董志杰，周新科，潘勁輝，林銘珍，林 海，梁 敏，姚文霞

0 引 言

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類經(jīng)反向剪接后、由3′端和5′端共價(jià)結(jié)合形成閉合環(huán)狀的非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)，廣泛存在于各種真核生物中[1]。由于對(duì)circRNA的研究還不夠深入，其被認(rèn)為是RNA剪接過程中的隨機(jī)產(chǎn)物[2]。近年來隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的circRNA被相繼發(fā)現(xiàn)，circRNA也被重新認(rèn)識(shí)[3-4]。circRNA具有細(xì)胞特異性表達(dá)[5]、跨物種高度保守[6]等特征，在許多生物過程以及疾病中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能[7]。目前報(bào)道的主要功能有：充當(dāng)miRNA海綿[8]、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[9]、與RNA結(jié)合蛋白相互作用[10]以及翻譯成多肽[11]等。

作為超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)家族的主要成員之一，SOD2基因編碼的錳超氧化物歧化酶主要分布在線粒體中，能夠清除線粒體產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，是細(xì)胞不可或缺的抗氧化酶[12]。SOD2表達(dá)及活性的降低將導(dǎo)致對(duì)線粒體產(chǎn)生的超氧陰離子的清除作用降低，從而導(dǎo)致線粒體DNA的損傷。另外，SOD2還參與細(xì)胞的能量代謝、周期調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡等生理過程[13-14]，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。本研究通過預(yù)測(cè)SOD2基因來源環(huán)狀RNA hsa_circ_0004662的靶miRNA以及miRNA的靶基因，構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行GO和KEGG通路分析，為深入研究hsa_circ_0004662 的特征和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料TRIzol試劑、引物購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Code NO.:RR047A)、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Code NO.:RR820A)、RNase-free H2O均購自TaKaRa公司，細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、雙抗(青霉素及鏈霉素)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購自Gibco公司，DNA marker(Cat.M10-02)購自O(shè)MEGA公司，DNA loading buffer購自Takara公司，PARIS Kit(AM1921)購自生命技術(shù)公司，RNase R(Epicentre，RNR07250)購自ILLUMINA公司，RNase R純化試劑盒RNeasy MinElute Cleanup Kit購自Qiagen公司。

1.2hsa_circ_0004662反向剪接位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證根據(jù)在circBase(http://www.circbase.org/)[15]上檢索得到的hsa_circ_0004662序列，設(shè)計(jì)一對(duì)雙向引物來擴(kuò)增出包含反向剪接位點(diǎn)的序列，引物序列為：Forward Primer 5′-CACGATCGTTATGCTGAGAGA -3′；Reverse Primer 5′-AGCCGTCAGCTTCTCCTTA -3′。PCR擴(kuò)增的模板為細(xì)胞的cDNA， 擴(kuò)增產(chǎn)物為202 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行一代測(cè)序。

1.3核糖核酸酶R(Ribonudease R, RNase R)處理

1.3.1 RNA提取收集細(xì)胞，用Trizol法提出細(xì)胞的總RNA。

1.3.2RNase R消化實(shí)驗(yàn)分為RNase R組和對(duì)照組，各10 μg RNA，分別加入20 U(2 U/μg)的RNase R和等量的ddH2O，37 ℃孵育10 min。

1.3.3RNA純化使用RNeasy MinElute Cleanup Kit試劑盒純化經(jīng)RNase R消化得到的RNA，隨后分別測(cè)定2組RNA濃度。

1.3.4逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將純化后的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，正反向引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL，cDNA 2 μL，一共20 μL。

1.4hsa_circ_0004662的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核表達(dá)量分析

1.4.1 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核RNA分離及提取收集細(xì)胞，用試劑盒(PARISTMKit AM1921)將細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中的RNA分離并提取出來，隨后進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核RNA濃度的測(cè)定。

1.4.2逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR分別取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核RNA各500 ng，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，此過程所用試劑盒同1.3.4。隨后以該cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.3.4。

1.5hsa_circ_0004662翻譯蛋白的潛能分析通過分析circRNADb(http://reprod.njmu.edu.cn/circrnadb)[16]數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)來確定hsa_circ_0004662翻譯蛋白的潛能，并根據(jù)收錄數(shù)據(jù)繪制該環(huán)狀RNA翻譯蛋白的示意圖。

1.6miRNA結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分別利用circBank(www.circbank.cn)[17]和circInteractome(https://circinteractome.nia.nih.gov/)[18]2個(gè)在線數(shù)據(jù)庫來預(yù)測(cè)環(huán)狀RNA上miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，并取2個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果的交集作為環(huán)狀RNA可能靶向結(jié)合的miRNA。

1.7AGO2結(jié)合位點(diǎn)的鑒定AGO2結(jié)合位點(diǎn)的信息來自doiRNA(http://dorina.mdc-berlin.de)[19]數(shù)據(jù)庫中收錄的紫外交聯(lián)免疫共沉淀(cross-linking immunoprecipitation，CLIP)結(jié)果數(shù)據(jù)集。上述數(shù)據(jù)集包含多個(gè)細(xì)胞系的AGO2 PAR-CLIP 或HITS-CLIP 數(shù)據(jù)。通過下載可用數(shù)據(jù)集，然后與環(huán)狀RNA hsa_circ_0004662的序列進(jìn)行比對(duì)，可得到環(huán)狀RNA的AGO2結(jié)合位點(diǎn)。

