谷詩濃,劉毓佳,王振杰,黃賽娥

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué),福建 福州 350122; 2.福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350122;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院,福建 福州 350003)

腦血管疾病是世界公認(rèn)的第三大致死性疾病，常具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的臨床特征，是屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性腦血流循環(huán)障礙性疾病范疇，亦是屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”[1]。在此類發(fā)病人群中，缺血性腦卒中是主要發(fā)病類型，占87%[2]，現(xiàn)代大量基礎(chǔ)、臨床研究表明，中醫(yī)針刺對(duì)此類疾病療效明顯，其機(jī)制可能與抑制炎性反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抑制腦水腫形成、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)和血管再生等相關(guān)，且早期介入療效更佳，但具體作用機(jī)制尚不明確[3-6]。自噬(autophagy)作為一種細(xì)胞自我調(diào)節(jié)的降解途徑，通過該途徑，細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)含物被遞送至溶酶體降解，形成自噬體，有清除已損傷的細(xì)胞器和異常折疊蛋白的功能。當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，會(huì)激發(fā)細(xì)胞自噬現(xiàn)象，但自噬現(xiàn)象的激活對(duì)機(jī)體是一把雙刃劍，有研究表明適度激活自噬可促進(jìn)細(xì)胞自體修復(fù)，從而減輕細(xì)胞損傷程度。因此，自噬現(xiàn)象在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著至關(guān)重要的作用[7-10]。本研究以“通督調(diào)神”針法作為干預(yù)手段，通過神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分、TTC染色法對(duì)干預(yù)前后腦梗死范圍改善程度的分析，探討“通督調(diào)神”電針法通過調(diào)節(jié)自噬蛋白Beclin-1進(jìn)而對(duì)缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能起到保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選購(gòu)60只SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司[許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-003]提供，在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(閩)2013-005]分籠飼養(yǎng)并進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)條件:溫度(23±1)℃，并對(duì)大鼠稱體質(zhì)量、編號(hào)。當(dāng)大鼠體質(zhì)量(280±10)g進(jìn)行造模實(shí)驗(yàn)及干預(yù)。實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格按照國(guó)際動(dòng)物保護(hù)和使用指南的規(guī)定操作。

1.2 主要試劑和儀器

2，3，5-三苯基氯化四氮唑(Sigma，USA)；線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)；G6805型電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；Beclin-1一抗(Cell Singaling Technology公司)；PMSF、BCA蛋白定量試劑盒、電泳膠配液、超敏ECL發(fā)光試劑盒(博士德生物有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD大鼠分為空白組、假手術(shù)組、模型組各電針組各15只。

2.2 模型制備與篩選

大鼠體質(zhì)量到達(dá)(280±10)g時(shí)術(shù)前禁食12 h。稱重后，腹腔注射10%的水合氯醛3.3 mL/1 kg麻醉。模型組和電針組大鼠參照Zea-Longa線栓法制備并加以改進(jìn)，制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。麻醉后，向一側(cè)牽拉舌頭避免窒息。酒精消毒并沿頸正中切口切開皮膚，長(zhǎng)度約3～5 cm。充分分離、暴露出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，注意避開其他血管以及神經(jīng)。在頸總動(dòng)脈結(jié)扎上方近心端剪開一處“V”型切口，從切口處向頸內(nèi)動(dòng)脈方向插入線栓，感覺線栓進(jìn)入受阻時(shí)，打開血管夾讓線栓進(jìn)入，直至遇到輕微阻力，進(jìn)入深度為18～20 mm。線栓成功進(jìn)入后，封閉左側(cè)大腦中動(dòng)脈血流，觀察2～5 min無出血、滲血情況后可進(jìn)行縫合。待2 h后緩慢退出線栓至頸總動(dòng)脈分叉處。實(shí)驗(yàn)過程和動(dòng)物蘇醒期間注意保溫，假手術(shù)組只需分離血管后縫合，并不插入線栓。手術(shù)結(jié)束待動(dòng)物蘇醒2 h后參照Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)老鼠進(jìn)行評(píng)分,判斷手術(shù)是否成功。0分：提起鼠尾，可伸展雙上肢，無神經(jīng)缺損癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：提起鼠尾對(duì)側(cè)前肢內(nèi)旋，肩內(nèi)收，行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。神經(jīng)功能評(píng)分為1～3分的大鼠為造模成功，納入實(shí)驗(yàn)，0分和4分者剔除。

