姜雨婷，孫琦，徐煥志，申望，張曉林，范美華，廖智

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，海洋生物蛋白質(zhì)工程研究室，浙江 舟山316022）

生物礦化是生物體沉積礦物質(zhì)的過程，多數(shù)生物礦物質(zhì)為鈣鹽，如貝類貝殼就是由碳酸鈣晶體在貝殼基質(zhì)蛋白指導(dǎo)下形成的生物礦化組織[1]。天然的碳酸鈣晶體的構(gòu)型主要有3 種,分別為文石（aragonite）型、方解石（calcite）型和球霰石（vaterite）型；貝類貝殼中的碳酸鈣晶體呈現(xiàn)出多樣化的層次排列及微觀結(jié)構(gòu)特征[2-3]。貝殼基質(zhì)蛋白對于貝殼的形成以及力學(xué)性能的發(fā)揮起到了極為重要的作用[4]；貝殼的機械強度遠比純碳酸鈣晶體高[5]?？傊?，貝殼基質(zhì)蛋白不僅對貝殼的形成具有重要的指導(dǎo)作用，同時，也對貝殼的力學(xué)性能具有較大貢獻[6-7]。目前，對貝殼基質(zhì)蛋白的研究已成為了解生物礦化分子機制以及基于貝殼的生物材料學(xué)和仿生學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。從不同貝類貝殼中鑒定到的貝殼基質(zhì)蛋白已有數(shù)百種[8-9]，但多數(shù)貝殼基質(zhì)蛋白在貝殼形成過程中的作用及分子機制仍不明確。

厚殼貽貝（Mytilus coruscus）是我國東部海域的重要經(jīng)濟貝類。前期研究表明：厚殼貽貝貝殼主要由珍珠質(zhì)層、纖維棱柱層和肌棱柱層組成[10]；蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，厚殼貽貝中存在60種以上的貝殼基質(zhì)蛋白[11]，包括一種含有鈣調(diào)理蛋白同源（calponin homology,CH）結(jié)構(gòu)域的新型貝殼基質(zhì)蛋白。該蛋白在序列上與轉(zhuǎn)凝蛋白（transgelin）類似，因此被命名為轉(zhuǎn)凝蛋白類蛋白（transgelin-like protein,TLP）；該蛋白家族已先后從厚殼貽貝[11]、紫貽貝[12]、牡蠣[13]以及翡翠貽貝[14]貝殼內(nèi)被鑒定到，說明該蛋白在貝殼中具有一定的保守性，并可能對貝殼的生物礦化具有重要影響，但是其在貝殼形成中的作用目前尚未見報道。

轉(zhuǎn)凝蛋白又稱平滑肌22α（smooth muscle 22 alpha,SM22α）蛋白，屬于鈣調(diào)理蛋白家族成員，可與肌動蛋白相互作用，是一種與細胞骨架相關(guān)的重要蛋白[15]。轉(zhuǎn)凝蛋白通常含有一個CH 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域長度約100 個氨基酸，形成球狀α-螺旋模塊[16]。含鈣調(diào)理蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白通常屬于肌動蛋白絲家族，對細胞骨架及細胞運動具有重要影響[17-19]；同時，鈣調(diào)理蛋白結(jié)構(gòu)域可增加纖維細胞的鈣化現(xiàn)象[17]，說明該蛋白結(jié)構(gòu)域與生物礦化可能存在關(guān)聯(lián)。CH結(jié)構(gòu)域因其在序列上與鈣調(diào)理蛋白具有一定的同源性而得名[20]。CH 結(jié)構(gòu)域具有細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及F-肌動蛋白結(jié)合功能[21-24]?？紤]到轉(zhuǎn)凝蛋白在貽貝貝殼中的存在，以及CH 結(jié)構(gòu)域和鈣調(diào)理蛋白結(jié)構(gòu)域的同源性，我們推測TLP在貝殼的生物礦化過程中可能也發(fā)揮著重要作用。為此，我們對厚殼貽貝貝殼TLP 開展了原核重組表達及功能分析，結(jié)果表明，厚殼貽貝TLP 的重組表達產(chǎn)物對碳酸鈣晶體在形貌、晶型及結(jié)晶速度等方面具有影響。上述研究結(jié)果為深入了解轉(zhuǎn)凝蛋白類蛋白在貝殼生物礦化過程中的作用及其分子機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝TLP 的序列分析

