程文煥,伏廣好,陳曉妮,呂金東

(內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

工業(yè)微生物育種學(xué)是一門通過(guò)遺傳改良技術(shù)為工業(yè)生產(chǎn)提供有益微生物的學(xué)科。工業(yè)微生物育種對(duì)挖掘微生物應(yīng)用潛力,提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的品質(zhì)與產(chǎn)量具有重要意義。工業(yè)微生物育種技術(shù)經(jīng)歷了常規(guī)突變體篩選、基因誘變、基因重組和基因工程4個(gè)重要階段[1]。常規(guī)突變體篩選又稱自然隨機(jī)篩選,在非人工處理?xiàng)l件下,菌株自發(fā)突變,經(jīng)篩選獲得目標(biāo)菌株;基因誘變是通過(guò)人為誘導(dǎo)使菌株發(fā)生突變,主要方法有物理誘變和化學(xué)誘變。物理誘變包括60Coγ射線、α射線、紫外線和快中子等方式,化學(xué)誘變主要利用NTG,EMS和DES等烷化劑,5-氟尿嘧啶、2-氨基嘌呤和5-溴去氧尿核等堿基類似物,吖啶橙和吖啶黃移碼突變劑。基因重組是通過(guò)將不同特征的菌株進(jìn)行遺傳重組獲取聚合優(yōu)良性狀的新菌株,主要技術(shù)方法有原生質(zhì)體融合以及衍生出的原生質(zhì)體誘變法、紫外處理原生質(zhì)體法和原生質(zhì)體電子融合技術(shù)等。這些技術(shù)均為非靶向誘變,突變的方向和性狀是隨機(jī)的,獲得優(yōu)良生產(chǎn)性能的菌株后,還要經(jīng)過(guò)背景純化,恢復(fù)其他正常功能才能進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。因此,通過(guò)以上技術(shù)獲取理想菌株存在的缺點(diǎn)是難度較大、效率較低。隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展,微生物育種技術(shù)也從非靶向誘變向靶向型遺傳改良轉(zhuǎn)變。在不改變菌株背景性狀的前提下,實(shí)現(xiàn)了育種目標(biāo)的定向改良,是育種技術(shù)的里程碑式發(fā)展,極大地提高了工業(yè)微生物育種效率。

基因編輯技術(shù)作為現(xiàn)代生物學(xué)研究的熱點(diǎn)技術(shù),也是定向遺傳改良技術(shù)的代表,在遺傳改良育種、基因組學(xué)研究和遺傳病治療等方面均展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力?；蚓庉嫾夹g(shù)主要包含三代:第一代為鋅指核酸酶技術(shù)(Zinc finger nuclease,ZFN),第二代為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN),第三代為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)相關(guān)蛋白(CRISPR associated proteins,Cas)技術(shù)。TALEN技術(shù)被《科學(xué)》雜志評(píng)為2012年度10大科學(xué)突破之一,CRISPR技術(shù)更是在2013年度、2015年度兩次榮登該榜單。三代技術(shù)雖然原理不同,但都是通過(guò)識(shí)別模塊定位特異性基因組序列,再利用核酸內(nèi)切酶進(jìn)行靶標(biāo)序列切割形成雙鏈斷裂,最后通過(guò)引發(fā)內(nèi)源性基因組修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)基因組編輯目的[2]。ZFN由于技術(shù)的復(fù)雜性,在工業(yè)微生物育種應(yīng)用中鮮有報(bào)道,TALEN技術(shù)和CRISPR技術(shù)則在釀酒酵母、黑曲霉和米曲霉等重要工業(yè)微生物遺傳改良中相繼展開(kāi)應(yīng)用。筆者旨在綜述TALEN和CRISPR基因編輯技術(shù)的原理、發(fā)展及其在工業(yè)微生物育種中的應(yīng)用。

1 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)

1.1 技術(shù)原理

2007年,Sugio等[3]在植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)菌株P(guān)XO99A中,Ⅲ型效應(yīng)基因pthXo6和pthXo7可編碼轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物(Transcription activator-like effector,TALE),該蛋白可誘導(dǎo)宿主水稻基因Os8N3的表達(dá),增加水稻白葉枯病易感性。黃單胞菌屬植物病原菌會(huì)在多種作物上引起嚴(yán)重病害,其毒性因子主要通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。在結(jié)合到宿主DNA后誘導(dǎo)宿主特定基因表達(dá),以破壞宿主防御系統(tǒng)或增加宿主對(duì)病原菌的敏感性,最終導(dǎo)致宿主生長(zhǎng)發(fā)育異?；蚋腥静『?。

