李立坤，張小軍，么安亮，王 勇，劉 健，胡錦洋，程代川，曹鳳宏

0 引 言

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性最常見惡性腫瘤之一[1]，根據(jù)2019年美國癌癥協(xié)會癌癥統(tǒng)計結果顯示，美國PCa發(fā)病率位居男性腫瘤之首，死亡率位于男性惡性腫瘤第二，僅次于肺癌[2]。近年來，我國PCa發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，且增長速度比歐美國家更為迅速[3]。PCa的發(fā)生與基因、遺傳、年齡、種族等多種因素密切相關[4]。前期課題組對Pubmed數(shù)據(jù)庫中關于PCa基因組學和蛋白組學的文獻進行了深入的信息學分析[5]，發(fā)現(xiàn)STOML2基因被多個研究小組獨立發(fā)現(xiàn)[6-7]，目前發(fā)現(xiàn)在頭頸鱗癌、甲狀腺乳頭狀癌、胃癌、結腸癌、肺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中STOML2高表達[8-13]，干預STOML2表達可以影響腫瘤的生物學特性，提示STOML2基因改變可能是多種腫瘤發(fā)生的共同途徑。我們課題組對臨床PCa組織標本的研究表明[14]，PCa組織中STOML2蛋白的表達水平明顯高于前列腺增生組織，并發(fā)現(xiàn)PCa遠處轉移與STOML2蛋白表達水平密切相關。提示STOML2可能在PCa發(fā)病中起重要作用。本研究旨在探究敲低STOML2基因對前列腺癌PC3細胞增殖、體外遷移及細胞線粒體膜電位等腫瘤生物學功能的影響，并初步探索其機制，以期豐富PCa發(fā)病機制，為提PCa治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco)，青霉素、鏈霉素(石藥集團)，STOML2基因引物(北京金唯智科技有限公司)，質粒載體Pll3.7-EGFP、包裝質粒psPAX2和pMD2.G(中日友好醫(yī)院臨床研究所贈予)，STOML2抗體(Abcam公司)，鼠抗人β-actin抗體和IgG抗體(南京三箭)，MTT(四唑鹽)試劑(美國Thermo公司)，TMRE試劑盒(Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本尼康)，超微量分光光度計Q5000(Quawell)，流式細胞儀FACSCalibur(BD公司)，蛋白垂直電泳儀Mini-proteinIII(美國Bio-Rad公司)，成像儀ChemiDocTMXRS+(美國Bio-Rad公司)。

1.2細胞系及細胞培養(yǎng)人前列腺癌PC3細胞、HEK293T細胞購于北京協(xié)和細胞資源中心。PC3細胞用含有10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至70%～80%密度時，按照1∶3比例進行消化并傳代。

1.3慢病毒載體構建及鑒定構建Pll3.7-EGFP質粒并帶有U6啟動子的敲低組(LV-SHSTOML2)和隨機序列對照組(LV-SHCON)重組質粒(中日友好醫(yī)院贈予)，NCBI中查詢STOML2的基因序列及mRNA，根據(jù)shDNA設計原則設計引物。其干擾敲低靶點序列：STOML2 shDNA：上游引物：5'-TCCGTTATGAGATCAAGGATATCCTTCAAGAGAGGATATCCTTGATCTCATAACGGTTTTTTC-3'；下游引物：5'-GAAAAACCGTTATGAGATCAAGGATATCCTCTCTTGAAGGATATCCTTGATCTCATAACGGA-3'。隨機序列：STOML2 shDNA-Con：上游引物:5′-TGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGAGAGCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTC-3′;下游引物：5′-GAAAAAAGACTTCATAAGGCGCATGCTCTCTTGAAGCATGCGCCTTATGAAGTCA-3′。

1.4質粒提取和慢病毒包裝將shDNA-STOML2及SHCON序列重組入PLL3.7。將前述攜帶敲低STOML2序列和隨機序列的重組質粒及包裝質粒用堿裂解法大量抽提，PEG8000-Mgcl2法純化質粒，超微量分光光度計測量質粒濃度，以A260/280以1.88～1.92為最佳，重復3次取均值。選擇對數(shù)期生長的HEK293T細胞，將目的質粒、psPAX2和pMD2.G包裝質粒按照4∶2∶1比例進行病毒包裝，48 h后離心收集上清并測量病毒滴度。