厚殼貽貝TLP 的基因序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，編號為AKS48154.1。TLP的理化性質(zhì)分析通過Expasy 數(shù)據(jù)庫中的Protparam 軟件（http://web.expasy.org/protparam/）在線進行；同源序列搜索、多序列比對和進化樹分析在NCBI網(wǎng)站上利用Blast軟件（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線進行；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測采用SMART 軟件（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線進行；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測于Phyre2服務(wù)器（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）上在線進行；蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測于SWISS-MODEL 服務(wù)器（https://swissmodel.expasy.org/）上在線進行，建模軟件為ProMod3 v1.1.0。

1.2 TLP 的密碼子優(yōu)化、設(shè)計與表達載體的構(gòu)建

對厚殼貽貝TLP的cDNA成熟肽編碼基因序列（長度為1 112 bp）采用OptimumGeneTM技術(shù)平臺（http://www.genscript.com/）進行密碼子優(yōu)化設(shè)計，獲得適于大腸埃希菌表達的目標基因序列。在TLP基因5′端添加多聚組氨酸標簽、NcoⅠ酶切位點（CCATGG）和保護作用堿基（CA）；在3′端添加終止密碼子（TAA）和XhoⅠ酶切位點（CTCGAG）；最終獲得TLP目標基因序列，并由南京金斯瑞生物科技有限公司進行化學(xué)合成。合成后的目標基因經(jīng)測序驗證后，與表達載體（pET28α＋）經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后，在T4-DNA 連接酶作用下進行連接，以構(gòu)建重組表達載體rTLP/pET28α＋。將構(gòu)建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌TOP10 感受態(tài)細胞中，采用平板劃線法置于含卡那霉素的LB（Luria-Bertani）平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落進行聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）鑒定，將陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進一步測序驗證。

1.3 重組TLP 的表達、復(fù)性、純化及鑒定

參照文獻[25]的方法進行TLP 重組表達。重組表達產(chǎn)物采用鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA）純化，使用梯度咪唑溶液洗脫后收集目標蛋白。目標蛋白經(jīng)鎳柱分離后，參照文獻[26]的方法進行透析復(fù)性處理。復(fù)性后的目標蛋白采用反相高效液相色譜法進一步純化。高效液相色譜儀為Waters 600E 型（美國沃特世公司），檢測器為Waters 2487雙波長紫外檢測器（美國沃特世公司），色譜柱為Vydac 208TP C8反相色譜柱。采用二元線性梯度洗脫，其中：A液為含0.1%三氟乙酸的純水；B液為含0.1%三氟乙酸的乙腈，在35 min 內(nèi)，其比例由30%上升至75%；流速為1 mL/min；檢測波長為280 nm。收集主峰進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）檢測，采用12%分離膠，120 V恒壓模式；電泳結(jié)束后經(jīng)固定和考馬斯亮藍G250染料染色，拍照觀察。