2.3 選穴及干預(yù)方法

在動(dòng)物蘇醒評(píng)分后，選取造模成功大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，抓至鼠板上固定、放置半小時(shí)，第2天進(jìn)行電針干預(yù)?？瞻捉M、假手術(shù)組和模型組只進(jìn)行同等條件抓取并不進(jìn)行電針干預(yù)，電針組大鼠穴位解剖位置參考華興邦等編著的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腧穴圖譜》[11]，選取百會(huì)(頂骨正中)、大椎(第7頸椎與第1胸椎間，背部正中)、足三里(膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處)，使用0.5寸華佗牌針灸針，百會(huì)和大椎平刺，足三里斜刺[12]，進(jìn)針2～5 mm，選擇疏密波，頻率1/20 Hz，電流強(qiáng)度1～3 mA，30 min/次，1次/d。選擇每天上午固定時(shí)段進(jìn)行電針，干預(yù)7 d后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死、取材。

3 觀察指標(biāo)及方法

3.1 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分

參照Zea Longa神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，模型組與電針組模型制備完成后評(píng)分、記錄，其余兩組同等條件抓取、記錄評(píng)分。電針組連續(xù)干預(yù)7 d，每次針刺結(jié)束2 h后評(píng)分、記錄，其余3組同等條件抓取、記錄評(píng)分。

3.2 三苯基氯化四氮唑染色(Triphenyl tetrazolium chloride,TTC)

從各組中隨機(jī)分別抓取5只大鼠腹腔注射10%的水合氯醛3.3 mL/1 kg麻醉斷頭、冰上取腦，迅速將腦組織放置于-20 ℃冰箱，同時(shí)將冠狀位腦模具放入-20℃冰箱內(nèi)預(yù)冷。將鼠腦正置于冠狀位腦模具中均勻切片，去除嗅球、小腦和低位腦干，每片厚度約2 mm，腦組織切片放入2%TTC溶液中，并于37℃恒溫箱內(nèi)避光孵育15 min，期間可以適當(dāng)翻動(dòng)腦組織切片便于染色。染色結(jié)束后用濾紙吸干表面液體，按順序擺放、拍照。選擇Image J軟件分析計(jì)算腦梗死面積和大腦面積，計(jì)算腦缺血區(qū)體積比。

3.3 蛋白免疫印跡(Western Blot)

從各組中隨機(jī)分別抓取3只大鼠腹腔注射10%的水合氯醛3.3 mL/1 kg麻醉、冰上取腦，分離取出缺血半暗帶組織放入離心管中。

3.3.1 提取蛋白 對(duì)組織稱重，加入裂解液，超聲研磨后，14 000 rp離心5 min后取上清液分裝保存;

3.3.2 電泳 將計(jì)算好的上樣量加入10%分離膠和濃縮膠中電泳,分別設(shè)定20 V、10 min,60 V、30 min,100 V、60 min；

3.3.3 轉(zhuǎn)膜 切取分子量對(duì)應(yīng)的目標(biāo)條帶轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜成功后超純水蕩洗，將PVDF膜放入封閉液中2 h，隨后TBST蕩洗5 min；

3.3.4 抗體孵育 放入一抗孵育(Beclin-1 Rabbit Polyclonal Antibody,Mouse anti beta Actin Monoclonal antibody)4 ℃過夜。TBST洗3×5 min，放入二抗孵育(Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)1 h。二抗孵育結(jié)束后，TBST洗膜3×10 min。PVDF膜滴ECL顯影液1 min后曝光，保存全部圖像。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image Lab軟件分析計(jì)算蛋白灰度值。

3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

4 結(jié)果

4.1 各組神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分比較

模型制備后，栓塞過重死亡3只，剔除后模型組13只、電針組14只，空白組與假手術(shù)組各15只。神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分顯示：空白組與假手術(shù)組的神經(jīng)功能評(píng)分均為0分；與空白組和假手術(shù)組比較，模型組與電針組的神經(jīng)功能評(píng)分顯著增高(P<0.05)；干預(yù)7 d后，與空白組和假手術(shù)組相對(duì)，模型組的神經(jīng)功能評(píng)分顯著增高(P<0.05);與模型組相比，電針組的神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠Zea-Longa神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分比較