TALE家族蛋白是黃單胞菌的關(guān)鍵毒性因子,通過(guò)模擬真核轉(zhuǎn)錄因子對(duì)宿主基因組表達(dá)進(jìn)行調(diào)控?？茖W(xué)家們就TALE蛋白結(jié)構(gòu)及其結(jié)合DNA的分子機(jī)制展開(kāi)研究[4-5]。TALEs家族蛋白序列較為保守,主要包含4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域:串聯(lián)重復(fù)序列中心結(jié)構(gòu)域、C端核定位信號(hào)(Nuclear localization signal,NLS)、N端分泌信號(hào)肽和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activating domain,AD)[6]。串聯(lián)重復(fù)序列中心結(jié)構(gòu)域一般由17個(gè)重復(fù)序列(Repeats)串聯(lián)形成,每個(gè)重復(fù)序列由33～35個(gè)氨基酸組成。其中,位于12和13位置上的可變殘基(Repeat variable diresidues/RVDs)決定了靶向序列的特異性,其余位置均為保守氨基酸(圖1)[7]。

圖1 TALE蛋白結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of TALE protein

經(jīng)研究,RVDs的識(shí)別關(guān)系主要為NI=腺嘌呤、NH=鳥(niǎo)嘌呤、HD=胞嘧啶、NN=腺嘌呤或者鳥(niǎo)嘌呤、NG=胸腺嘧啶,NS對(duì)4種堿基都可以識(shí)別[4-5]。C端的核定位信號(hào)主要負(fù)責(zé)將TALE引入宿主細(xì)胞核內(nèi),N端分泌信號(hào)肽負(fù)責(zé)TALE跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)則負(fù)責(zé)啟動(dòng)靶標(biāo)序列轉(zhuǎn)錄活動(dòng)。因此,TALE蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞后,由NLS引導(dǎo)靠近細(xì)胞核,在N端分泌信號(hào)肽協(xié)助下進(jìn)入核內(nèi)。然后,根據(jù)不同RVDs,串聯(lián)重復(fù)序列識(shí)別并結(jié)合到宿主特定DNA位點(diǎn),AD則激活靶點(diǎn)附近基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng),引起宿主基因表達(dá)異常,從而導(dǎo)致宿主異常發(fā)育或感染病害。

隨著TALE結(jié)構(gòu)與功能的深入解析,TALEN基因編輯技術(shù)出現(xiàn),并逐步取代ZFN技術(shù)。TALEN復(fù)合物主要包含兩部分:1) 用于識(shí)別與定位基因組靶標(biāo)序列的TALE;2) 用于切割基因組靶標(biāo)序列的非特異性核酸內(nèi)切結(jié)構(gòu)域Fok I如圖2(a)所示。Fok I來(lái)自海床黃桿菌,為IIS型內(nèi)切酶,該酶只在二聚體狀態(tài)時(shí)才有活性,行使靶序列切割功能。Fok I與TALEs的C端相連,由TALEs導(dǎo)向靶標(biāo)序列。為使Fok I具有切割活性,TALEN二聚體需分別附著于雙鏈兩側(cè),且中間預(yù)留出14～20 bp的切割空間如圖2(a)所示[8]。TALEN技術(shù)的工作原理與ZFN近似,首先是由TALE蛋白靶向識(shí)別宿主DNA序列,然后Fok I切割目標(biāo)序列,產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double-strand breaks,DSBs),激活細(xì)胞內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制引入突變。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在DSB側(cè)翼序列的同源序列時(shí),引發(fā)同源重組(Homologous recombination,HR)修復(fù),可將外源DNA片段導(dǎo)入宿主目標(biāo)DNA區(qū)域,形成插入突變;反之,細(xì)胞內(nèi)不存在同源序列時(shí),引發(fā)非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ)修復(fù),NHEJ修復(fù)易導(dǎo)致DSB側(cè)翼序列接合時(shí)發(fā)生核苷酸的缺失、插入或改變,形成無(wú)法預(yù)料的位點(diǎn)突變[4-5]如圖2(c)所示。