1.4 重組TLP 的功能分析

重組TLP的功能分析主要包括體外碳酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)、碳酸鈣晶體結(jié)合和碳酸鈣晶體結(jié)晶速度分析。體外碳酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)參照文獻[27]的方法，其中：方解石型碳酸鈣晶體是將氯化鈣溶液（10 mmol/L）放置于含碳酸銨固體的玻璃干燥罐內(nèi)，利用碳酸銨揮發(fā)出的二氧化碳與氯化鈣溶液反應(yīng)而獲得；文石型碳酸鈣晶體是在上述方法基礎(chǔ)上，預(yù)先在氯化鈣溶液中添加氯化鎂溶液（1∶1 摩爾比），在鎂離子作用下誘導(dǎo)氯化鈣與二氧化碳反應(yīng)而形成。在上述反應(yīng)體系中，分別加入不同質(zhì)量濃度（0、10、30、50 μg/mL）的重組TLP 溶液以判斷重組TLP 對碳酸鈣結(jié)晶的影響。誘導(dǎo)形成的碳酸鈣晶體用去離子水洗滌后均勻分布于蓋玻片上，室溫干燥后經(jīng)真空噴金處理，在Nova_Nano_SEM450場發(fā)射掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）下觀察晶體形貌。碳酸鈣晶體的晶型分析采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared,FTIR）法進行。將誘導(dǎo)形成的碳酸鈣晶體與適量溴化鉀粉末研磨成細粉，混勻后壓成片，進行上機掃描。所用傅里葉變換紅外光譜儀為美國Nicolet Nexus 670。采用透射模式測量，掃描范圍500～2 500 cm－1，掃描次數(shù)32，分辨率4 cm－1。紅外光譜圖采用Omnic 8.2.387軟件進行分析處理。

重組TLP 對碳酸鈣結(jié)晶速度的抑制實驗參照文獻[25]的方法。碳酸鈣晶體的制備如上段所述。蛋白溶液的制備同1.3節(jié)，其中：空白對照組加去離子水；陰性對照組加50 μg/mL 牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）溶液。用Synergy H1型酶標儀（美國Biotec 公司）在600 nm 波長處掃描觀察溶液濁度變化。

重組TLP 與碳酸鈣晶體的結(jié)合實驗參照文獻[25]的方法。事先配置0.45 mg/mL 重組TLP 溶液（溶液1），分別加入2 種晶型的碳酸鈣粉末，充分振蕩混勻后室溫孵育2 h，離心（7 000g，4 ℃，15 min）后收集上清液（溶液2），備用；沉淀經(jīng)去離子水反復(fù)洗滌并離心（7 000g，4 ℃，15 min）后，用5%乙酸進行脫鈣（溶液3）。對溶液1、2 和3 分別進行SDSPAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 厚殼貽貝TLP 的序列特征

厚殼貽貝TLP 基因的天然cDNA 全長為1 112 bp，編碼一個由167 個氨基酸組成的前體肽，其理論分子質(zhì)量為18 879.49 Da，理論等電點為8.28，為堿性蛋白，無信號肽。其核苷酸-氨基酸序列比對見圖1。氨基酸組成分析結(jié)果表明，厚殼貽貝TLP序列中含量最豐富的氨基酸為賴氨酸（10.8%），其次為天冬酰胺（7.8%）和甘氨酸（7.8%）。同源蛋白搜索結(jié)果表明，在數(shù)據(jù)庫中與厚殼貽貝TLP序列相似性較高的蛋白主要為來自紫貽貝（Mytilusgalloprovincialis）的TLP，其序列一致性超過80%。根據(jù)序列同源搜索結(jié)果，選取同源性較高的17條序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果（圖2）表明，厚殼貽貝TLP 首先與地中海貽貝TLP 家族聚為一支，然后進一步與牡蠣TLP家族聚為一支。

由圖3 可見，在軟體動物中，含CH 結(jié)構(gòu)域的蛋白大致可分為4類，分別為僅含1個CH結(jié)構(gòu)域的蛋白（Ⅰ類），含1個CH結(jié)構(gòu)域和1個鈣調(diào)理蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白（Ⅱ類），含1個CH結(jié)構(gòu)域和多個鈣調(diào)理蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白（Ⅲ類），以及含1個CH結(jié)構(gòu)域和1個GAS2 結(jié)構(gòu)域的蛋白（Ⅳ類）。在這4 類蛋白中，厚殼貽貝TLP 屬于第Ⅰ類，含1 個CH 結(jié)構(gòu)域，位于肽段33～143 號氨基酸殘基處；該類蛋白主要包括轉(zhuǎn)凝蛋白（transgelin）、細絲蛋白（filamin）及網(wǎng)蛋白（plectin）?？傊?，厚殼貽貝TLP 與其他軟體動物的同源序列在結(jié)構(gòu)域分布上具有較大差別。