4.2 各組TTC染色比較

使用TTC染色法對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行染色，以便確定腦組織梗死灶范圍。大鼠腦組織TTC染色后的梗死灶會(huì)呈蒼白色，而未梗死組織可被染成玫瑰紅色，白色與紅色之間界限清晰。與空白組和假手術(shù)組比較，模型組有明顯梗死灶(P<0.05)；干預(yù)7 d后，電針組與模型比較，梗死灶顯著減少(P<0.05)。見表2、圖1。

4.3 各組Western Blot比較

Beclin-1蛋白灰度值的計(jì)算以GAPDH為內(nèi)參，與空白組和假手術(shù)組比較，模型組Beclin-1表達(dá)水平增加(P<0.05)，干預(yù)7 d后，電針組與模型組比較Beclin-1表達(dá)水平進(jìn)一步增加(P<0.05)。見表3、圖2。

表2 各組大鼠腦梗死面積比比較

圖1 各組大鼠腦梗死面積比較

表3 各組大鼠缺血半暗帶皮層Beclin-1/GAPDH蛋白表達(dá)水平比較

圖2 Western Blot法檢測(cè)各組大鼠缺血半暗帶皮層Beclin-1蛋白的表達(dá)

5 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦卒中屬于“中風(fēng)”范疇，病機(jī)為陰陽失調(diào)、氣血虧虛所致，治療原則以調(diào)陰陽、補(bǔ)氣血和通經(jīng)絡(luò)為主。《黃帝內(nèi)經(jīng)》對(duì)針刺治療“中風(fēng)”的辨證論治和取穴原則都有大量記載，并肯定針刺治療和預(yù)后的療效。督脈自古有“陽脈之?！薄安∽?cè)谀X，首取督脈”之說，亦有前期文獻(xiàn)梳理證實(shí)“百會(huì)”在改善腦卒中后認(rèn)知功能障礙針灸治療中起到重要作用[13]，因此本研究遵循“通督調(diào)神”針法的選穴基本原則，擇“百會(huì)”作為主穴[14-15]，同時(shí)為滿足振發(fā)陽氣的作用配伍“大椎”“足三里”電針干預(yù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明早期進(jìn)行“通督調(diào)神”針法干預(yù)可明顯改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死范圍，并可能通過調(diào)控自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)水平，進(jìn)而保護(hù)腦缺血再灌注損傷后大鼠腦神經(jīng)功能。在Beclin-1( Beclin-1:autophagic regulator and therapeutic target in cance)眾多生物學(xué)作用中，最主要的作用是調(diào)控自噬體膜的合成，它與許多自噬調(diào)控蛋白直接或間接結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，進(jìn)而調(diào)控自噬水平。在自噬初始階段它與三類磷酸肌醇3-激酶(Class III phosphoi-nositide3-kinase,PI3K)、自噬相關(guān)基因-14(Autophagy associated gene-14,Atg14)形成三聚體，并不斷募集胞漿中其他自噬相關(guān)蛋白，調(diào)控自噬前體和自噬體膜的形成，介導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生[16-19]。同時(shí)大多數(shù)缺血性腦卒中導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病伴有異常折疊蛋白和蛋白聚集體的累積，自噬則作為機(jī)體自我防御體系的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制之一，常在細(xì)胞缺血、缺氧情況下被應(yīng)激激活，通過清除已損傷的細(xì)胞器和異常折疊蛋白的功能，從而維持神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。因此 Beclin-1作為調(diào)控自噬水平的重要靶點(diǎn)，干預(yù)其表達(dá)水平，適當(dāng)?shù)丶せ钭允沙潭?，?duì)減輕腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的損傷有重大意義。

綜上所述，本研究在缺血再灌注的基礎(chǔ)上進(jìn)行電針干預(yù)，證實(shí)“通督調(diào)神”針法可降低腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，緩解腦神經(jīng)功能缺損癥狀，有效減小腦梗死面積比，改善腦細(xì)胞凋亡情況。提示保護(hù)腦神經(jīng)系統(tǒng)功能可能與促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1含量的表達(dá)、增加腦組織自噬水平有關(guān)，為臨床治療缺血性腦卒中提供更多思路，但電針如何具體調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制不明，還需今后進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。