賈知鋒 王純潔* 敖日格樂 賀美玲 張 欣 徐 進 呂文亭 付 鶴 任書男 田艷萍 劉佳樂

(1.內蒙古農業(yè)大學 獸醫(yī)學院，呼和浩特 010018；2.內蒙古農業(yè)大學 動物科學學院，呼和浩特 010018；3.內蒙古醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，呼和浩特 010110)

在現代養(yǎng)牛業(yè)中，多種病原菌可導致犢牛腹瀉病的發(fā)生，其中致病性大腸桿菌(PathogenicEscherichiacoli)占比重較大[1]。大腸桿菌性動物腹瀉主要是由腸道炎癥引起，常導致犢牛生長發(fā)育停歇、免疫力低下、發(fā)病率和死亡率較高[2]。研究者發(fā)現腹瀉多發(fā)生于幼齡動物均與瘤胃菌群紊亂有關[3]。瘤胃菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、放線菌門和變形菌門等優(yōu)勢菌群形成生物學屏障，起到保護作用[4]。早期瘤胃菌群的形成是在各方面因素(如環(huán)境、母乳和益生菌等)的影響下，才使得犢牛瘤胃提前建立起適應外界環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)[5]。目前臨床治療致病性大腸桿菌病首選抗生素，長期使用抗生素顯著影響胃腸道菌群多樣性，降低藥物療效，出現耐藥性和藥物殘留等問題[6]。因此，研究者開始尋求天然綠色新產品，望其減少抗生素使用。

植物性藥物在進入胃腸道后，促進胃腸道內有益菌的定植，從而形成一道天然屏障來抵御外來病原菌的入侵[7]。草藥復方具有調節(jié)菌群結構和緩解腸道炎癥的作用，有望替代抗生素治療大腸桿菌性動物腹瀉[8]。作為蒙醫(yī)藥學重要部分的蒙藥，以其純天然來源和保肝、保腎、抗菌、消炎、滋補、低殘留、低毒副作用和耐藥性小的作用特點，在當今依然發(fā)揮著不可替代的作用[9]。阿茹拉-7味散(又稱為古方巴特爾-7)屬于經典驗方，被《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準(蒙藥分冊)》收錄，根據其藥效學研究發(fā)現，該方具有清瘟解毒、鎮(zhèn)痛、止痢和提高免疫力等功效[10]，因在治療人類腹瀉[9]、消化性潰瘍[10]和銀霄病[11]等方面有很好的療效，被廣泛應用。然而，阿茹拉-7味散能否提前建立瘤胃菌群環(huán)境來抵御致病性E.coli的入侵，并且與抗炎、免疫形成互作尚未有相關研究。因此，本研究選擇30頭1日齡健康荷斯坦犢牛為試驗動物，建立阿茹拉-7味散早期干預形成瘤胃微生物環(huán)境的動物模型，在牛奶中添加不同劑量的阿茹拉-7味散，通過16S rRNA測序技術對犢牛瘤胃微生物多樣性以及菌落結構組成和豐度進行分析；通過RT-PCR法檢測瘤胃中大腸桿菌的含量；通過ELISA法檢查血清中IL-6、TNF-α、IL-4、IL-2和IFN-γ的含量，探討阿茹拉-7味散在早期建立犢牛瘤胃共生益生微生物組和免疫力形成互動的作用機制，為阿茹拉-7味散生產實踐應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗動物

選擇30頭體重相近(30±2 kg)的1日齡健康荷斯坦犢牛，購自山西河灘奶牛育種有限公司。

1.1.2試驗材料

牛源致病菌EscherichiacoliO1保存于內蒙古農業(yè)大學牛生產學實驗室[12]；鹽酸環(huán)丙沙星購自成都新亨藥業(yè)有限公司；阿茹拉-7味散由訶子、茜草、甘松、翻白草、瞿麥、乳香和草烏葉組成，購自內蒙古呼和浩特市天力藥業(yè)有限公司；KAPA HiFi HotStart ReadyMIX，購自美國KAPA生物公司；瓊脂糖，購自天津基準化學試劑公司；DNA Template Prep Kit 1.0，購自美國太平洋生物學公司；Agilent DNA 12000 Reagents，購自美國安捷倫科技有限公司；DNA Sequencing Bundle 4.0，購自太平洋生物科學公司；ELISA試劑盒購自內蒙古呼和浩特市寶信生物公司。