圖2 基因編輯工作原理Fig.2 Operating machinery of gene editing

1.2 應(yīng)用進(jìn)展

TALEN技術(shù)出現(xiàn)后,工業(yè)微生物育種學(xué)家們也展開(kāi)了新技術(shù)的應(yīng)用探索。Li等[9]基于TALEN的4個(gè)最常見(jiàn)RVDs(NI,NG,HD,NN)開(kāi)發(fā)出一種“模塊組裝”方法,稱為designer TALEN(dTALEN)。通過(guò)該方法設(shè)計(jì)了10個(gè)dTALEN,測(cè)試結(jié)果表明:10個(gè)dTALEN均獲得了預(yù)期突變菌株,突變菌株中只有較低的非靶向突變,無(wú)細(xì)胞毒性。dTALEN方法極大地提高了酵母菌株基因編輯效率,為微生物基因改良奠定了基礎(chǔ);Arazoe等[10]首次將TALEN技術(shù)應(yīng)用到稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)基因編輯中,研究結(jié)果表明:通過(guò)同源重組成功將SRS2基因替換為潮霉素B抗性基因hph,且基因替換效率高達(dá)100%;葉偉等[11]在中國(guó)菌物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)上報(bào)道,利用TALEN技術(shù)成功將啤酒酵母菌株AS2.4的ADH2基因敲除,該基因編碼乙醇脫氫酶。LC-MS和GC檢測(cè)結(jié)果表明:基因敲除菌株的乙醇產(chǎn)量提高了50%左右,極大地促進(jìn)了釀酒酵母的遺傳改良;米曲霉菌是發(fā)酵食品飲料生產(chǎn)和食品加工的重要商業(yè)用酶。Mizutani等[12]首次將TALEN技術(shù)應(yīng)用到米曲霉菌(Aspergillusoryzae)遺傳改良中,發(fā)現(xiàn)在正常野生型菌株中,基因編輯材料約有一半為靶標(biāo)區(qū)域的大片段缺失,而在LigD缺失型的NEHJ功能缺失菌株中,基因編輯材料的大片段缺失率明顯降低。黑曲霉(Aspergillusniger)CBS 513.88是重要的有機(jī)酸、酶類工業(yè)生產(chǎn)菌株,李麗莎[13]利用TALEN技術(shù)對(duì)該菌株進(jìn)行GlaA基因敲除,敲除后的菌株產(chǎn)糖化酶能力降低。將TALEN技術(shù)與電擊轉(zhuǎn)化法相結(jié)合,構(gòu)建了成熟的A.nigerCBS 513.88轉(zhuǎn)化體系,為絲狀真菌基因編輯應(yīng)用提供了寶貴的技術(shù)支持,TALEN技術(shù)的應(yīng)用,極大地促進(jìn)了工業(yè)微生物精準(zhǔn)育種進(jìn)程。

2 成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白技術(shù)

2.1 技術(shù)原理

噬菌體感染是細(xì)菌生存的一大壓力,海洋中每天約有4%～50%的細(xì)菌死于噬菌體攻擊[14]。為避免噬菌體感染,細(xì)菌進(jìn)化出包括CRISPR/Cas系統(tǒng)等獲得性免疫系統(tǒng)[15]。研究發(fā)現(xiàn):CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅰ～Ⅴ型,其中最常用的Cas9蛋白屬Ⅱ型系統(tǒng)[16]。隨后,對(duì)CRISPR/Cas結(jié)構(gòu)功能與技術(shù)原理解析、技術(shù)優(yōu)化研究相繼開(kāi)展。

