袁鑫，李亮，何樺，胡深強(qiáng)，王繼文

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130）

CRISPR-Cas系統(tǒng)可充當(dāng)防御外源遺傳物質(zhì)的“基因武器”，能夠?qū)谷肭值牟《炯巴庠碊NA，沉默外源基因的表達(dá)[1]。由于該系統(tǒng)精確的靶向功能性，目前已被開(kāi)發(fā)成為高效的基因編輯工具，并成功在人[2]、小鼠[3]、斑馬魚(yú)[4]、雞[5]等物種上實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、胚胎和組織中特異性基因的編輯修飾。CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因座由以下3部分組成：5′端反式激活RNA（trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA）基因，3′端CRISPR 序列元件，中間為一系列CRISPR 相關(guān)基因（CRISPR-associated gene,Cas gene），包 括Cas1～Cas10 等[6-7]。CRISPR-Cas系統(tǒng)可以分為3種類(lèi)型（Ⅰ～Ⅲ）以及至少11種不同的亞型（Ⅰ-A～Ⅰ-F，Ⅱ-A～Ⅱ-C，Ⅲ-A～Ⅲ-B）[8]。其中，研究較深入、應(yīng)用最成熟的是以Cas9 蛋白為主的Ⅱ型[9]。實(shí)現(xiàn)基因編輯功能只需要2個(gè)工具[10]：一是單鏈指導(dǎo)RNA（single-guide RNA,sgRNA），它是將crRNA（CRISPR-derived RNA）和tracrRNA 進(jìn)行改裝得到的體外人工合成的一小段單鏈核糖核苷酸。二是Cas9 蛋白，它包含2 個(gè)結(jié)構(gòu)域，即類(lèi)HNH（HNH-like）核酸酶結(jié)構(gòu)域和類(lèi)RuvC（RuvClike）結(jié)構(gòu)域，其中：類(lèi)HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域能剪切與crRNA 互補(bǔ)的序列，而類(lèi)RuvC 結(jié)構(gòu)域則剪切非互補(bǔ)的序列。通過(guò)指導(dǎo)RNA 序列與靶序列進(jìn)行堿基配對(duì)，引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合到靶序列處并在特定位點(diǎn)上行使DNA 切割功能，使雙鏈DNA 斷點(diǎn)（doublestrand break,DSB），然后此斷點(diǎn)通過(guò)非同源性末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）或同源重組（homologous recombination,HR）修復(fù)機(jī)制進(jìn)行插入/缺失、修復(fù)或替換[11]。

硬脂酰輔酶A 去飽和酶（stearoyl-coenzyme A desaturase, SCD）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)酶，催化飽和脂肪酸——硬脂酰輔酶A（C16:0）和棕櫚酰輔酶A（C18:0）在第9和10碳原子間導(dǎo)入氫鍵，分別形成單不飽和脂肪酸——油酸（C16:1）和棕櫚酸（C18:1）[12]；它也是脂肪生成和脂類(lèi)氧化的關(guān)鍵控制點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)單不飽和脂肪酸的合成及比例，影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和脂蛋白代謝，從而影響脂質(zhì)代謝和引起多種代謝疾病及癌癥[13-15]。此外，由于SCD 可調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪沉積量及影響脂類(lèi)的脂肪酸譜，從而影響畜禽產(chǎn)品的品質(zhì)，因此，SCD基因也是改善動(dòng)物肉產(chǎn)品、乳產(chǎn)品脂肪酸組成的重要候選基因[16-17]。

卵黃沉積是卵泡發(fā)育成熟的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，涉及卵黃前體物質(zhì)的運(yùn)輸、轉(zhuǎn)化和沉積；普遍認(rèn)為卵泡合成脂質(zhì)的能力非常低下，幾乎都來(lái)源于肝[18]。但在人和小鼠[19]、大鼠[20]、山羊[21]、牛[22]等哺乳動(dòng)物中已經(jīng)證實(shí)卵泡顆粒細(xì)胞中存在脂質(zhì)代謝，然而其作用效果及機(jī)制仍知之甚少。本研究以天府肉鵝（Anas platyrhynchos）為研究對(duì)象，利用CRISPRCas9 系統(tǒng)成功構(gòu)建了靶向鵝SCD基因的慢病毒敲減質(zhì)粒，為后續(xù)研究鵝卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)源性脂質(zhì)代謝機(jī)制及分子調(diào)控通路奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒

慢病毒：psgRNA-mCherry-T2A-Puro 和pLenti-Cas9-T2A-EGFP，購(gòu)自江蘇百奧邁科生物技術(shù)有限公司。包裝質(zhì)粒：psPAX2 及pMD2.G，購(gòu)自美國(guó)Addgene公司。人胚腎細(xì)胞（293T）和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary, CHO）細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Omega 公司；高糖DME培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium），購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；胎牛血清，購(gòu)自美國(guó)Corning公司；DNA 標(biāo)志物、膠純化試劑盒，購(gòu)自日本TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶，購(gòu)自美國(guó)NEB 公司；瓊脂糖、減血清培養(yǎng)基、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；sgRNA 體外合成試劑盒、一步純化RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物試劑盒、SpCas9核酸酶切試劑盒，購(gòu)自江蘇百奧邁科生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物合成及測(cè)序

所有寡核苷酸序列合成及測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 方法

1.4.1 sgRNA 設(shè)計(jì)

根據(jù)鵝SCD基因核苷酸序列（GenBank 登錄號(hào)：XM_013201691）以及鵝基因組序列（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/001/973/225/GCF_001973225.1_ASM197322v1），利用CasOT系統(tǒng)[23]進(jìn)行全基因組脫靶位點(diǎn)、種子序列錯(cuò)配、潛在靶點(diǎn)及具體靶點(diǎn)分析，篩選最優(yōu)sgRNA 靶點(diǎn)，并合成sgRNA 寡核苷酸序列以用于體外轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的sgRNA。

1.4.2 sgRNA 體外合成

根據(jù)sgRNA體外合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。首先，將sgRNA 序列替換到CRISPR_F 寡核苷酸（5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGN18-20G TTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′，GGN18-20 為 替換序列）上，按照50 μL反應(yīng)體系（ddH2O 40 μL、10×Pfu 緩沖液5 μL、10 mol/mL dNTPs 1 μL、Pfu DNA聚 合 酶2 μL、100 mol/μL CRISPR_F 引 物1 μL、100 mol/μL sgRNA-R 1 μL）混合，95 ℃加熱5 min，然后置于冰上快速冷凍10 min，72 ℃孵育30 min后，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增[98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s（25個(gè)循環(huán)）；最后，72 ℃再延伸10 min，4 ℃終止]；其次，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得帶T7 啟動(dòng)子的sgRNA 的DNA 模板，按照20 μL 反應(yīng)體系（去RNA 酶水7 μL、100 mol/mL rNTP 5 μL、300 ng/μL DNA 模板5 μL、10×反應(yīng)緩沖液2 μL，T7 RNA聚合酶1 μL）混合，于37 ℃條件下孵育30 min 以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；最后，使用一步純化法RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化。

1.4.3 核酸內(nèi)切酶裂解實(shí)驗(yàn)

根據(jù)SpCas9核酸酶切試劑盒操作說(shuō)明，將4 μL 10×裂 解 緩 沖 液 與4 μL 指 導(dǎo)RNA（guide RNA,gRNA）混合，90 ℃退火10 min，然后緩慢冷卻到室溫，再加入2 μL Cas9蛋白，室溫孵育60 min后，加入4 μL DNA 底物，37 ℃孵育60 min，最后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分析裂解效果。

1.4.4 psgRNA-mCherry-T2A-Puro 和pLenti-Cas9-T2A-EGFP 慢病毒包裝

將慢病毒psgRNA-mCherry-T2A-Puro 和pLenti-Cas9-T2A-EGFP、包 裝 質(zhì) 粒psPAX2 及pMD2.G組成三質(zhì)粒系統(tǒng)。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)好的293T細(xì)胞鋪在10 cm板上（數(shù)量為5×106），待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%～95%匯合度后，用減血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，然后加入5 mL減血清培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明，分別將psPAX2、pMD2.G、psgRNA-mCherry-T2A-Puro和pLenti-Cas9-T2A-EGFP各7 μg與脂質(zhì)體混合，室溫孵育5 min后，再分別加入到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后，移去含脂質(zhì)體的培養(yǎng)基，更換無(wú)抗生素的高糖DME培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)細(xì)胞，72 h 后收集病毒上清液，以3 000g離心10 min，去掉細(xì)胞殘片，用0.45 μm 濾器過(guò)濾，超速離心濃縮后，分裝，于－80 ℃條件下保存。

1.4.5 CHO 細(xì)胞感染

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHO 細(xì)胞接種到24 孔板上，接種數(shù)量為1×105，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%匯合度后進(jìn)行病毒感染。感染前，吸去細(xì)胞原有培養(yǎng)基，加入1/2體積新鮮培養(yǎng)基，然后將病毒液加入到細(xì)胞中，輕輕按“8”字混勻，在37 ℃條件下小體積感染6～8 h后，補(bǔ)齊培養(yǎng)基至正常體積，感染72 h后，在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)效率。

