袁 蕓，張洪銘，黃 慧

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學院口腔修復科，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室,上海市口腔醫(yī)學研究所，上海200011

牙周炎是發(fā)生于牙周支持組織的炎癥反應，常伴發(fā)結(jié)合上皮的退縮、附著喪失、牙周袋形成，以及牙槽骨吸收。隨著病變逐漸向根方發(fā)展，患牙可出現(xiàn)松動移位、咀嚼困難等臨床表現(xiàn)，最終導致牙齒缺失的嚴重后果[1]。流行病學調(diào)查[2]顯示，牙周炎在成年人中的患病率高達90%，是我國成年人失牙的首要原因。

牙周致病菌主要包括牙齦卟啉單胞菌、福塞坦菌、伴放線聚集桿菌等[3-4]。這些病原菌及其毒素在入侵牙周組織時，可激活局部免疫環(huán)境中的固有免疫應答和特異性免疫應答。其中，輔助性T（helper T, Th）細胞介導的細胞免疫應答是特異性免疫應答的重要組成部分。根據(jù)Th 細胞在炎性疾病中的作用，可將其分為Th1、Th2、Th17 及調(diào)節(jié)性T（T-regulatory, Treg） 4 種細胞亞型[5]。這4 種細胞通過分泌不同的細胞因子來介導牙周炎局部的組織損傷。Th1 細胞主要分泌細胞因子干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）；Th2 細胞主要分泌白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）；Th17 細胞產(chǎn)生的細 胞因子以IL-17A 為 主；Treg細胞主要產(chǎn)生IL-10[6-7]。研究[8]表明，在牙周炎病損處，IFN-γ 濃度升高，IL-10 的表達量降低，且在重度牙周炎和急性進展性牙周炎患者中更加明顯。IL-17A 在牙周炎患者牙齦組織和齦溝液中的表達水平均高于正常對照 組[9]。

牙周致病菌在激活局部免疫應答的同時，也引起全身免疫應答。有學者發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者與正常人相比，外周血中Th1、Th17 及Treg 細胞的比例明顯升高[10-11]。類似的現(xiàn)象也出現(xiàn)在模型動物中，IFN-γ 在實驗性牙周炎大鼠外周血清中的表達顯著升高，Th17 細胞、Treg 細胞及兩者的比值在牙周炎大鼠外周血中也明顯升高[12-13]。但是，也有學者[14-15]認為在牙周炎患者與正常人外周血中，Th17細胞并無明顯變化，且IL-17A+T 細胞、IFN-γ+T 細胞均無明顯變化。目前，關(guān)于牙周炎對全身免疫環(huán)境中Th 細胞分群的影響尚無一致定論。因此，本研究通過建立大鼠牙周炎模型，對比牙周炎與健康大鼠外周血中Th 細胞各亞群的比例，探討牙周炎對外周血中Th 細胞分群的影響，為牙周炎的免疫學研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

RPMI1640 培養(yǎng)液（Sigma 公司，美國），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS；江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；FITC 標記的CD3、BUV395標記的CD4、BV480 標記的CD8、BV421 標記的CD25、AF647 標記的IFN-γ、PE 標記的IL-4 抗體、APC-CY7 標記的死活染料、抗原封閉劑、刺激劑/蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑、破胞膜劑、紅細胞裂解液、緩沖液、流式細胞儀，均購自美國BD 公司；PE-Cyanine 標記的IL-17A、PE-eFluor 標記的叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（transcription factor forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）抗體、破核膜劑，均購自美國eBioscience 公司；細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司，顯微CT 掃描儀（micro-CT Skyscan1176）購自比利時布魯克公司。

1.2 牙周炎動物模型的建立

6 周齡SPF 級SD 雄性大鼠10 只，由上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院動物實驗中心提供，體質(zhì)量為（180±20）g，無牙周疾病，健康狀況良好。將大鼠隨機分為牙周炎組和對照組，每組各5 只。牙周炎組：稱重后以1%的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠（0.6 mL/100 g），分離雙側(cè)下頜第一磨牙（M1）頸部牙齦組織，采用3-0縫合線結(jié)扎M1 牙頸部，每日檢查結(jié)扎絲，如有松動則重新結(jié)扎。對照組：大鼠麻醉后分離牙齦，不結(jié)扎，其余均與牙周炎組相同。實驗期間給予實驗動物清潔飼料和純凈水，按時更換墊料，環(huán)境溫度25 ℃，光照12 h/d。術(shù)后2 周，采用牙周探針分別檢查牙周炎組與對照組大鼠下頜M1 牙周狀況，記錄探診深度。實驗獲得上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批（批準號HKDL-2017-249）。