CRISPR/Cas系統(tǒng)由CRISPR序列和Cas基因序列組成。CRISPR是一段具有前導(dǎo)區(qū)(leader sequence)和重復(fù)-間隔區(qū)(repeat-spacer)的DNA序列如圖3所示[17]。前導(dǎo)區(qū)為一段富含AT的序列,被認(rèn)為是CRISPR簇的啟動(dòng)子區(qū)。重復(fù)序列(repeats)是一段有回文或發(fā)卡結(jié)構(gòu)的21～48 bp的序列,間隔序列(spacers)是一段特異性序列,其決定了CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向性。Cas基因序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯合成CAS家族蛋白,CAS蛋白具有核酸內(nèi)切酶活性、解旋酶活性和DNA結(jié)合功能域。其核酸酶結(jié)構(gòu)域?yàn)镠NH和RuvC,分別負(fù)責(zé)切斷靶標(biāo)序列的互補(bǔ)鏈與非互補(bǔ)鏈。

圖3 CRISPR位點(diǎn)結(jié)構(gòu)Fig.3 The structure of CRISPR loci

與TALEN技術(shù)原理不同,CRISPR/Cas系統(tǒng)以轉(zhuǎn)錄得到的crRNA為向?qū)?與CAS蛋白形成CRISPR效應(yīng)核蛋白復(fù)合體(crRNP),crRNP在crRNA的引導(dǎo)下與靶序列結(jié)合,并識(shí)別靶序列周邊的原間隔相鄰基序(Protospacer-adjacent motifs,PAM),在NGG-PAM前3～8 bp位置處進(jìn)行切割,產(chǎn)生雙鏈斷裂誘發(fā)宿主細(xì)胞內(nèi)源性HR修復(fù)或NHEJ修復(fù)引入突變見(jiàn)圖2(b,c))[2,18-19]。

CRISPR技術(shù)出現(xiàn)后,在遺傳病治療、遺傳育種改良和基因組研究上展現(xiàn)出極大的應(yīng)用價(jià)值和潛力,全球科學(xué)家也紛紛開(kāi)展CRISPR/Cas9的技術(shù)升級(jí)與應(yīng)用研究。Cas9D10A突變體為RuvC失活和HNH激活;Cas9H840A突變體則為RuvC激活和HNH失活[20-21]。這2種Cas9突變體都有酶切活性,可對(duì)靶向序列進(jìn)行剪切。dCas9(dead Cas9)的RuvC和HNH功能域同時(shí)失活,不具有核酸酶活性,但仍有DNA解旋與結(jié)合功能[22]?？茖W(xué)家通過(guò)將tRNA腺苷脫氨酶、胞苷脫氨酶分別與dCas9形成融合蛋白,成功實(shí)現(xiàn)了A與G和T與C間的相互轉(zhuǎn)換[23-24]。為消除對(duì)NGG-PAM的依賴性,科學(xué)家設(shè)計(jì)出化膿性鏈球菌Cas9(SpCas9)變種SpG,該變異株能夠靶向NGN-PAMs,并進(jìn)一步優(yōu)化該酶以開(kāi)發(fā)一種幾近無(wú)PAM依賴性的SpCas9變異株SpRY(NRN>NYN PAMs),極大地增加了CRISPR/Cas9的靶點(diǎn)范圍[25]。此外,科學(xué)家還開(kāi)發(fā)出CRISPR/Cas12a,CRISPR/Cas13a和CRISPR/Cpf1等其他CRISPR系統(tǒng),拓寬了CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用范圍。例如CRISPR/Cpf1系統(tǒng),相較Cas9蛋白,Cpf1體積更小,更利于轉(zhuǎn)化宿主。同時(shí),Cpf1剪切產(chǎn)生黏性末端,更利于基因編輯后的修復(fù),進(jìn)一步擴(kuò)充了靶點(diǎn)范圍[26]。Wu等[27]更是利用CRISPR/Cpf1構(gòu)建反式酶切體系,結(jié)合LAMP反應(yīng)搭建了轉(zhuǎn)基因大豆熒光檢測(cè)系統(tǒng),為快檢行業(yè)提供了新思路。