厚殼貽貝TLP的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成，含量為59%（圖4A）。其預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)為球狀α-螺旋域，含有6段α-螺旋（Ⅰ～Ⅵ；圖4B），與已報道的轉(zhuǎn)凝蛋白空間結(jié)構(gòu)類似[28]。其中：6段α-螺旋分別為螺旋Ⅰ（Ala16～Gln29），螺旋Ⅱ（Arg41～Lys49），螺旋Ⅲ（Thr52～Leu61），螺旋Ⅳ（Ala78～Tyr95），螺旋Ⅴ（Thr105～Trp109）與螺旋Ⅵ（Met114～Ala128）；螺旋Ⅳ與螺旋Ⅰ，以及螺旋Ⅱ和螺旋Ⅲ呈垂直狀態(tài)，類似于鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域中經(jīng)典的E/F 手（E/F hand）結(jié)構(gòu)模體。

圖2 厚殼貽貝TLP與17條來自其他軟體動物且一致性在88%以上的同源蛋白序列基于鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of M.coruscus TLP with 17 homologous protein sequences from other mollusks constructed by neighborjoining method

圖3 厚殼貽貝TLP與來自其他軟體動物的同源蛋白序列的結(jié)構(gòu)域分布比較Fig.3 Comparison of domain distribution among M.coruscus TLP and homologous protein sequences from other mollusks

圖4 厚殼貽貝TLP的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of secondary and tertiary structures of M.coruscus TLP

2.2 厚殼貽貝TLP 的重組表達

使用南京金斯瑞生物科技有限公司提供的密碼子分析工具（GenScript rare codon analysis tool）對優(yōu)化前后的目標基因開展密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index, CAI）分析，結(jié)果見圖5。厚殼貽貝天然TLP 編碼序列的開放閱讀框（open reading frame, ORF）長度為504 bp，經(jīng)密碼子優(yōu)化和序列重新設(shè)計后，目標序列長度為525 bp；TLP基因在優(yōu)化前，其CAI 值經(jīng)OptimumGeneTM軟件計算為0.64；優(yōu)化后，其CAI值達到了0.87。CAI值大于0.8，意味著該目標基因在大腸埃希菌中的表達效率較高[29]。

TLP 重組菌經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）誘導(dǎo)表達后，用SDS-PAGE檢測，結(jié)果見圖6。從中可見：厚殼貽貝重組TLP主要在包涵體中表達；目標蛋白條帶的分子質(zhì)量在18 kDa 左右，與預(yù)期分子質(zhì)量吻合；重組TLP蛋白經(jīng)鎳柱分離，在300 mmol/L咪唑濃度下可得到充分洗脫。重組TLP經(jīng)透析復(fù)性后，進一步采用反相高效液相色譜法進行純化，目標蛋白在54%乙腈體積分數(shù)下被洗脫，且純度較高（圖7）。

2.3 重組TLP對碳酸鈣晶體形貌變化的誘導(dǎo)作用

圖5 厚殼貽貝TLP在優(yōu)化前后的密碼子適應(yīng)指數(shù)分析Fig.5 Analysis of codon adaptation index of M. coruscus TLP before and after optimization

