滿夏夏 高 豪 閆陸飛 張益娟 孫朝霞 韓淵懷 侯思宇

(山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院, 山西 太谷 030801)

葉酸(Folic acid)是一種水溶性的維生素[1]，又稱維生素B9或維生素M，對維持人體健康具有重要作用[2]，葉酸缺乏會導(dǎo)致諸多健康問題[3-4]。谷子(Setariaitalica)是重要的雜糧作物，籽粒脫殼后稱為“小米”[5]。小米作為北方人民的喜愛的食物之一，食用和營養(yǎng)保健價值都非常高。研究表明，小米的葉酸含量顯著高于小麥[6]、水稻[7]等主食類作物，篩選和培育高葉酸含量的谷子品種成為改善人體葉酸缺乏的有效途徑之一[8]。因此，建立一種穩(wěn)定可靠提取、測定小米中葉酸含量的方法極為重要。

當前，關(guān)于植物葉酸提取的方法主要有單酶法、三酶法、水浴浸提法及超聲波提取法等[9-13]。單酶法[14-15]適用于碳水化合物和蛋白較少的組織樣品，如菠菜、黃瓜和卷心菜等。三酶法[16]適用于提取富含碳水化合物和蛋白的組織樣品。不同食物中使用的三酶法提取因素是不同的，提取水稻[7]和大豆[9]中葉酸時，添加淀粉酶、蛋白酶和葉酸軛合酶能夠成功地提取出高質(zhì)量葉酸；提取小麥[17]和玉米[18]的葉酸時，采用與Zhang等[15]提取菠菜中葉酸相同的方法，僅添加一種葉酸軛合酶就能很好地提取出高質(zhì)量葉酸。盡管已報道了一些植物葉酸的提取方法，但是針對小米中葉酸提取方法的研究較少。

對于葉酸檢測技術(shù)，多采用微生物法[19-20]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[21]、高效液相色譜法(HPLC)[10,22]、熒光分光光度計檢測法[13,23]和紫外分光光度計檢測法[24]等，其中前2種方法使用較普遍。微生物法[22-23]常用于檢測大米和嬰幼兒配方乳粉中的葉酸，此方法靈敏度高，操作簡單，但試驗結(jié)果重復(fù)性較差，易受樣品中抗生素及抗葉酸藥物的影響。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]測量精度可達納克級，操作簡便，分離效果較好且結(jié)果準確，但易受內(nèi)源葉酸影響，且儀器運營成本高。HPLC是近年來常用的檢測手段，常用于檢測某一種葉酸衍生物的含量。對于檢測限較低的蔬菜、保健食品等檢測效果較好。

本研究擬采用三酶法和HPLC法對影響小米中葉酸提取及測定的各因素進行優(yōu)化，旨在為規(guī)?；糠治鲂∶准捌渌任锏娜~酸含量提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所選用的谷子品種為‘大白谷’，于2017年種植于山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院試驗基地(112.615° E， 37.438° N)，成熟期收獲谷子單穗，干燥通風處貯藏。

葉酸標準品、蛋白酶購于Sigma公司；甲醇、乙腈購于Fisher公司；大鼠血清購于Dlagnovcum公司；α-淀粉酶購于Merck公司；β-巰基乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、氫氧化鈉、抗壞血酸均購于Merck公司。

1.2 三酶法提取小米中葉酸的單因素及響應(yīng)面優(yōu)化

小米于60 ℃烘箱去除水分，研成粉末后過100目篩。精準稱取樣品0.30 g于2 mL離心管中，加入0.05 mol/L的葉酸提取液(含有l(wèi)%抗壞血酸鈉鹽和0.1% β-巰基乙醇的磷酸緩沖溶液)。隨后加入淀粉酶振蕩混勻，室溫靜置40 min后加入蛋白酶并振蕩混勻，37 ℃孵育1 h。取出樣品后沸水浴10 min，冰浴10 min，4 ℃條件下14 000 r/min離心20 min。取上清加入適量大鼠血清，振蕩混勻并于37 ℃孵育2 h。再次沸水浴10 min后冰浴10 min，離心20 min。轉(zhuǎn)移上清300 μL至棕色液相色譜進樣瓶中，待用。