2.2 應(yīng)用進(jìn)展

在工業(yè)微生物育種研究中,CRISPR技術(shù)的應(yīng)用也非常廣泛,釀酒酵母、產(chǎn)甘油假絲酵母、谷氨酸棒狀桿菌等重要微生物工業(yè)菌種的CRISPR技術(shù)體系相繼建立。Dicarlo等[28]首次在模式生物釀酒酵母中構(gòu)建CRISPR/Cas9系統(tǒng),通過(guò)組成型表達(dá)Cas9蛋白與瞬時(shí)表達(dá)gRNA,為酵母基因編輯提供了一個(gè)高效的工具。研究表明:通過(guò)上述系統(tǒng)靶向雙鏈斷裂可使單鏈和雙鏈供體的同源重組率分別提高5倍和130倍。Tsai等[29]為了向釀酒酵母導(dǎo)入外源木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木糖激酶基因(XYL1,XYL2,XYL3)并刪除內(nèi)源PHO13和ALD6,構(gòu)建了一個(gè)以PHO13和ALD6為靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9質(zhì)粒,與含有XYL1,XYL2和XYL3的線性化靶點(diǎn)DNA同源片段共轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母。最終,XYL1,XYL2和XYL3被整合到PHO13和ALD6的基因座上,實(shí)現(xiàn)了外源基因的插入和內(nèi)源基因的敲除。該研究通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)將來(lái)源于樹(shù)干畢赤酵母的木糖合成相關(guān)基因?qū)脶劸平湍?并刪除PHO13和ALD6,構(gòu)建出一株無(wú)抗性篩選標(biāo)記、木糖發(fā)酵能力強(qiáng)的工程菌株,該菌株非常適合工業(yè)化發(fā)酵使用。

甘油在醫(yī)學(xué)、化工、食品和化妝品等行業(yè)均有重要應(yīng)用。產(chǎn)甘油假絲酵母可以合成高濃度甘油,同時(shí)具有繁殖速度快、抗逆性強(qiáng)和轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)點(diǎn),是我國(guó)甘油工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的重要菌株,也是用于遺傳改造的優(yōu)良底盤細(xì)胞。朱敏陽(yáng)等[30]構(gòu)建了產(chǎn)甘油假絲酵母CRISPR/CgCas9瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),以TRP1和URA3為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA,未形成CgCas9-sgRNA復(fù)合體,而是通過(guò)單體元件形式導(dǎo)入宿主,實(shí)現(xiàn)了雙基因敲除;通過(guò)在TRP1基因位點(diǎn)編輯表達(dá)木糖脫氫酶基因xylB獲得了木糖酸生產(chǎn)菌株。該研究還表明同源臂長(zhǎng)度在50 bp時(shí)修復(fù)效率最高。

谷氨酸棒狀桿菌是目前全球氨基酸發(fā)酵工業(yè)的主要生產(chǎn)用菌,但無(wú)法引入CRISPR/SpCas9基因編輯系統(tǒng)。Jiang等[31]則通過(guò)CRISPR-FnCpf1系統(tǒng)對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的g-谷氨酰激酶G149進(jìn)行密碼子飽和突變減輕了L-脯氨酸抑制,使谷氨酸棒狀桿菌基因編輯育種成為可能。夏婷婷[32]實(shí)驗(yàn)室收集到一株維吉尼亞鏈霉菌IBL14,經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)其基因組存在I-B-Svi型CRISPR/Cas系統(tǒng),經(jīng)驗(yàn)證,來(lái)源于IBL14的CRISPR-SviCas3-5-7和CRISPR-SviCas3系統(tǒng)可以在谷氨酸棒狀桿菌中進(jìn)行基因編輯,但CRISPR-SviCas3編輯效率較低,而SpCas9作為對(duì)照未出現(xiàn)基因編輯。該研究為谷氨酸棒狀桿菌基因編輯提供了另一新工具,同時(shí)也為其他SpCas9不兼容菌株提供了一個(gè)新的可能。

光合微生物作為自然界重要的存在,具有高效能、高營(yíng)養(yǎng)和分布廣泛等特點(diǎn)應(yīng)用于養(yǎng)殖、環(huán)保和醫(yī)療等行業(yè),是重要的工業(yè)微生物。Jiang等[33]首次在光合微生物萊茵衣藻中應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù),發(fā)現(xiàn)Cas9單獨(dú)轉(zhuǎn)化到萊茵衣藻中存在毒性效應(yīng),僅獲得了一個(gè)成功編輯的克隆,仍為光合微生物基因編輯打開(kāi)了思路。此后,科學(xué)家們?cè)谖M球藻、三角褐指藻、海鏈藻、長(zhǎng)鏈鏈球菌和集胞藻等光合微生物中相繼建立了CRISPR/Cas9基因編輯體系[34]。