1.3 牙槽骨吸收高度的測量

處死大鼠，每組隨機選擇3 只，取下頜骨，去除軟組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h 后，進行顯微CT 掃描檢測。掃描參數(shù)設(shè)置為：電壓65 kV，電流280 μA，1.0 mm 鋁箔過濾，旋轉(zhuǎn)步長0.55°，像素為18 μm×18 μm×18 μm。掃描后利用NRecon 軟件進行三維重建。選取M1 頰側(cè)近中、中間、遠中及舌側(cè)近中、中間、遠中，共6 個位點，測量釉牙骨質(zhì)界（cementoenamel junction，CEJ）至牙槽嵴頂（alveolar bone crest，ABC）的垂直距離（CEJ-ABC）作為牙槽骨吸收高度。每個樣本測量3 次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.4 Th 細胞各亞群的流式細胞術(shù)檢測

1.4.1 外周血采集 采用心臟采血法獲取大鼠外周血，將外周血收集至含有EDTA-K2 抗凝劑的采血管中。取1.0 mL 外周血用于Th1、Th2 及Th17 細胞流式細胞術(shù)檢測，另取1.0 mL 外周血用于Treg 細胞流式檢測。

1.4.2 Th1、Th2、Th17 細胞樣本制備 將1.0 mL 外周血加入到六孔板中，每孔中加入1.0 mL 含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)液及2 μL 刺激劑/蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑，培養(yǎng)4 ～6 h（37 ℃，5% CO2）。紅細胞裂解液去除紅細胞，DPBS 重懸，轉(zhuǎn)移至流式管中，死活染料染色，緩沖液清洗2 次，抗原封閉，用FITC 標記的CD3及BV480 標記的CD8 抗體進行胞外因子染色。經(jīng)破胞膜劑固定破膜后，用AF647 標記的IFN-γ、PE 標記的IL-4、PE-Cyanine 標記的IL-17A 抗體進行胞內(nèi)因子染色。緩沖液洗滌重懸，上機檢測。

1.4.3 Treg 細胞樣本制備 按1.4.2 中的方法去除紅細胞、死活染料染色、抗原封閉。用FITC 標記的CD3、BUV395 標記的CD4 及BV421 標記的CD25 抗體進行胞外因子染色。經(jīng)破核膜劑固定破膜后，用PE-eFluor 標記的Foxp3 抗體進行核內(nèi)因子染色。緩沖液洗滌重懸，上機檢測。

1.4.4 流式細胞術(shù)分析 利用FlowJo 10.5.3 軟件分析Th1、Th2、Th17、Treg 細胞的比例。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad Prism 8.0 軟件包進行數(shù)據(jù)分析。定量數(shù)據(jù)以x—±s 表示，定性數(shù)據(jù)以n（%）表示。牙槽骨吸收高度及Th1、Th2、Th17、Treg 細胞的百分比在2 組之間的比較均采用獨立樣本t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 牙周探診

牙周探診結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示：牙周炎組大鼠下頜M1 周圍牙齦組織紅腫，頰側(cè)牙齦明顯增生，探診深度約為1.0 mm。對照組大鼠下頜M1 周圍牙齦組織呈淡粉色，未見明顯腫脹、增生，探診深度小于0.5 mm。

圖1 牙周探診結(jié)果Fig 1 Results of periodontal probing

2.2 牙槽骨吸收高度

牙槽骨吸收高度測量結(jié)果見圖2。頰側(cè)近中CEJ-ABC在牙周炎組和對照組中分別為（1 271.0±59.2）μm 和（833.7±59.2）μm，牙周炎組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.006）；頰側(cè)中間CEJ-ABC 在牙周炎組和對照組中分別為（1 303.7±23.8）μm 和（870.3±40.8）μm，牙周炎組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）；頰側(cè)遠中CEJ-ABC 在牙周炎組和對照組中分別為（1 019.7±62.8）μm 和（442.0±12.1）μm，牙周炎組高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。舌側(cè)近中CEJ-ABC在牙周炎組和對照組中分別為（1 084.0±13.0）μm 和（931.3±84.3）μm，牙周炎組高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.148）；舌側(cè)中間CEJ-ABC 在牙周炎組和對照組中分別為（987.7±18.2）μm 和（769.7±58.1）μm，牙周炎組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.023）；舌側(cè)遠中CEJ-ABC 在牙周炎組和對照組中分別為（885.7±15.6）μm 和（696.0±27.2）μm，牙周炎組高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.004）。牙槽骨吸收高度測量結(jié)果表明，牙周炎組M1 頰舌側(cè)牙槽骨均發(fā)生明顯吸收。

2.3 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果見圖3。Th1 細胞在牙周炎組大鼠外周血中的比例明顯高于對照組（P=0.002），Th17 細胞在牙周炎組大鼠外周血中的比例也明顯升高（P=0.028）；而Treg 細胞在牙周炎組大鼠外周血中的比例明顯降低（P=0.002）；Th2 細胞在牙周炎組大鼠外周血中的比例也低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。

圖3 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果Fig 3 Results of flow cytometry