厚殼貽貝重組TLP 對碳酸鈣晶體體外結(jié)晶的誘導(dǎo)結(jié)果如圖8～9所示。由圖8可見：天然方解石型碳酸鈣晶體形態(tài)為規(guī)則六面體（圖8A）；而加入50 μg/mL 牛血清白蛋白（陰性對照）對方解石型碳酸鈣晶體的形貌無明顯影響（圖8B）；在低質(zhì)量濃度（10 μg/mL）的重組TLP 誘導(dǎo)下，多數(shù)碳酸鈣晶體的形貌無明顯變化（圖8C）；在30 μg/mL 重組TLP 誘導(dǎo)下，部分碳酸鈣晶體形貌出現(xiàn)了端部放射狀結(jié)構(gòu)（圖8D）；在高質(zhì)量濃度（50 μg/mL）的重組TLP誘導(dǎo)下，部分碳酸鈣晶體呈現(xiàn)出繡球狀形貌（圖8E～F）。由圖9 可見：天然的文石型碳酸鈣晶體以及在牛血清白蛋白作用下，其形態(tài)無明顯區(qū)別，均為球狀（圖9A～B）；而在加入不同質(zhì)量濃度的重組TLP 后，文石型碳酸鈣晶體的形貌出現(xiàn)明顯變化。其中：低質(zhì)量濃度（10 μg/mL）的重組TLP 使部分碳酸鈣晶體的球體表面呈現(xiàn)出凹陷現(xiàn)象（圖9C）；30 μg/mL的重組TLP 使多數(shù)文石型晶體的形貌呈現(xiàn)出中部縊裂現(xiàn)象（圖9D）；50 μg/mL 的重組TLP 使文石型碳酸鈣晶體的形貌進一步改變?yōu)椴灰?guī)則的花瓣狀結(jié)構(gòu)（圖9E～F）。

圖6 厚殼貽貝TLP重組表達和純化后的SDS-PAGE鑒定Fig.6 SDS-PAGE identification of M.coruscus TLP after recombinant expression and purification

圖7 重組TLP復(fù)性后的高效液相色譜法純化Fig.7 Purification of refolded recombinant TLP(rTLP)by high performance liquid chromatography

采用FTIR 法對重組TLP 進行碳酸鈣晶體晶型分析，結(jié)果見圖10。與天然碳酸鈣晶體相比，50 μg/mL 重組TLP對方解石型碳酸鈣晶體的晶型影響較為明顯，多出了一個波數(shù)值為1 035.93 的文石型碳酸鈣晶體特征峰（圖10A2）；而50 μg/mL重組TLP對文石型碳酸鈣晶體的晶型無明顯影響（圖10B2）。

2.4 重組TLP 對碳酸鈣晶體結(jié)晶的抑制作用

采用分光光度計法測定碳酸鈣結(jié)晶的時間曲線以及在重組TLP 作用下，碳酸鈣結(jié)晶速度的變化。結(jié)果（圖11）表明：重組TLP對方解石型碳酸鈣晶體具有明顯的抑制作用，但對重組TLP的質(zhì)量濃度無明顯依賴性；重組TLP對文石型碳酸鈣晶體的結(jié)晶速度在較高質(zhì)量濃度（50μg/mL）下具有促進作用，而在10和30μg/mL質(zhì)量濃度下具有抑制作用。

圖8 方解石型碳酸鈣晶體的掃描電子顯微鏡觀察Fig.8 Scanning electron microscope (SEM) observation on in vitro crystallization of calcite-type calcium carbonate crystal

2.5 重組TLP 與碳酸鈣晶體的結(jié)合作用

重組TLP 與碳酸鈣晶體結(jié)合后的SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖12所示：重組TLP與方解石型晶體有明顯的結(jié)合作用，經(jīng)與碳酸鈣晶體孵育并離心，其上清液中的蛋白條帶明顯變?nèi)?；進一步將結(jié)合了重組TLP 的碳酸鈣晶體經(jīng)5%乙酸脫鈣透析后，重組TLP被釋放出來并在SDS-PAGE中重新出現(xiàn)條帶。而文石型碳酸鈣晶體與TLP結(jié)合后，上清液中蛋白質(zhì)含量未有明顯變化，沉淀經(jīng)脫鈣后也未出現(xiàn)蛋白條帶。

圖9 文石型碳酸鈣晶體的掃描電子顯微鏡觀察Fig.9 SEM observation on in vitro crystallization of aragonitetype calcium carbonate crystal