1.1.3試驗儀器

酶標儀(Synergy HT，上海迭戈生物科技有限公司)；PCR儀(Biosafer公司，德國)。

1.2 試驗方法

1.2.1阿茹拉-7味散的制備

將訶子、茜草、甘松、翻白草、瞿麥、乳香和草烏葉粉碎，過200目篩，再按照3∶2∶2∶2∶1∶2∶2的比例配伍用藥[9]。

1.2.2試驗動物模型的建立及給藥方案

荷斯坦犢牛實驗方案均已獲得內蒙古農業(yè)大學牲畜護理委員會的批準，并按照內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院動物倫理委員會的指導方針進行。1周齡犢牛每日4 L牛奶，分別將試驗藥品混于牛奶中，并于6:30和18:30分別進行人工飼喂。犢牛飼養(yǎng)管理參見文獻[13]。

選擇30頭體重相近1日齡的健康荷斯坦犢牛，隨機分成6組，每組5頭牛見表1。將各試驗藥物混于牛奶中給藥，先給藥4 d，2 次/d，于第5 d早上口服E.coliO1(2.50 × 1011CFU/mL, 100 mL/頭)1 h 后再繼續(xù)給藥，未治療組(Untreated control，UC)、環(huán)丙沙星組(Ciprofloxacin，CIP)、阿茹拉低劑量組(Low dose of Baatar seven powder，BSP.L)、阿茹拉中劑量組(Medium dose of Baatar seven powder，BSP.M)和阿茹拉高劑量組(High dose of Baatar seven powder，BSP.H)組犢牛經口服接種致病性E.coliO1建立腹瀉模型，對照組(Normal control，NC)犢?？诜o菌生理鹽水，其它給藥組再繼續(xù)給藥至第7 d，2 次/d。于第7 d末次給藥1 h后將犢牛在標準化屠宰場放血致死，同時，用采血管頸靜脈采集血液，分離血清，用棉簽采集瘤胃內容物裝入凍存管放于液氮保存用于后續(xù)試驗。

表1 試驗動物模型的建立及給藥方案Table 1 Establishment of experimental animal model and administration plan

1.2.3犢牛血清細胞因子的檢測

第7 d末次給藥1 h后，通過頸靜脈采集犢牛血液，靜止1 h后，離心(在4 ℃下3 000 g離心15 min)分離血清，并保存于-20 ℃冰箱。使用ELISA試劑盒測量IL-6、TNF-α、IL-4、IL-2和 IFN-γ 的含量[14]。

1.2.4細菌DNA的提取和16S rRNA基因序列擴增

給藥7 d后，將犢牛放血致死，采用QIAamp Fast DNA Stool Mini-Kit試劑盒(根據說明書操作)對犢牛瘤胃內容物提取細菌DNA，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢驗細菌DNA純度(OD260/OD280=1.8～2.0)和質量濃度(100 μg/μL)，將合格的DNA置于-80 ℃保存。利用PCR對每份樣品的DNA進行16S rRNA基因V3+V4區(qū)擴增，使用Thermofisher的IonS5TMXL進行上機測序(測序模式為SE600)。正向通用引物為341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)，反向通用引物為805R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。這對引物被用于擴增細菌16S rRNA基因V3+V4區(qū)序列，PCR擴增反應50 μL體系參考[15]：包括10 ng/μL(5 μL)模板DNA、5 μL Taq聚合酶(5 U/μL；TaKaRa，Japan)以及上下游引物各1 μL(10 μmol/L)。使用GeneJET 膠回收試劑盒(Thermo Scientific 公司)回收PCR純化產物。最后將純化產物送往北京諾禾致源科技股份有限公司上機測序。利用Qiime軟件(Version 1.9.1)分析Alpha多樣性[16]。