1.5PC3細胞感染及分組胰酶消化對數(shù)生長期PC3細胞，按4×105個/孔接種于6孔板中，待細胞融合度為30%～40%時，分別加入shDNA-STOML2及SHCON的病毒進行感染，24 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后觀察轉染細胞的綠色熒光量80%～90%后，胰酶消化以0.5～1個細胞密度接種至96孔板，每5～7天換液1次，小孔內長滿接種于24孔板，長滿以后再接種于6孔板。取對數(shù)生長期的PC3細胞，根據(jù)細胞中綠色熒光蛋白的表達情況以評定轉染效率。提取熒光量接近100%細胞組蛋白，用Western blot法檢測細胞內STOML2蛋白表達量，以未轉染前列腺癌細胞PC3為空白對照組，以轉染隨機序列為陰性對照組，以轉染shDNA-STOML2慢病毒載體為敲低組。

1.6MTT實驗檢測PC3細胞的增殖能力為了觀察STOML2基因對細胞增殖的影響，收集對數(shù)生長期的空白對照組、陰性對照組和敲低組前列腺癌PC3細胞接種在96孔板(4×103個/孔)，每組設5個復孔，培養(yǎng)24、48 h后，加入MTT溶液后孵育4 h，吸去MTT培養(yǎng)基混合液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床震蕩10 min，酶標儀測定A值(490 nm、單波長)。

1.7細胞劃痕愈合實驗檢測PC3細胞的體外遷移能力選擇對數(shù)生長期的空白對照組、陰性對照組和敲低組前列腺癌PC3細胞接種在6孔板中，每組做3個復孔，待各組細胞貼壁后密度達80%左右時，無菌槍頭垂直于底部做直線劃痕。于0、24、48 h培養(yǎng)結束后，選擇相同位置拍照取樣。用Image J處理圖像，計算劃痕愈合率。實驗重復3次。劃痕愈合率公式計算如下：

劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕面積-t h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%

1.8流式細胞儀檢測PC3細胞線粒體膜電位水平收集對數(shù)生長期的空白對照組、陰性對照組和敲低組前列腺癌PC3細胞，0.25%胰酶消化加入完全培養(yǎng)基終止消化，以1000 r/min(離心半徑15 cm)離心5 min收集細胞，PBS沖洗2次，保證洗去血清。加入0.5 mL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，隨后加入TMRE，終濃度為100 nmol/L，放入37 ℃孵育30 min后上流式細胞儀進行線粒體膜電位檢測。

1.9Western blot檢測前列腺癌PC3細胞中STOML2、p-erk、Erk和p-akt、Akt蛋白的表達收集處于對數(shù)期生長期空白對照組、陰性對照組和敲低組前列腺癌PC3細胞，常規(guī)細胞總蛋白提取，每孔上樣15 μg，10% SDS-PAGE 15V電泳30 min，硝酸纖維素膜15 V半干轉轉膜20 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，之后將條帶放入anti-STOML2(1∶500)、p-erk(1∶500)、Erk(1∶500)、p-akt(1∶500)、Akt(1∶500)和β-actin(1∶3000),4 ℃孵育過夜；次日TBST洗滌3次后二抗孵育2 h，成像儀獲取化學自發(fā)光顯影，Image J軟件進行計算分析條帶。

2 結 果

2.1敲低STOML2基因在人前列腺癌PC3細胞株的建立和鑒定對連結的質粒進行測序驗證，敲低及隨機序列對照組質粒的插入序列與設計100%吻合，見圖1。質粒載體PLL3.7-EGFP攜帶有綠色熒光編碼序列，可反映轉染效率，可見轉染的陰性對照組和敲低組中綠色熒光布滿視野，綠色熒光量均接近100%，模型構建成功，見圖2。

a：敲低組； b：陰性對照組

圖 2 質粒載體PLL3.7-EGFP在各組PC3細胞慢病毒轉染效率( ×200)

2.2敲低STOML2基因組STOML2蛋白的表達敲低組STOML2/β-actin相對表達水平較陰性對照組明顯較少(P<0.01)，提示模型構建成功。見圖3。

1:空白對照組； 2：陰性對照組； 3：敲低組

2.3敲低STOML2基因對人前列腺癌PC3細胞增殖能力增強MTT法檢測結果：敲低組24、48、72 h時A值高于陰性對照組(P<0.05)，見表1。

表 1 MTT法檢測感染慢病毒后PC3細胞增殖能力的影響

2.4敲低STOML2基因后人前列腺癌PC3細胞體外遷移能力降低體外細胞劃痕實驗結果，與陰性對照組細胞比較，24h和48h后敲低組細胞的遷移率顯著下降(P<0.05)。結果提示，敲低STOML2基因后抑制前列腺癌PC3細胞的體外遷移能力。見圖4、圖5。