3 TALEN與CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)比

TALEN技術(shù)與CRISPR技術(shù)均為近年來(lái)的熱點(diǎn)基因編輯技術(shù),在基因治療、基因功能研究和種質(zhì)遺傳改良等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。這2個(gè)技術(shù)體系各有優(yōu)勢(shì),對(duì)比結(jié)果如表1所示。

表1 TALEN與CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)比

由表1可知:1) TALEN技術(shù)以蛋白-DNA模式識(shí)別靶標(biāo)序列,CRISPR技術(shù)為RNA-DNA識(shí)別模式。TALEN技術(shù)需要根據(jù)靶標(biāo)序列構(gòu)建不同的TALEs蛋白,體系構(gòu)建耗時(shí)耗力且成本較高,而CRISPR技術(shù)只需改變一段短sgRNA序列即可實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)位點(diǎn)識(shí)別功能,體系構(gòu)建更加簡(jiǎn)單高效。同時(shí),由于蛋白與DNA結(jié)合效果受DNA甲基化影響,TALEN技術(shù)的靶點(diǎn)范圍受限于DNA甲基化,CRISPR技術(shù)的RNA-DNA識(shí)別模式則不受DNA甲基化影響。2) TALEN技術(shù)靶標(biāo)序列的特異性由串聯(lián)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域的RVDs決定,這4種核苷酸均有相應(yīng)RVDs進(jìn)行識(shí)別。理論來(lái)講,TALEN可以靶向基因組的任何一段特異性序列。CRISPR技術(shù)則通過(guò)識(shí)別PAM區(qū)進(jìn)行定點(diǎn)編輯,雖經(jīng)科學(xué)家改造,PAM區(qū)對(duì)靶點(diǎn)序列識(shí)別的范圍增大很多,但仍受靶點(diǎn)范圍限制。3) TALEN技術(shù)只有形成二聚體才能進(jìn)行基因組編輯,但TALEN的二聚體基因編輯模式?jīng)Q定了其靶點(diǎn)特異性非常高,編輯效率高,脫靶率低,對(duì)細(xì)胞的毒性效果較低。CRISPR只需單個(gè)CRISPR/Cas9蛋白復(fù)合體即可啟動(dòng)定點(diǎn)編輯,但存在較高的脫靶率,易出現(xiàn)預(yù)料之外的編輯效果,有較高的細(xì)胞毒性作用。因此,TALEN技術(shù)在微生物發(fā)酵食品工業(yè)方向具有較高的應(yīng)用潛力。4) TALEN主要用于基因片段編輯,尚不能實(shí)現(xiàn)單堿基編輯功能。CRISPR技術(shù)則通過(guò)融合tRNA腺苷脫氨酶、胞苷脫氨酶實(shí)現(xiàn)了A與G和T與C間的單位點(diǎn)精確編輯,隨著基因功能位點(diǎn)的精確研究,CRISPR在精準(zhǔn)位點(diǎn)編輯上的應(yīng)用前景更廣闊。5) TALEN技術(shù)每次只能進(jìn)行單個(gè)靶點(diǎn)的基因編輯,而CRISPR技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行多靶點(diǎn)定向基因編輯,在創(chuàng)制微生物育種突變體材料時(shí)更加高效。

4 基因編輯技術(shù)應(yīng)用面臨的問(wèn)題

基因編輯技術(shù)雖然應(yīng)用前景廣闊,但在技術(shù)提升與工業(yè)微生物遺傳改良應(yīng)用上仍面臨諸多困難,如存在脫靶效果、細(xì)胞毒性、傳遞系統(tǒng)的效率和安全性、微生物的系統(tǒng)不兼容性等。

CRISPR/Cas技術(shù)雖然依靠融合腺苷脫氨酶、胞苷脫氨酶實(shí)現(xiàn)A與G和T與C轉(zhuǎn)換,但未能實(shí)現(xiàn)嘌呤與嘧啶間的自由轉(zhuǎn)換。脫靶效果也是限制CRISPR系統(tǒng)應(yīng)用的一大問(wèn)題,縮短sgRNA可以一定程度上提高靶點(diǎn)結(jié)合效率,但sgRNA過(guò)短也會(huì)降低靶點(diǎn)的特異性。Davis等[35]將4-羥基三苯氧胺反應(yīng)性內(nèi)含肽插入Cas9特定位置,發(fā)現(xiàn)Cas9編輯靶基因位點(diǎn)的特異性比野生型Cas9高25倍,提高靶向效率依舊是基因編輯應(yīng)用必須解決的問(wèn)題之一。