大腸桿菌檢測：將腹瀉犢牛瘤胃內容物合格的DNA用熒光定量PCR法檢測大腸桿菌O1:K88(引物設計：F:5′-AAGGGAAATGTGGTGAAA-3′；R:5′- CGGTTTCTTCTTGTTAATCG-3′)的含量。反應體系為25 μL：12.5 μL的PCR Master Mix，上下游引物各1.0 μL，DNA模板3.0 μL，7.5 μL ddH2O，PCR程序設置：預變性(92 ℃，45 s)，變性(92 ℃，30 s)，退火(60 ℃，45 s)，延伸(72 ℃，1 min)，共40個循環(huán)，終端延伸(72 ℃，45 s)，終止(4 ℃)[8]。

1.3 數據統計

數據用平均數±標準誤表示。采用SPSS 22.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 犢牛瘤胃內容物細菌菌落Alpha多樣性分析

香農指數(Shannon index)、辛普森指數(Simpson index)、Chao1指數和ACE豐富度指數是用于評估物種的多樣性和豐富度見表2。給藥 7 d 后，與NC組相比，UC組中Shannon 指數,(P=0.114)、(Simpson 指數(P=0.768)和Chao1指數(P=0.053)無顯著差異，但ACE指數在UC組中顯著降低(P=0.013)；與UC組相比，BSP.M組中Chao1指數(P=0.001)、Shannon指數(P=0.023)和ACE指數(P=0.000 1)顯著升高；BSP.L組中Shannon 指數、Simpson 指數和ACE指數較UC組顯著降低(均為P=0.000 1)，BSP.H組中多樣性指數無顯著性差異(P>0.05)；說明BSP.M組的犢牛瘤胃微生物菌群多樣性和豐富度較高。結果表明，BSP.M組樣品表現出較高水平的細菌生物多樣性。

表2 不同劑量的阿茹拉-7味散對犢牛瘤胃微生物Alpha多樣性的影響Table 2 Effects of different doses of Baatar-7 powder on calf rumen microbial Alpha diversity

2.2 阿茹拉-7味散早期干預形成的瘤胃微生物對感染致病性大腸桿菌犢牛細菌門、屬水平菌群豐度的影響

給藥7 d后，為尋找6組之間優(yōu)勢物種的差異，通過Version 3.8.31比對發(fā)現，6組樣本在門和屬水平上平均豐度(存在顯著差異)排名前10的物種見表3。在門水平，與NC組相比，UC組中梭桿菌門、變形菌門、放線菌門和梭桿菌屬的豐度均極顯著升高(P<0.05)；在屬水平，UC組中擬桿菌屬(P=0.975)、柔嫩梭菌屬(P=0.926)和毛螺菌球菌屬(P=0.234)的豐度較NC組均無顯著變化。

與UC組相比，BSP.L、BSP.M和BSP.H組中梭桿菌門和變形菌門的豐度極顯著降低(P<0.05)，并且BSP.L和BSP.H組中放線菌門的豐度極顯著降低(P=0.000 1)；BSP.L組中柔嫩梭菌屬顯著升高(P=0.045)，BSP.L(P=0.001)和 BSP.M 組(P=0.001)中毛螺菌球菌屬的豐度顯著升高(P<0.05)。

表3 不同劑量的阿茹拉-7味散對犢牛瘤胃微生物豐度的影響Table 3 Effects of different doses of Baatar-7 powder on the rumen microbial structure of calves %

2.3 阿茹拉-7味散早期干預形成的瘤胃微生物對感染致病性大腸桿菌犢牛瘤胃中大腸桿菌含量的影響

通過RT-PCR定量分析犢牛瘤胃中大腸桿菌的含量見表4。給藥7 d后，與NC組相比，UC組中大腸桿菌的含量顯著升高(P=0.000 1)；與UC組相比，BSP.L(P=0.004)、BSP.M(P=0.002)和BSP.H組(P=0.001)中大腸桿菌的含量顯著下降(P<0.05)；與CIP組相比，BSP.M(P=0.070)和BSP.H組(P=0.101)中大腸桿菌的含量無顯著差異，說明BSP.M和BSP.H組可降低大腸桿菌的水平，并與CIP相當。

表4 不同劑量的阿茹拉-7味散對犢牛瘤胃中大腸桿菌含量的影響Table 4 Effects of different doses of Baatar-7 powder on the content ofE.coli in the rumen of calves lgCFU/g