以小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)的測定值(Y)為考察指標，設(shè)置提取液添加量(A1)、α-淀粉酶添加量(B1)、蛋白酶添加量(C1)和大鼠血清添加量(D1)共4個因素進行單因素試驗，各因素設(shè)5個水平(表1)。

利用軟件Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以Y值為響應(yīng)值，以A1、B1、C1、D1為響應(yīng)變量，進行響應(yīng)面分析。

表1 三酶法提取小米中葉酸試驗因素與水平Table 1 Experimental factors and level of folic acid extraction from foxtail millet by Trienzyme

1.3 HPLC法測定小米中葉酸含量的單因素及響應(yīng)面優(yōu)化

對HPLC法測定小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)的影響因素進行優(yōu)化。以小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)的測定值(Y)為考察指標，選用流速(A2)、流動相pH(B2)、檢測波長(C2)和柱溫(D2)等4個因素進行單因素試驗，各因素及水平見表2。

利用Box-Behnken，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以A2、B2、C2和D2為響應(yīng)變量，Y為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析。

表2 HPLC法測定小米中葉酸試驗因素與水平Table 2 Experimental factors and level of folic acid determination from foxtail millet by HPLC

1.4 葉酸標準品曲線制備

精確稱取0.01 g葉酸標準品，在避光條件下，用葉酸提取液溶解,得到質(zhì)量濃度為2 mg/mL的葉酸標準母液；再分別稀釋母液得到質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、50 μg/mL的標準溶液。取各濃度標準溶液20 μL，進行檢測，每個樣品3次重復(fù)。以峰面積平均值為縱坐標，葉酸質(zhì)量濃度為橫坐標，得到谷子葉酸標準曲線y=0.767 7x-0.039 7(R2=0.999 9)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取因素對小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值的影響

三酶法提取小米中葉酸各因素對葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值的影響見圖1。葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值隨提取液添加量的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當提取液添加量為1 mL時葉酸質(zhì)量分數(shù)測定達到最大值 2.32 μg/g(圖1(a))。α-淀粉酶添加量為20 μL時，葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值最大為2.28 μg/g(圖1(b))。蛋白酶添加量從50 μL增到100 μL時，葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值呈現(xiàn)遞增的趨勢。當?shù)鞍酌柑砑恿繛?100 μL 時葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值達到最大為 2.08 μg/g (圖1(c))。當大鼠血清添加量為25 μL時葉酸質(zhì)量分數(shù)達到最大值2.24 μg/g(圖1(d))。因此選取1 mL提取液添加量、20 μL α-淀粉酶添加量、100 μL蛋白酶添加量和25 μL大鼠血清添加量進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

A1為提取液添加量；B1為α-淀粉酶添加量；C1為蛋白酶添加量；D1為大鼠血清添加量；Y為小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值，圖2同。A1 is extract volum; B1 is α-amylase volum; C1 is protease volum; D1 is rat serum volum; Y is folic acid detection, Fig.2 is the same as this one.圖1 各提取因素對小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值的影響Fig.1 Effects of different extraction conditions on the determination of folic acid concentration values in foxtail millet

2.2 三酶法提取小米葉酸的響應(yīng)面分析

2.2.1模型回歸系數(shù)顯著性檢驗

利用Box-Behnken對得到的各影響因素試驗?zāi)Ｐ?，各影響因素?jīng)多元回歸分析后，得到以小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值(Y)為響應(yīng)變量，以提取液添加量(A1)、α-淀粉酶添加量(B1)、蛋白酶添加量(C1)和大鼠血清添加量(D1)為響應(yīng)值的二次回歸方程為：

Y=2.31+0.29A1+0.16B1-0.067C1-
0.041D1+0.060A1B1-0.3A1C1+
0.31A1D1+0.19B1C1-0.077B1D1-
0.035C1D1-0.78A12-0.43B12-
0.12C12+0.06D12

(1)

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.2各提取因素響應(yīng)面交互作用

提取液添加量(A1)、α-淀粉酶添加量(B1)、蛋白酶添加量(C1)和大鼠血清添加量(D1)交互作用對小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值(Y)影響見圖2。響應(yīng)面坡度越陡峭，等高線越扁，且排列越密集，說明Y對各因素變化敏感，影響顯著。由圖2可知，A1C1、A1D1響應(yīng)面曲線陡峭、相應(yīng)底部的等高線較為密集，呈馬鞍形，說明兩因素之間交互作用顯著，這與顯著性分析結(jié)果相符。A1B1響應(yīng)面對應(yīng)的等高線接近圓形，表明A1B1交互作用對Y的影響不顯著。B1C1、B1D1、C1D1響應(yīng)面曲面較平緩，表明B1和C1、B1和D1、C1和D1交互作用對Y的影響不顯著。