圖 4 鏡下觀察敲低STOML2后PC3細胞橫向遷移能力

與陰性對照組相比，*P<0.01

2.5敲低STOML2基因后人前列腺癌PC3線粒體膜電位的水平升高敲低組細胞膜電位水平高于轉染隨機序列陰性對照組(P<0.01)。見圖6、圖7。提示敲低STOML2基因能夠提高前列腺癌PC3細胞膜電位水平。

2.6Western blot檢測各組p-erk、Erk、p-akt和Akt結果與陰性對照組細胞比較，敲低組PC3細胞中p-erk、Akt蛋白表達量降低，p-akt蛋白表達量升高(P<0.05)；而Erk蛋白表達量變化差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖8。上述結果提示敲低STOML2基因能夠降低Akt、p-erk，而增高p-akt蛋白表達量。

圖 6 流式細胞儀檢測敲低STOML2后PC3細胞線粒體膜電位

與陰性對照組相比，*P<0.01

1:空白對照組； 2：陰性對照組； 3：敲低組

3 討 論

PCa是發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[15]。PCa是一種進展緩慢的癌癥，在疾病早期階段，患者多無明顯癥狀，然而當PCa患者就診時以中晚期為主，并發(fā)生多處轉移，患者的生存期也大為縮短[16]，然而現(xiàn)階段尚無完善、有效的治療策略應對晚期PCa患者。因此，迫切需要對PCa的發(fā)生、發(fā)展機制進行深入的研究，以便對PCa臨床的診療工作提供指導。

前期研究發(fā)現(xiàn)STOML2蛋白在PCa患者和前列腺增生患者中差異表達且與轉移相關[14]，提示STOML2基因與腫瘤發(fā)生和遷移密切相關。選取前列腺癌PC3細胞系作為研究對象，PC3細胞系是從人前列腺癌骨轉移腫瘤中分離出來的，是雄激素非依賴性前列腺癌細胞，分化程度低，惡性程度高，具有較強的轉移潛能，被廣泛用于雄激素抵抗型的前列腺癌的研究[17]。運用慢病毒技術敲低了PC3細胞STOML2基因，PC3細胞出現(xiàn)了增殖加快而遷移降低的現(xiàn)象，提示敲低STOML2基因可能在PCa發(fā)生中是一把雙刃劍，既能促進PCa細胞增殖，又能抑制PCa細胞的遷移。

STOML2是stomatin超家族成員，定位于9p13.1，編碼的STOML2蛋白由357個氨基酸殘基組成[18]。研究表明，STOML2主要定位在線粒體內膜上[19]，并與心磷脂蛋白及抗增殖蛋白在線粒體內膜上形成特化的功能膜微區(qū)，這些區(qū)域對線粒體呼吸鏈復合物的活性、調控線粒體呼吸功能至關重要[20-21]。腫瘤發(fā)生時會發(fā)生瓦博格效應，即腫瘤細胞即使在有氧情況下也減少有氧氧化，通過無氧酵解獲取能量[22-23]。敲低STOML2后線粒體膜電位增高，提示此時PC3細胞瓦博格效應減弱，細胞部分恢復正常代謝，STOML2基因對腫瘤代謝的影響還需進一步研究。

Erk廣泛存于人體組織，參與細胞增殖、凋亡、侵襲遷移和自噬等調控[24]，Erk激活可抑制腫瘤包括前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[25-27]。前列腺癌PC3細胞敲低STOML2基因后，Erk蛋白總量沒有改變，但Erk磷酸化水平降低，提示Erk通路活化水平降低。Erk蛋白腫瘤細胞轉移密切相關，Erk活化后能使金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9表達增強[28]，而敲低Erk能使MMP-2和MMP-9表達降低[29]。提示敲低STOML2基因可以通過下調Erk通路，抑制PC3細胞轉移。

PC3細胞敲低STOML2基因后，Akt表達雖然降低，但Akt磷酸化水平卻大幅增高，提示此時Akt途徑增高。Akt在腫瘤細胞的增殖和存活中有重要作用[30-31]。p-akt通過激活核糖體蛋白S6增加核糖體生物合成，抑制ERBB2基因等癌基因的過表達，抑制BAD、BCL2等凋亡分子的磷酸化，使細胞存活和增殖增加[32-33]。提示STOML2基因被敲低后，Akt通路被激活，細胞增殖加快、存活增加。

綜上，敲低STOML2基因可以使PC3細胞增殖速度加快，體外遷移能力降低。這些腫瘤生物學改變可能與PC3細胞膜電位增加、Akt通路被激活和Erk通路降低有關。提示STOML2基因在PCa發(fā)生及轉移中起到雙重作用。隨著對STOML2基因在PCa發(fā)病中作用的深入認識，能為前列腺癌的臨床診療工作提供新的思路。