3 討論

牙周炎是以牙齦紅腫、牙周袋形成、牙槽骨吸收為典型臨床表現(xiàn)的慢性炎癥破壞性疾病。本研究采用大鼠下頜第一磨牙牙頸部結(jié)扎的方法建立實驗性牙周炎大鼠模型。術(shù)后2 周，牙周炎組大鼠出現(xiàn)牙齦紅腫、探診出血，頰側(cè)探診深度達1.0 mm；而對照組大鼠未見牙齦紅腫出血，探診無牙周袋形成，頰側(cè)探診深度明顯小于牙周炎組。牙槽骨吸收高度測量結(jié)果顯示，除了舌側(cè)近中CEJ-ABC 在2組間無明顯差異外，牙周炎組在其余5 個位點的測量值均顯著高于對照組，表明牙周炎組M1 周圍牙槽骨發(fā)生明顯吸收。以上結(jié)果表明，結(jié)扎第一磨牙牙頸部2 周可誘導形成實驗性牙周炎大鼠模型。

牙周致病菌及其代謝產(chǎn)物激活病變局部的單核細胞、巨噬細胞，產(chǎn)生大量促炎性細胞因子，如白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和前列腺素E2 等[16]。這些細胞因子可通過血液循環(huán)進行擴散，從而引起外周血中Th 細胞分群的改變。本研究通過流式細胞術(shù)檢測實驗性牙周炎大鼠與對照組大鼠外周血中Th 細胞各亞群的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牙周炎組大鼠外周血中促炎型Th1、Th17 細胞的比例升高，炎癥調(diào)節(jié)型Treg細胞的比例降低。

然而，關(guān)于牙周炎對外周血中Th 細胞分群的影響，目前尚無一致結(jié)論。王琳源等[17]采用口腔涂抹牙齦卟啉單胞菌的方法建立小鼠牙周炎模型，4 周后檢測發(fā)現(xiàn)牙周炎小鼠外周血中Th17 細胞在總CD4+T 細胞中的比例和數(shù)量顯著高于對照組，且牙周炎組IL-17A 的表達增加。Chen 等[10]對68 例慢性牙周炎患者和43 例健康者外周血樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)牙周炎患者外周血中Th1 和Th17 細胞的比例明顯高于健康者。Gao 等[13]采用牙周結(jié)扎+涂抹牙齦卟啉單胞菌的方法建立大鼠牙周炎模型，通過流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)牙周炎大鼠外周血中Th17 細胞比例升高，且Th17 與Treg 細胞的比值升高。而Sabarish 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者外周血中Treg 細胞的比例明顯高于健康者；Cheng 等[18]研究發(fā)現(xiàn)牙周炎患者與健康者相比，外周血中Th17 及Treg 細胞的比例未見明顯變化，并認為牙齦局部的炎癥反應不會引起血液中主要的免疫細胞亞群發(fā)生改變。以上研究結(jié)果存在差異的原因可能有：①實驗動物的物種差異，大部分動物實驗均發(fā)現(xiàn)牙周炎能顯著影響嚙齒類動物外周血中Th 細胞的分群，而臨床研究結(jié)果的差異性較大。②病變程度不同，早、中、晚期牙周炎可能對外周血中Th 細胞的分群產(chǎn)生不同的影響。③個體差異，牙周炎引起的T 細胞免疫反應在不同個體之間的程度不同。

既往研究[19]認為Th1 細胞是造成牙周炎中牙周支持組織損傷的主要細胞，Th1 細胞通過分泌IFN-γ、TNF 等促炎性細胞因子破壞牙周組織。IFN-γ 可以提高黏附因子和趨化因子的含量，促使炎癥細胞向感染部位聚集，在牙周炎癥反應、骨吸收、附著組織喪失上都起著重要的作用[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)Th17 細胞的浸潤與牙周炎的病變輕重有著密切關(guān)系，IL-17A 水平升高在炎癥過程中起到重要作用，牙周炎組織的破壞緣于IL-17A 分泌增加[20-21]。Th2 細胞通過分泌IL-4 抑制T 細胞向Th1 細胞分化，抑制巨噬細胞的功能，抑制破骨細胞的生成，控制炎癥的進展[22]。Treg 細胞能通過接觸或分泌IL-10 和轉(zhuǎn)化生長因子抑制T 細胞的增殖和活化，對自身免疫性疾病和炎癥反應起負調(diào)控作用。因此，目前認為Th1 和Th17 細胞是主要的促炎型Th 細胞亞群，而Th2 和Treg 細胞是主要的炎癥調(diào)節(jié)型Th 細胞亞群。

綜上，本研究結(jié)果表明，牙周炎可促進大鼠外周血中促炎型Th 細胞亞群的分化，抑制炎癥調(diào)節(jié)型Th 細胞亞群的分化。而牙周炎引起Th 細胞各亞群比例變化的具體作用機制，仍有待進一步闡明。

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