常見(jiàn)的傳遞載體工具主要有質(zhì)粒、病毒和蛋白質(zhì)等。病毒載體雖然傳遞效率高,但對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)象的大小有要求;質(zhì)粒載體可承載大片段轉(zhuǎn)運(yùn),適合多靶點(diǎn)編輯,但同樣會(huì)面臨攜帶外基因同源片段進(jìn)入宿主內(nèi)的問(wèn)題;蛋白核酸復(fù)合物作為常用載體,普遍認(rèn)為其安全高效,但持續(xù)表達(dá)時(shí)間較短[36]。如何將基因編輯系統(tǒng)的高效安全地傳遞進(jìn)宿主,并在編輯事件完成后從細(xì)胞中完全清除也需要進(jìn)一步探索。

據(jù)統(tǒng)計(jì),已知的微生物代謝產(chǎn)物雖然有近1 000種,但工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的僅100種左右;微生物的酶也有近1 000種,但工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的僅10種。很多微生物由于自身的遺傳特性限制,尚不能被開(kāi)發(fā)應(yīng)用。目前,研究人員僅在少數(shù)工業(yè)微生物中建立了基因編輯系統(tǒng)[37-38],但微生物種類繁多,且很多物種具有系統(tǒng)不兼容性。因此,改造與開(kāi)發(fā)更多高兼容性核酸酶,并在各微生物中建立成熟的應(yīng)用體系,對(duì)充分利用微生物資源,創(chuàng)造高價(jià)值的工業(yè)微生物菌種有重要意義。

5 結(jié) 論

優(yōu)良菌種是微生物高效工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ),菌種遺傳改良技術(shù)決定了育種的效率。傳統(tǒng)育種技術(shù)由于突變方向和性狀隨機(jī)性問(wèn)題,致使優(yōu)良菌種篩選效率低、過(guò)程繁瑣。同時(shí),射線輻射與誘變劑等物理化學(xué)誘變方法存在一定的安全隱患,對(duì)環(huán)境防護(hù)及操作者安全防護(hù)有一定要求。此外,通過(guò)傳統(tǒng)方法將外源基因表達(dá)模塊整合到菌株中,不可避免地會(huì)在酵母染色體上沉積不良的遺傳元素,如質(zhì)粒攜帶的多克隆位點(diǎn)和抗生素抗性基因之類的不良標(biāo)記。由于健康問(wèn)題,這些用于篩選菌株的耐藥標(biāo)記可能會(huì)阻礙菌株的工業(yè)化應(yīng)用。TALEN和CRISPR技術(shù)作為定向遺傳改良技術(shù)的代表,具有高度靶向性、無(wú)需篩選標(biāo)記、體外組裝、操作簡(jiǎn)單高效和單核苷酸精準(zhǔn)編輯等優(yōu)勢(shì),對(duì)環(huán)境和操作者幾乎無(wú)防護(hù)要求,安全度更高,是未來(lái)工業(yè)微生物遺傳改良的主流技術(shù)。綜觀近年來(lái)工業(yè)微生物育種研究報(bào)道,研究人員正在積極探索和研究TALEN技術(shù)和CRISPR技術(shù)在微生物育種中的應(yīng)用。隨著技術(shù)體系的優(yōu)化和工業(yè)微生物基因功能位點(diǎn)的深入研究,基因編輯技術(shù)將在遺傳改良方面發(fā)揮更大的作用,盡管近年已有基因編輯技術(shù)在微生物育種應(yīng)用方面的綜述,但CRISPR/Cas技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展極快,需不斷更新。希望通過(guò)本綜述,讓育種者了解基因編輯技術(shù)最新進(jìn)展及在工業(yè)微生物育種研究上的應(yīng)用情況,以更好地應(yīng)用基因編輯技術(shù)提升工業(yè)微生物育種效率。