1.4.6 流式細(xì)胞分析與分選

用2%的胰蛋白酶消化貼壁的CHO 細(xì)胞，然后用磷酸鹽緩沖液重懸成單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)50 μm 尼龍膜過(guò)濾到流式管中，在BD FACSAriaⅡ流式細(xì)胞分選儀器上分析細(xì)胞的熒光比例與強(qiáng)度，并將分選出的具有增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）與紅色熒光蛋白（mCherry）的強(qiáng)雙陽(yáng)性細(xì)胞接種至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA 的設(shè)計(jì)與寡核苷酸鏈的合成

利用CasOT 系統(tǒng)，分析脫靶結(jié)果參數(shù)報(bào)告（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2020.02.151），篩選靶點(diǎn)完全匹配的基因組序列，即選擇A00（sgRNA序列100%匹配對(duì)應(yīng)基因組序列的個(gè)數(shù)）為1的靶點(diǎn)，若A00參數(shù)大于1表示該靶點(diǎn)完全匹配2個(gè)以上的基因組位點(diǎn)，即完全脫靶。共選擇6 對(duì)特異性較好的sgRNA，其在鵝SCD基因組中的位置如圖1 所示（sgRNA1～6），它們的靶向位點(diǎn)及寡核苷酸序列見(jiàn)表1，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的sgRNA，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 sgRNA體外線性化裂解和表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

由圖2 可見(jiàn)：在SpCas9/sgRNANC（陰性對(duì)照組）復(fù)合物的情況下，線性化質(zhì)粒未被裂解；在SpCas9/sgRNA1～6 復(fù)合物的情況下，線性化質(zhì)粒被裂解成2個(gè)條帶，且不同的sgRNA裂解產(chǎn)物與裂解效率不同，其中sgRNA1 和sgRNA3 的剪切效果較好，且測(cè)序結(jié)果顯示，sgRNA1 和sgRNA3 寡核苷酸鏈插入的方向、位置與預(yù)期相符（圖3），證明質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 鵝SCD基因sgRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the sgRNA-targeting sites in goose SCD gene

表1 靶向位點(diǎn)及sgRNA寡核苷酸序列Table 1 Targeting sites and sequences of sgRNA oligonucleotides

圖2 sgRNA體外線性化裂解Fig.2 Linearization cleavage in vitro of sgRNA

2.3 psgRNA-mCherry-T2A-Puro 和pLenti-Cas9-T2A-EGFP 病毒感染CHO 細(xì)胞分析

正常培養(yǎng)CHO細(xì)胞至密度為60%～70%，將病毒液psgRNA-mCherry-T2A-Puro 和pLenti-Cas9-T2A-EGFP 共同感染細(xì)胞，以二者單獨(dú)感染及空白作為陰性對(duì)照。在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，共同感染psgRNA-mCherry-T2A-Puro 和pLenti-Cas9-T2A-EGFP 的CHO 細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)紅色熒光蛋白（mCherry）和增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP），而二者單獨(dú)感染細(xì)胞只表達(dá)其中的一種，空白細(xì)胞不表達(dá)熒光蛋白（圖4），表明二者共同感染CHO細(xì)胞成功。

2.4 流式細(xì)胞分析與分選結(jié)果

圖3 插入sgRNA1和sgRNA3序列的測(cè)序圖Fig.3 Sequencing diagrams of the inserted sgRNA1 and sgRNA3 sequences

將感染后的CHO 細(xì)胞擴(kuò)繁消化，在BD FACSAriaⅡ流式細(xì)胞分析儀上分析細(xì)胞的熒光比例與強(qiáng)度。由圖5 可知，psgRNA1-mCherry-T2APuro 和pLenti-Cas9-T2A-EGFP 共同感染效率為13.4%，psgRNA3-mCherry-T2A-Puro 和pLenti-Cas9-T2A-EGFP 共同感染效率為11.2%，psgRNANCmCherry-T2A-Puro 和pLenti-Cas9-T2A-EGFP 共同感染效率為16.6%。利用分選儀器，分別篩選出強(qiáng)雙陽(yáng)性細(xì)胞群，并接種至24 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，篩選后的細(xì)胞能同時(shí)表達(dá)紅色熒光蛋白和增強(qiáng)綠色熒光蛋白（圖6）。