3 討論

圖10 方解石型和文石型碳酸鈣晶體的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.10 Fourier transform infrared spectra of the calcite-and aragonite-type calcium carbonate crystals

貝殼的形成過程屬于典型的生物礦化現(xiàn)象。生物礦化是指生物通過各種生物大分子對礦化組織進行調(diào)控加工的動態(tài)生理過程[30]。在貝殼的形成過程中，貝殼基質(zhì)蛋白通常作為自組裝結(jié)構(gòu)的礦化體系核心，不僅提供礦物質(zhì)晶體成核的位點，也對晶體的生長和組裝起到調(diào)控作用，包括晶型、晶體生長方向及有序性等方面的調(diào)控[31-33]。目前，貝殼中已報道的各種貝殼基質(zhì)蛋白種類數(shù)已超過1 000種，且在結(jié)構(gòu)上千差萬別，表明貝殼的生物礦化過程有著一套極為復(fù)雜的調(diào)控體系。TLP是從厚殼貽貝貝殼中鑒定到的一種新型貝殼基質(zhì)蛋白[11]。結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，TLP的結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。貝殼基質(zhì)蛋白中α-螺旋與鈣離子的結(jié)合以及鈣離子在水中的溶解度有關(guān)，且有利于碳酸鈣晶體在貝殼中形成高度有序的結(jié)構(gòu)[8]。因此，推測TLP 可能通過其結(jié)構(gòu)中的α-螺旋域在生物礦化中發(fā)揮作用。此外，厚殼貽貝TLP 序列中含有一段典型的CH 結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域通常以單拷貝形式在蛋白中廣泛分布，包括轉(zhuǎn)凝蛋白（transgelin）、親肌肉蛋白（myophilin）、鈣調(diào)理蛋白（calponin）等[34-35]。CH 結(jié)構(gòu)域被認為與肌動蛋白結(jié)合有關(guān)[20]，而在不同物種貝殼中也鑒定到肌動蛋白的存在[11-14]。盡管貝殼中肌動蛋白的存在目前尚有爭議[36]，但是考慮到厚殼貽貝TLP 主要從貝殼的肌棱柱層中被鑒定到，且肌棱柱層是厚殼貽貝后閉殼肌與貝殼直接相連的部位[37]，因此，不排除TLP 可能對肌棱柱層的生物礦化具有影響并在貝殼-肌肉連接界面處發(fā)揮作用。

圖11 重組TLP對碳酸鈣晶體結(jié)晶速度的抑制作用Fig.11 In vitro inhibition of calcium carbonate crystallization by rTLP

