戴尅戎
上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院骨科,上海 200011
非擴(kuò)增性干細(xì)胞治療技術(shù)是通過非體外培養(yǎng)、非細(xì)胞增殖的方式,從組織或組織液中直接獲取干細(xì)胞,通過物理方式或依靠細(xì)胞本身的特性濃縮聚集干細(xì)胞(如離心、富集等),直接應(yīng)用或與材料混合后回植患者體內(nèi),進(jìn)行細(xì)胞治療。該類技術(shù)具有耗時(shí)短、污染可能性小、倫理問題少等優(yōu)勢。其中,利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞本身黏附特性的干細(xì)胞篩選-富集-復(fù)合循環(huán)系統(tǒng)[screen-enrich-combine(-biomaterials) circulating system,SECCS]作為一種非擴(kuò)增性干細(xì)胞治療技術(shù),已經(jīng)用于230 余例臨床的骨修復(fù)病例,療效滿意[1-4]。
自20 世紀(jì)下葉起,人體干細(xì)胞的研究和應(yīng)用逐步成為熱點(diǎn),干細(xì)胞多能性和無限增殖能力備受關(guān)注,特別是多能干細(xì)胞應(yīng)用技術(shù)越來越多地受到相關(guān)科學(xué)家和臨床醫(yī)生的重視,被認(rèn)為具有巨大的研究價(jià)值和應(yīng)用潛力。干細(xì)胞可望治療多種疾病,在組織再生和延緩衰老方面將發(fā)揮重要作用,是一種可以改變現(xiàn)代治療模式的新型技術(shù),可以帶來巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)貢獻(xiàn)。1999 年,Science 雜志將人類胚胎干細(xì)胞研究成果評(píng)為當(dāng)年世界十大科技進(jìn)展之首。但是,近20 年來,干細(xì)胞的應(yīng)用研究發(fā)展并未加速。其中一個(gè)重要因素是倫理問題。胚胎干細(xì)胞等相關(guān)的核轉(zhuǎn)移技術(shù)涉及人源性祖細(xì)胞,受到廣泛質(zhì)疑甚至反對(duì)。相對(duì)而言,成體干細(xì)胞的應(yīng)用獲得多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可。但這同時(shí)也存在一些難以回避的問題。傳統(tǒng)技術(shù)通過干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo),從而得到有效數(shù)量的干細(xì)胞,這通常需要在分離干細(xì)胞之后通過體外培養(yǎng)以擴(kuò)增干細(xì)胞數(shù)量。但體外培養(yǎng)過程時(shí)間久、操作繁瑣,并且存在干細(xì)胞干性下降、污染等一系列問題。更重要的是,體外培養(yǎng)擴(kuò)增往往需要使用動(dòng)物血清,或受到不良的理化因素影響而出現(xiàn)非二倍體的細(xì)胞。因此,在應(yīng)用上一直受到倫理學(xué)限制。
細(xì)胞治療實(shí)質(zhì)上是通過將某些特定細(xì)胞輸注患者體內(nèi),通過歸巢效應(yīng),或直接植入特定區(qū)域,利用細(xì)胞特性形成組織、修復(fù)器官,以治療相關(guān)的臨床疾病。21 世紀(jì)以來,隨著人們對(duì)細(xì)胞研究的深入,細(xì)胞治療也不斷發(fā)展。目前,細(xì)胞治療已開始應(yīng)用于不少臨床領(lǐng)域,如利用嵌合抗原受體T 細(xì)胞療法(chimeric antigen receptor T cell therapy,CAR-T)治療急性淋巴細(xì)胞白血病和淋巴瘤[5],應(yīng)用胰島細(xì)胞移植治療1 型糖尿病,應(yīng)用角膜緣干細(xì)胞移植修復(fù)角膜,應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦外傷和帕金森病,應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨軟骨再生修復(fù)長節(jié)段骨缺損,應(yīng)用施萬(Schwann)細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷[6]等。而人類多能干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)更是有望從根本上重塑再生醫(yī)學(xué)和人類對(duì)復(fù)雜疾病的研究,目前已開展多項(xiàng)有關(guān)人誘導(dǎo)多向潛能干細(xì)胞的相關(guān)臨床試驗(yàn)[7]。
傳統(tǒng)干細(xì)胞治療技術(shù)包括樣本采集,干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、移植等過程。而通過干細(xì)胞分離得到的干細(xì)胞數(shù)量往往較少,因此需要體外培養(yǎng)擴(kuò)增以獲得足量細(xì)胞數(shù)。利用Ficoll 或Percoll 等分離液的密度梯度離心法,是實(shí)驗(yàn)室常用的從骨髓血中分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞(包含骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)的方法。研究人員應(yīng)用該方法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞并用于臨床研究[8]。而為了得到足量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,則需進(jìn)一步通過體外培養(yǎng)。這時(shí)除了上述細(xì)胞體外培養(yǎng)的常見問題外,密度梯度離心所需的分離液等相關(guān)試劑毒性,也成為干細(xì)胞治療過程中的阻礙。因此,如何規(guī)避這些繁瑣步驟,直接獲得足夠數(shù)量的干細(xì)胞用于臨床治療,成為細(xì)胞治療向前發(fā)展的重要挑戰(zhàn)之一,這也正是發(fā)展非擴(kuò)增性干細(xì)胞治療技術(shù)的由來。