3 討論

研究表明，鵝卵泡顆粒細(xì)胞具有脂肪酸從頭合成能力[24]，卵泡發(fā)育過(guò)程的組學(xué)研究也證實(shí)了鵝卵泡顆粒細(xì)胞中存在大量脂質(zhì)代謝相關(guān)差異基因，并構(gòu)建了差異基因的表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[25]，表明鵝顆粒細(xì)胞內(nèi)源性脂肪酸對(duì)卵泡發(fā)育起著至關(guān)重要的作用；但目前有關(guān)研究大都集中于肝的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制上，而有關(guān)顆粒細(xì)胞內(nèi)源性脂肪酸合成相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚有待闡明。由于禽類(lèi)在產(chǎn)蛋期需要合成大量中性脂肪（甘油三酯和膽固醇等），并轉(zhuǎn)運(yùn)到生長(zhǎng)中的卵母細(xì)胞以形成卵黃，因此，其肝臟脂肪酸代謝水平顯著提高[26]；而研究表明，SCD基因在高產(chǎn)禽肝組織中的表達(dá)量極顯著高于產(chǎn)蛋前期肝組織中的表達(dá)量，推測(cè)SCD基因參與了禽產(chǎn)蛋期肝臟脂肪酸代謝的生物學(xué)過(guò)程[27]。敲除SCD基因的小鼠模型也表明，SCD的缺失直接或間接地誘導(dǎo)了脂肪酸向氧化而非合成方向分化的信號(hào)表達(dá)，且減少體內(nèi)單不飽和脂肪酸的合成可以造成癌細(xì)胞的死亡[28-29]。而SCD基因也是瘦素信號(hào)的靶基因，可被瘦素抑制[30-31]。在鵝卵泡顆粒細(xì)胞中，已確定瘦素可通過(guò)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路來(lái)調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖、脂肪酸從頭合成及類(lèi)固醇激素合成[24]，且證實(shí)其在“脂質(zhì)代謝平衡-卵泡顆粒細(xì)胞凋亡-卵泡閉鎖”之間發(fā)揮著重要作用[32]。因此，推測(cè)SCD基因可能在卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)源性脂肪酸合成代謝機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

通過(guò)傳統(tǒng)的同源重組方法獲取基因打靶，不僅工作量大而且效率低，而CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)提高了基因定點(diǎn)修飾的效率和精確性。利用該技術(shù)對(duì)天府肉鵝SCD基因做精準(zhǔn)遺傳修飾，通過(guò)模型的建立，制造SCD基因缺陷型，可以更好地研究其在顆粒細(xì)胞的脂肪酸合成代謝過(guò)程中的相關(guān)功能。本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道利用CRISPR-Cas9 構(gòu)建鵝SCD基因慢病毒敲減質(zhì)粒，結(jié)果表明，該載體被成功構(gòu)建并能感染CHO 細(xì)胞，且篩選出了具有mCherry 和EGFP 的雙陽(yáng)性細(xì)胞群并可繼續(xù)培養(yǎng)。這一模型的建立，為探究鵝卵泡顆粒細(xì)胞內(nèi)源性脂肪酸合成代謝的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

圖4 共同感染psgRNA-mCherry-T2A-Puro和pLenti-Cas9-T2A-EGFP的CHO細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察Fig.4 Fluorescence microscope observation on CHO cells by co-transfection of psgRNA-mCherry-T2A-Puro and pLenti-Cas9-T2A-EGFP

圖5 CHO細(xì)胞感染效率的流式分析Fig.5 Analysis of infection efficiency of CHO cells by fluorescence activated cell sorting(FACs)

圖6 流式分選出的強(qiáng)雙陽(yáng)性細(xì)胞群的熒光顯微鏡觀察Fig.6 Fluorescence microscope observation on strong double positive cell groups sorted by the flow sorter

本研究以天府肉鵝為研究對(duì)象，首先設(shè)計(jì)鵝SCD基因的sgRNA序列，然后體外合成并驗(yàn)證其裂解效率，最后利用psPAX2和pMD2.G包裝質(zhì)粒制備psgRNA-mCherry-T2A-Puro 和pLenti-Cas9-T2AEGFP 病毒。結(jié)果表明，psgRNA-mCherry-T2APuro和pLenti-Cas9-T2A-EGFP病毒質(zhì)粒能夠感染CHO 細(xì)胞，并分選出了能同時(shí)表達(dá)mCherry 和EGFP的強(qiáng)雙陽(yáng)性細(xì)胞群。該研究為后續(xù)在鵝原代顆粒細(xì)胞中敲減SCD基因奠定了基礎(chǔ)。