圖2 各因素交互作用對葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值的影響Fig.2 The effect of various factors on the determination of folic acid concentration values

2.2.3最佳提取因素的確定和驗證

通過響應(yīng)面優(yōu)化模型對三酶法的最佳提取因素進行預(yù)測，得到最佳提取因素為：提取液添加量1.09 mL、α-淀粉酶添加量20.88 μL、蛋白酶添加量140 μL、大鼠血清添加量25.88 μL。在此條件下得到的小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值為2.40 μg/g。考慮到實際操作的簡便性，將提取因素確定為：提取液添加量1 mL、α-淀粉酶20 μL、蛋白酶 150 μL、大鼠血清25 μL，經(jīng)多次驗證試驗后，得到的小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值為2.47 μg/g，與理論值基本吻合，證明此試驗優(yōu)化后的各提取因素是可靠的。

2.3 不同測定條件對小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值的影響

HPLC法測定條件對小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值的影響見圖3。流速為1 mL/min時，小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值較大為2.19 μg/g(圖3(a))。流動相pH為6.5時，小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值最大為2.24 μg/g(圖3(b))。小米葉酸的最大吸收波長為280 nm(圖3(c))。在試驗設(shè)置水平范圍內(nèi)，柱溫為30 ℃時，葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值較大為2.25 μg/g(圖3(d))。因此，選取流速1 mL/min、流動相pH=6.5、波長280 nm和柱溫30 ℃進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

A2為流速；B2為流動相pH；C2為檢測波長；D2為柱溫；Y為小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值。圖4同。A2 is flow rate; B2 is mobile phase pH; C2 is detction wavelength; D2 is column temperature; Y is determination of folic acid concentration values in foxtail millet. The same as in Fig.4.圖3 測定條件對小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值的影響Fig.3 Effect of determination conditions on the determination of folic acid concentration values in foxtail millet

2.4 HPLC法測定條件響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1模型回歸系數(shù)顯著性檢驗

根據(jù)流速(A2)、流動相pH(B2)、波長(C2)和柱溫(D2)4個測定條件對小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值(Y)的試驗結(jié)果進行響應(yīng)面優(yōu)化模型試驗，得到二次項回歸方程為：

Y=2.27+0.27A2+0.31B2-0.26C2+
0.051D2+0.38A2B2+0.14A2C2+
0.053A2D2+0.18B2C2+0.027B2D2+
0.0075C2D2-0.60A22-0.41B22-
0.16C22+0.047D22

(2)

表4 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

2.4.2測定條件響應(yīng)面交互作用

流速(A2)、流動相pH(B2)、波長(C2)和柱溫(D2)交互作用對小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值(Y)影響的見圖4。A2B2響應(yīng)面曲線陡峭，表明A2和B2之間相互作用顯著，且隨著A2和B2的增加，小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值先增大后減小。當A2為0.9 mL/min左右時Y最大，B2為6.4左右時Y最大。B2比A2對應(yīng)小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值的拋物線更陡，說明小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值與B2的相關(guān)性較大，A2和B2對Y的影響順序為：B2>A2。A2C2、A2D2、B2C2、B2D2、C2D2響應(yīng)面曲面較平緩，表明它們之間交互作用對Y的影響不顯著。

2.4.3最佳測定因素的確定和驗證

通過響應(yīng)面優(yōu)化模型對小米中葉酸測定的最佳條件進行預(yù)測，最佳條件應(yīng)為流速0.92 mL/min、流動相pH=6.41、波長276.08 nm、柱溫29.61 ℃。在此條件下預(yù)測的小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值為2.48 μg/g。考慮到實際操作的簡便性，將測定條件調(diào)整為：流速1 mL/min、流動相pH=7、檢測波長280 nm、柱溫30 ℃。經(jīng)多次驗證后，小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值為2.51 μg/g，與預(yù)測值基本吻合，說明響應(yīng)面優(yōu)化法得到的二次回歸方程具有較強的實際指導(dǎo)意義。

