發(fā)酵產(chǎn)生酒精的完整工藝過程和條件,為規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支持。

本文得到了徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項(xiàng)目(2017KY06)的資助。