離心技術(shù)是細(xì)胞治療最常用的一種非擴(kuò)增性方式。獲取的組織或組織液,通過離心濃縮富集獲得組織中的干細(xì)胞成分,但往往還混有一些其他細(xì)胞。如直接一起應(yīng)用,有時(shí)也起到一定的相輔相成作用[2]。離心分離是最早期常用的非體外培養(yǎng)干細(xì)胞富集技術(shù)。離心技術(shù)包括差速離心和密度梯度離心。差速離心根據(jù)大小不同的細(xì)胞在同一介質(zhì)中沉降所需流速不同以分離不同的細(xì)胞。一般適用于分離大小懸殊的細(xì)胞。而密度梯度離心則是借助離心力作用形成一系列連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度不同的細(xì)胞分層,以達(dá)到分離細(xì)胞的目的;如COBE 2991(美國Gambro BCT公司)或Celution 系統(tǒng)(美國Cytori 公司)正是通過此原理實(shí)現(xiàn)對(duì)血液或脂肪組織液中干細(xì)胞的分離,而不需要體外培養(yǎng)[9]。但通過離心技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的精準(zhǔn) 分離。
免疫磁珠分選技術(shù)是一種新興技術(shù)。免疫技術(shù)的發(fā)展也為非體外培養(yǎng)干細(xì)胞治療技術(shù)帶來了新思路。通過免疫磁珠標(biāo)記具有特異性表面分子的細(xì)胞,如標(biāo)記CD34或CD133 陽性的細(xì)胞,再通過磁場中磁力的作用,將標(biāo)有免疫磁珠的細(xì)胞(陽性細(xì)胞)或未能標(biāo)記的細(xì)胞(陰性細(xì)胞)篩選出來。CliniMACs 系統(tǒng)(德國Miltenyi 公司)就是利用該原理設(shè)計(jì)出的細(xì)胞分離裝置。目前已有相關(guān)臨床研究,通過該方法篩選干細(xì)胞治療心肌梗死[10-11]。CliniMACs 系統(tǒng)在歐洲一些國家也已用于臨床,但應(yīng)用“陽性”選擇在分離外周血中造血干細(xì)胞時(shí),CD34 細(xì)胞復(fù)原率較低,僅為60%。美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)輸血醫(yī)學(xué)部細(xì)胞加工實(shí)驗(yàn)室使用抗AC133 的抗體來篩選造血干細(xì)胞,抗AC133 抗體選擇的造血干細(xì)胞與抗CD34 抗體選擇的細(xì)胞群仍存在部分差異,目前尚有許多問題處于研究階段[12]。
SECCS,或稱非擴(kuò)增性干細(xì)胞富集技術(shù),是利用干細(xì)胞的黏附特性,將骨髓血循環(huán)過濾于多孔生物材料上,達(dá)到篩選干細(xì)胞并富集-復(fù)合于生物材料,隨后回植體內(nèi)達(dá)到修復(fù)骨缺損的目的。目前,我們利用該方法已完成相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體體外實(shí)驗(yàn)[2-3],隨即在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院和上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院進(jìn)行了相關(guān)人體體內(nèi)臨床研究[4,13-14],通過對(duì)過濾前后細(xì)胞特性的分析發(fā)現(xiàn),過濾富集過程并不會(huì)影響細(xì)胞的凋亡和增殖能力,具有良好的生物安全性。該技術(shù)已獲得10 余項(xiàng)國家專利,具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán),可在手術(shù)同期完成骨髓干細(xì)胞采集-篩選-富集-復(fù)合生物材料的制備,干細(xì)胞數(shù)量足以滿足質(zhì)量需求,術(shù)中直接回植,無需體外培養(yǎng)。避免了體外長時(shí)間培養(yǎng)、易污染、使用異種血清及相關(guān)倫理學(xué)問題,臨床療效滿意。目前已應(yīng)用治療230 多例骨不連、骨缺損、新鮮骨折骨缺損、股骨頭壞死、脊柱關(guān)節(jié)融合、距骨骨軟骨損傷、良性骨腫瘤切除后的骨修復(fù)等需要骨再生的患者[15-16],結(jié)果提示該方法制備的生物活性材料,其骨修復(fù)結(jié)果不遜于“金標(biāo)準(zhǔn)”自體骨移植的骨修復(fù)療效,總體有效率達(dá)到95%。
展望干細(xì)胞研究與應(yīng)用的發(fā)展,體外培養(yǎng)干細(xì)胞治療技術(shù)仍是干細(xì)胞治療的主要方式。非擴(kuò)增干細(xì)胞治療技術(shù)所形成的理念是一種新興技術(shù)思路,目前采用這類技術(shù)進(jìn)行臨床研究或臨床治療的報(bào)道數(shù)量還不多。而隨著對(duì)干細(xì)胞研究的深入,非體外培養(yǎng)干細(xì)胞治療技術(shù)憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢必將在干細(xì)胞治療中獲得一席之地,成為干細(xì)胞治療的有效方式之一。非擴(kuò)增干細(xì)胞治療技術(shù)直接或間接地通過增加干細(xì)胞分離過程中得到的干細(xì)胞數(shù)量,省去干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增的步驟,從而極大程度地降低干細(xì)胞治療技術(shù)的難度,提高了干細(xì)胞治療的安全性,規(guī)避了相關(guān)倫理學(xué)的問題,其應(yīng)用范圍顯然不僅僅限于骨科。隨著細(xì)胞分離技術(shù)的發(fā)展,新興干細(xì)胞分離技術(shù),如微流控技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、吸附技術(shù)、過濾富集技術(shù)等,也將成為非體外培養(yǎng)干細(xì)胞治療技術(shù)的一部分,甚至可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的精確分離和定量分離,根據(jù)疾病需要,針對(duì)性進(jìn)行細(xì)胞治療,達(dá)到經(jīng)濟(jì)、有效的治療效果。
參·考·文·獻(xiàn)