2.4 阿茹拉-7味散早期干預形成的瘤胃微生物對感染致病性大腸桿菌犢牛腹瀉率、體重以及平均日增重的影響

阿茹拉-7味散對腹瀉犢牛腹瀉率的影響見圖1(a)。給藥7 d后，NC組無腹瀉；UC組犢牛腹瀉率達80%；各用藥組使犢牛腹瀉率急劇下降；BSP.M和BSP.H組犢牛腹瀉率與CIP相同，下降到20%，說明BSP可降低犢牛感染致病性E.coli引起腹瀉發(fā)生的風險。

阿茹拉-7味散早期干預形成的瘤胃微生物對大腸桿菌性犢牛體重增加的影響見圖1(b)，給藥第0 d，各試驗組之間新生犢牛體重差異不顯著(P>0.05)；給藥7 d后，與NC組相比，UC組犢牛體重(P=0.021，圖1(c))和日增重(P=0.002，圖1(d))顯著降低(P<0.05)；與UC組相比，BSP.M和BSP.H組犢牛體重和日增重顯著升高(均為P=0.001，P<0.05)，說明飼喂BSP.M和BSP.H可維持腹瀉犢牛體重，有利于日增重增加。

在相同的直方圖中，具有相同小字母上標的值均無顯著性差異(P>0.05)，而具有不同小寫字母上標的值均具有顯著性差異(P<0.05)。The values with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).圖1 不同組別的犢牛腹瀉率、體重以及平均日增重Fig.1 The effect of different groups on diarrhea rate，weight gain and average daily gain of diarrhea calves

2.5 阿茹拉-7味散對感染致病性E.coli O1犢牛血清中免疫細胞因子的影響

阿茹拉-7味散對犢牛血清中抗炎、免疫細胞因子的影響見表5，給藥7 d后，與NC組相比，UC組血清中IL-4(P=0.007)、IL-2(P=0.000 1)和IFN-γ(P=0.021)的含量顯著下降，但TNF-α(P=0.010)的含量顯著升高；與UC組相比，BSP.M組血清中IL-4的含量顯著升高(P=0.006)，并與NC(P=0.982)和CIP組(P=0.421)持平；BSP.L、BSP.M和BSP.H組血清中IL-2和IFN-γ的含量顯著升高(均P<0.05)；BSP.M和BSP.H組中IL-6和TNF-α的含量顯著降低(均P<0.05)，說明BSP可防止炎癥的發(fā)生，調節(jié)抗炎、免疫因子的表達，增強機體免疫力。

3 討 論

已有研究表明致病性大腸桿菌是引起犢牛腹瀉最主要的致病菌[2]。植物性藥物通過調節(jié)腸道微生物可減輕葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎[17]，因此，植物性藥物具有抑菌、殺菌、消炎、提高免疫力和改善胃腸道菌群等多種功能[4]?；谥参镄运幬锸嵌喟悬c、多水平的作用藥物，通過飼料中添加不同劑量的藤黃提取物(藤黃素)對腹瀉仔豬研究發(fā)現，藤黃素中、高劑量組中Shannon指數、Simpson指數和Chao1指數顯著高于對照組，并且中劑量組在調節(jié)腸道菌群多樣性方面效果優(yōu)于高劑量組[16]。因此，篩選出最佳劑量的植物性藥物對臨床用藥具有指導意義。本研究中，與UC組和阿茹拉-7味散高劑量藥物相比， BSP.M組多樣性指數(Shannon指數和ACE指數)顯著升高，說明阿茹拉-7味散中劑量藥物瘤胃微生物豐富度和多樣性高于UC組和中劑量藥物，本研究與Wang等[16]試驗結果一致。