本研究采用密碼子優(yōu)化及原核重組表達策略，結(jié)合氧化復(fù)性以及鎳柱和反相高效液相色譜純化，成功獲得重組厚殼貽貝TLP蛋白；體外碳酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)結(jié)果表明，重組TLP對碳酸鈣晶體的晶型具有明顯誘導(dǎo)作用。目前，已鑒定的貝殼基質(zhì)蛋白多數(shù)具有碳酸鈣結(jié)晶誘導(dǎo)作用而導(dǎo)致晶體形貌發(fā)生變化[38-41]，表明貝殼基質(zhì)蛋白可能通過對碳酸鈣晶體的形貌影響而促進貝殼不同微觀層次的形成。此外，F(xiàn)TIR 分析表明，重組TLP 蛋白能誘導(dǎo)方解石型碳酸鈣晶體晶型向文石型轉(zhuǎn)變，但是對文石型晶體的晶型無明顯影響。這表明厚殼貽貝TLP 在貝殼形成過程中，可能針對性地對方解石型晶體具有誘導(dǎo)作用。已知厚殼貽貝貝殼肌棱柱層的碳酸鈣晶型為文石型[10]，因此，TLP蛋白對方解石型碳酸鈣晶型的轉(zhuǎn)變可能與肌棱柱層的形成有關(guān)。進一步對碳酸鈣晶體結(jié)晶速度進行分析表明，重組TLP可以抑制方解石型碳酸鈣晶體的結(jié)晶速度，但是對文石型碳酸鈣晶體結(jié)晶速度的抑制則較為復(fù)雜，表現(xiàn)為低質(zhì)量濃度下的抑制作用和高質(zhì)量濃度下的促進作用。從此前的研究結(jié)果來看，多數(shù)已知的貝殼基質(zhì)蛋白對碳酸鈣晶體的結(jié)晶速度存在抑制作用，例如：厚殼貽貝貝殼膠原蛋白-2（collagen-2；含vWA結(jié)構(gòu)域）對方解石型碳酸鈣晶體的結(jié)晶速度存在抑制作用[25]；合浦珠母貝（Pinctada fucata）貝殼的無定形碳酸鈣結(jié)合蛋白（amorphous calcium carbonatebinding protein,ACCBP；含ACh-binding 結(jié)構(gòu)域）以及Pfy2 對方解石型碳酸鈣晶體的結(jié)晶速度也有明顯的抑制作用[40,42]；而富含賴氨酸的基質(zhì)蛋白-3（lysine-rich matrix protein-3, KRMP-3；含Gly/Tyr結(jié)構(gòu)域）則對文石型碳酸鈣晶體的結(jié)晶速度有抑制作用[38]。此外，來自鮑魚（Haliotis laevigata）貝殼的Perlwapin（含乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域）同樣對方解石型碳酸鈣晶體的結(jié)晶速度有抑制作用[43]。由此可見，不同類型的貝殼基質(zhì)蛋白可能在貝殼形成過程中普遍存在對碳酸鈣晶體結(jié)晶速度的抑制現(xiàn)象。但也有少數(shù)貝殼基質(zhì)蛋白對碳酸鈣晶體的結(jié)晶速度有促進作用，例如，大珠母貝（Pinctada maxima）貝殼的N66（含碳酸酐酶結(jié)構(gòu)域）對文石型碳酸鈣晶體的結(jié)晶速度有促進作用[44]。此前已有報道認為，貝殼基質(zhì)蛋白分子通過吸附于碳酸鈣晶核的表面，對晶體的成核起負調(diào)控作用（對晶體的成核尺寸大小產(chǎn)生影響），并通過吸附于晶體的不同晶面，使得晶體的生長速度受到抑制，進而調(diào)控晶體的形貌[45-46]。進一步的碳酸鈣晶體結(jié)合試驗結(jié)果表明，重組TLP 與方解石型碳酸鈣晶體具有明顯的結(jié)合作用，表明重組TLP可通過與方解石型碳酸鈣晶體結(jié)合而產(chǎn)生調(diào)控作用。但重組TLP 與文石型碳酸鈣晶體并未表現(xiàn)出明顯的結(jié)合作用，這表明TLP在貝殼形成過程中，對文石型碳酸鈣晶體的調(diào)控可能通過其他未知途徑進行，還需進一步的實驗研究。

圖12 重組TLP 與方解石型及文石型碳酸鈣晶體結(jié)合的SDS-PAGE分析Fig.12 SDS-PAGE analysis of rTLP precipitated by calciteand aragonite-type calcium carbonate crystals

綜上所述，本文采用密碼子優(yōu)化及原核重組表達技術(shù)，獲得了重組厚殼貽貝TLP。經(jīng)功能分析發(fā)現(xiàn)，厚殼貽貝TLP 可影響碳酸鈣晶體的形貌和晶型，并對方解石型碳酸鈣晶體具有抑制作用。以上結(jié)果表明，厚殼貽貝TLP 可能在貝殼，特別是肌棱柱層的形成過程中發(fā)揮重要作用。上述研究結(jié)果一方面為探究貽貝貝殼的生物礦化機制提供了線索，另一方面也為基于TLP的后續(xù)蛋白質(zhì)工程研究奠定了基礎(chǔ)。

致謝 浙江大學(xué)電鏡中心宋丹丹老師在掃描電子顯微鏡觀察中提供了大力幫助，謹致謝意！