[1] Gan YK, Dai KR. Enrichment techniques of autologous bone marrow stem cells for bone regeneration: translational medicine from bench to bedside. In pushing the boundaries of scientific research: 120 years of addressing global issues[J]. Science, 2016, 351(6278 Suppl): 52-54.
[2] Chu WX, Zhuang YF, Gan YK, et al. Comparison and characterization of enriched mesenchymal stem cells obtained by the repeated filtration of autologous bone marrow through porous biomaterials[J]. J Transl Med, 2019, 17(1): 377.
[3] Chu WX, Gan YK, Zhuang YF, et al. Mesenchymal stem cells and porous β-tricalcium phosphate composites prepared through stem cell screen-enrichcombine(-biomaterials) circulating system for the repair of critical size bone defects in goat Tibia[J]. Stem Cell Res Ther, 2018, 9(1): 157.
[4] Gan YK, Dai KR, Zhang P, et al. The clinical use of enriched bone marrow stem cells combined with porous β-tricalcium phosphate in posterior spinal fusion[J]. Biomaterials, 2008, 29(29): 3973-3982.
[5] Gagelmann N, Riecken K, Wolschke C, et al. Development of CAR-T cell therapies for multiple myeloma[J]. Leukemia, 2020, 34(9): 2317-2332.
[6] Assinck P, Duncan GJ, Hilton BJ, et al. Cell transplantation therapy for spinal cord injury[J]. Nat Neurosci, 2017, 20(5): 637-647.
[7] Soldner F, Jaenisch R. Stem cells, genome editing, and the path to translational medicine[J]. Cell, 2018, 175(3): 615-632.
[8] Hare JM, Fishman JE, Gerstenblith G, et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial[J]. JAMA, 2012, 308(22): 2369-2379.
[9] Reinhardt M, Bader A, Giri S. Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy[J]. Expert Rev Med Devices, 2015, 12(3): 353-364.
[10] Bartunek J, Vanderheyden M, Vandekerckhove B, et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety[J]. Circulation, 2005, 112(9 Suppl): I178-I183.
[11] Tendera M, Wojakowski W, Ruzy??o W, et al. Intracoronary infusion of bone marrow-derived selected CD34+CXCR4+cells and non-selected mononuclear cells in patients with acute STEMI and reduced left ventricular ejection fraction: results of randomized, multicentre Myocardial Regeneration by Intracoronary Infusion of Selected Population of Stem Cells in Acute Myocardial Infarction(REGENT) Trial[J]. Eur Heart J, 2009, 30(11): 1313-1321.
[12] 干耀愷, 戴尅戎, 湯亭亭. 臨床細(xì)胞加工與細(xì)胞治療[J]. 國際骨科學(xué)雜志, 2007, 28(1): 1-5.
[13] Zhuang YF, Gan YK, Shi DW, et al. A novel cytotherapy device for rapid screening, enriching and combining mesenchymal stem cells into a biomaterial for promoting bone regeneration[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 15463.
[14] Chu WX, Wang X, Gan YK, et al. Screen-enrich-combine circulating system to prepare MSC/β-TCP for bone repair in fractures with depressed tibial plateau[J]. Regen Med, 2019, 14(6): 555-569.
[15] 王昕, 干耀愷, 趙杰, 等. 新型骨髓干細(xì)胞快速篩選-富集-復(fù)合系統(tǒng)治療四肢骨不連[J]. 中華創(chuàng)傷骨科雜志, 2018, 20(2): 93-98.
[16] 儲(chǔ)文祥, 干耀愷, 趙杰, 等. 應(yīng)用干細(xì)胞快速篩選富集技術(shù)治療新鮮骨折骨缺損[J]. 中華創(chuàng)傷骨科雜志, 2018, 20(5): 369-375.
上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2020年10期