出生3日齡的犢牛瘤胃中優(yōu)勢菌門主要為擬桿菌門，有利于降解非纖維物質，而成年反芻動物瘤胃中優(yōu)勢菌門主要為厚壁菌門，可降解纖維物質；隨著犢牛的成長，犢牛瘤胃中擬桿菌門數量逐漸減少，厚壁菌門數量逐漸增加[18]。本研究中，與UC和CIP組相比，BSP.L和BSP.M組犢牛瘤胃內厚壁菌門細菌顯著升高，擬桿菌門顯著降低，這說明飼喂阿茹拉-7味散改變犢牛瘤胃微生物結構可能有利于提前建立適應日糧的轉化。多數梭桿菌門內的細菌是條件致病菌，而變形菌門包含大腸桿菌，多數為致病菌，易造成動物機體損傷，炎癥加重[19]。本研究中，不同劑量的BSP可顯著降低犢牛瘤胃內梭桿菌門、變形菌門和大腸桿菌數量，并與抗生素組相當，這說明飼喂阿茹拉-7味散具有抑制致病菌生長的作用，有望減少抗生素的使用。

表5 不同劑量的阿茹拉-7味散對犢牛血清免疫細胞因子的影響Table 5 Effects of Baatar-7 powder on immune cytokines in calves pg/mL

在內熱證中厚壁菌門豐度降低，擬桿菌門的豐度升高，一些清熱證復方使擬桿菌門的豐度顯著降低[20]。靈芝菌絲體水提物可通過降低變形菌門的豐度保護腸道損傷，逆轉菌群結構紊亂，減少 TNF-α 和IL-6的產生，炎癥減輕[21]，因此可將變形菌門和大腸桿菌作為疾病微生物信號指標。梭桿菌門包含多種致病菌(如產氣莢膜梭菌)，產氣莢膜梭菌對動物具有很大的毒性，可破壞腸黏膜結構[22]。本研究中，與UC組相比，BSP可顯著增加犢牛血清中IL-2和IFN-γ的含量以及增加瘤胃微生物厚壁菌門的豐度；BSP.M和BSP.H組顯著降低IL-6、TNF-α的含量和顯著降低梭桿菌門和變形菌門的豐度，這說明飼喂BSP可通過增加厚壁菌門的細菌，抑制梭桿菌門和變形菌門細菌的生長有利于預防炎癥的發(fā)生。

舒迎霜等[19]發(fā)現黃芪總皂苷使結腸炎模型動物腸道中柔嫩梭菌屬和毛螺菌球菌屬增加，降低梭桿菌屬和大腸桿菌的含量，降低腸道炎癥，從而起到保護腸道的作用。Yan等[23]研究發(fā)現，黃芪多糖通過降低梭桿菌屬的豐度，從而增加了抗炎(如IL-2、IFN-γ和IL-4等)水平。在本研究中，UC隨著BSP.L和BSP.M組犢牛瘤胃內毛螺菌球菌屬和柔嫩梭菌屬數量的升高，梭桿菌屬和大腸桿菌數量的降低，TNF-α和IL-6的產生減少，從這些結果推測阿茹拉-7味散可提前建立有益菌來避免致病菌直接與腸壁接觸，增強了IL-2、IFN-γ和IL-4的表達，減少炎癥發(fā)生，提高了免疫力，促進了體重增加，最終達到降低腹瀉的目的。

近年來，飼料安全問題備受關注，純天然、無公害、無抗生素殘留和功能全面的草藥成為國內外研究的熱點。在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，抗生素大量、廣泛使用，迅速形成多種抗生素耐藥的大量菌株，降低藥物療效。該方是一種以純天然植物為原料，具有很強的保肝、保腎、抗菌、消炎、滋補、低殘留、低毒副作用、耐藥性小、調節(jié)胃腸道菌群和提高免疫力的作用特點。本研究表明，阿茹拉-7味散早期干預建立的瘤胃微生物環(huán)境在一定程度上可使感染致病性E.coliO1犢牛瘤胃內菌群數量增多，多樣性升高，且阿茹拉-7味散可使瘤胃內菌群結構發(fā)生變化，益生菌所占比例增加，條件致病菌水平下降，提高其抗炎、免疫機能，增強動物機體免疫功能，從而降低腹瀉發(fā)生率。本研究為進一步開發(fā)利用植物性藥物來改善感染大腸桿菌犢牛腹瀉，提高機體抗炎、免疫和胃腸道菌群的功能提供了基礎，并為植物性藥物的生物學效應及其作為功能性飼料添加劑的潛力提供了理論基礎和實驗數據。