圖4 測定條件交互作用對小米中葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值的影響Fig.4 Effect of the interaction of determination conditions on the determination of folic acid concentration values in foxtail millet

2.5 HPLC法葉酸測定加標回收率驗證

以葉酸質(zhì)量分數(shù)測定值為2.40 μg/g的小米為樣品，取質(zhì)量濃度為2 μg/μL的葉酸標準母液各0.5、1.0、1.5 μL加入樣品葉酸提取液中，采用優(yōu)化后HPLC法測定葉酸質(zhì)量分數(shù)，每個樣品3次重復(fù)。當加入1、2、3 μg葉酸時，葉酸回收率在分別為96.68%、96.79%和96.78%以上，平均葉酸回收率為97.82%，相對標準偏差RSD為0.79%(表5)。

2.6 HPLC法葉酸測定重復(fù)性驗證

對質(zhì)量濃度為50 μg/mL的葉酸標準溶液和小米樣品葉酸提取液進行測定，每個樣品5次重復(fù)。測得葉酸標準溶液和小米樣品的葉酸質(zhì)量分數(shù)分別為50.06 μg/g和37.12 μg/g，相對標準偏差RSD值分別為0.27%和0.50%，均小于1%(表6)。表明本試驗精密度較好，樣品提取重復(fù)性結(jié)果較好。

表5 葉酸測定加標回收率試驗結(jié)果Table 5 Recovery rate for determination of folic acid with standard addition

表6 葉酸質(zhì)量分數(shù)測定重復(fù)性試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

由于葉酸在提取過程中很容易被氧化降解，采用“三酶法”提取小米中葉酸，可以較好的防止葉酸被氧化。已有研究表明提取不同作物、組織的葉酸，提取液、α-淀粉酶、蛋白酶、大鼠血清添加量不同[7,9]。因此本研究針對“小米”中的葉酸提取條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明提取液添加量為1 mL，淀粉酶20 μL，蛋白酶150 μL，大鼠血清25 μL時提取效果最佳。圖2中A1C1、A1D1響應(yīng)面曲線陡峭、相應(yīng)底部的等高線較為密集，說明兩因素之間交互作用顯著，這與顯著性分析結(jié)果相符。雖然B1C1的等高線呈橢圓形，但是顯著性分析結(jié)果卻顯示并無顯著性關(guān)系(P=0.075 3)，可能原因是α-淀粉酶對試驗結(jié)果有顯著影響，但是蛋白酶使用量對葉酸提取效果并無顯著影響。因此在試驗中，應(yīng)綜合考慮回歸模型顯著性檢驗結(jié)果與響應(yīng)面結(jié)果。

目前測定葉酸的方法很多，Puwastiena等[25]對國際上研究食品葉酸測定的26個實驗室的葉酸檢測方法進行了評價，發(fā)現(xiàn)在使用同一種方法檢測相同食品的葉酸也存在較大變異系數(shù)。因此在食品葉酸分析中，規(guī)范葉酸的提取和檢測方法是極其重要的。雖然目前用于食品葉酸分析的國家標準(GB 5009211—2014)方法是微生物法，但是羅敏婷等[11]在對比微生物法、高效液相色譜法檢測葉酸時發(fā)現(xiàn)，微生物法檢測結(jié)果與樣品明示值偏差過大?！吨腥A人民共和國藥典》[26]第四部中規(guī)定，當待測成分含量為100%時，重復(fù)性RSD可接受范圍為1%，重現(xiàn)性RSD可接受范圍為2%，本研究采用高效液相色譜(HPLC)法測定小米葉酸，平均葉酸回收率為97.82%，相對標準偏差RSD為0.79%。而采用間接熒光法[6]測定小米葉酸含量的相對標準偏差分別為1.68%，可見高效液相色譜法是更適合小米中葉酸測定的方法。

葉酸提取效果是影響葉酸精確定量分析的首要問題，本研究對小米中的葉酸提取條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明提取當液添加量為1 mL，淀粉酶20 μL，蛋白酶150 μL，大鼠血清25 μL時提取效果最好。利用HPLC法測定小米中葉酸含量，發(fā)現(xiàn)當流速1 mL/min、pH為7、檢測波長280 nm、柱溫30 ℃的時測定效果最佳。經(jīng)重復(fù)性試驗證實，該方法穩(wěn)定可靠，可用于大規(guī)模葉酸含量測定。