1.8miRNA靶基因的預(yù)測(cè)選取miWalk[20]數(shù)據(jù)庫的12種算法中9種或10種算法預(yù)測(cè)得到的靶基因作為hsa-miR-224、hsa-miR-532的潛在靶基因。

1.9circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過選取miWalk數(shù)據(jù)庫中9種算法預(yù)測(cè)hsa-miR-224、hsa-miR-532的靶基因以及10種算法預(yù)測(cè)hsa-miR-224、hsa-miR-532的所有靶基因，根據(jù)競爭內(nèi)源性RNA(competing endogenous，ceRNA)理論，利用Cytoscape3.6.1[21]軟件構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)

絡(luò),并將其可視化。網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點(diǎn)代表不同的RNA分子，連線代表節(jié)點(diǎn)之間的相互作用。

1.10靶基因集合的功能及通路分析利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[22-23]數(shù)據(jù)庫中“Functional AnnotationChart”功能模塊分別對(duì)預(yù)測(cè)的miRNA靶基因集進(jìn)行GO生物過程和分子功能分析，并利用KEGG分析功能進(jìn)行信號(hào)通路分析。

2 結(jié) 果

2.1hsa_circ_0004662反向剪接位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增及一代測(cè)序鑒定通過PCR擴(kuò)增hsa_circ_0004662，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示成功擴(kuò)增出包含hsa_circ_0004662反向剪接位點(diǎn)的大小為202 bp的片段。序列分析表明，hsa_circ_0004662由來源于SOD2基因的轉(zhuǎn)錄本NM_001024465的第4號(hào)外顯子反向剪接至第2號(hào)外顯子形成，共包含3個(gè)外顯子(exon 2、exon 3、exon 4)。此外，測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)論，箭頭左端為SOD2基因4號(hào)外顯子末端序列，右側(cè)為2號(hào)外顯子的起始序列。見圖 1。

2.2hsa_circ_0004662的RNase R抵抗性及細(xì)胞內(nèi)表達(dá)定位分析RNase R組的環(huán)狀RNA hsa_circ_0004662、CDR1as的表達(dá)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而GAPDH基因的線性mRNA表達(dá)則明顯降低(P<0.05)。表明hsa_circ_0004662、CDR1as耐受RNase R的消化。U1 snRNA在細(xì)胞核中表達(dá)更高，環(huán)狀RNA CDR1as、hsa_circ_0004662在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)量顯著高于細(xì)胞核，hsa_circ_0004662在細(xì)胞質(zhì)中RNA的含量約為細(xì)胞核中的6倍。見圖2。

a: PCR擴(kuò)增鑒定；b:測(cè)序峰圖

與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.3hsa_circ_0001426翻譯蛋白的潛能分析Hsa_circ_0004662含有兩段符合內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)特征的原件，其起始-終止位點(diǎn)分別為271-419、310-460，R評(píng)分分別為1.642546、1.600476,均含有假結(jié)結(jié)構(gòu)。且hsa_circ_0004662存在一個(gè)開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)，編碼一條149個(gè)氨基酸的多肽，起始密碼子始于第456位核苷酸，終止密碼子位于繞環(huán)一周后的第443位核苷酸(1r+443)，見圖 3。

圖 3 hsa_circ_0004662的蛋白翻譯示意圖

2.4hsa_circ_0004662與miRNA的潛在相互作用以及潛在AGO2結(jié)合位點(diǎn)的鑒定CircInteractome 數(shù)據(jù)庫顯示環(huán)狀RNA hsa_circ_0004662上miRNA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量為15個(gè)包含14種miRNA。circBank數(shù)據(jù)庫顯示環(huán)狀RNA hsa_circ_0004662上miRNA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量為69個(gè)，包含31種miRNA。將hsa-miR-224、hsa-miR-532作為hsa_circ_0004662潛在靶向結(jié)合的miRNA，從 doRiNA數(shù)據(jù)庫中下載AGO2 PAR-CLIP或HITS-CLIP的數(shù)據(jù)分析顯示，hsa_circ_0004662中含有10個(gè)AGO2結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，hsa_circ_0004662可能通過作為hsa-miR-224或hsa-miR-532的ceRNA海綿來發(fā)揮功能。見圖4。

a-c:分別為1-3外顯子

2.5預(yù)測(cè)circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的可視化結(jié)果通過miWalk數(shù)據(jù)庫中10種算法對(duì)hsa-miR-224和hsa-miR-532靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，hsa-miR-224靶基因有17個(gè)，包括KAT6A、PHOX2B、SOD1、KIAA1239、NUP133、CABC3、RNF38、MAP1B、RBFOX1、LCOR、DPYSL2、PJA2、PIP4K2B、TMEM110、KIAA0319L、HOXA5、PDGFRA；hsa-miR-532靶基因有9個(gè)，包括ZIC4、RND2、AFF2、KIAA2022、KCNE3、HMGA2、PEG10、CTNNA2、DTX4。通過miWalk數(shù)據(jù)庫中9種算法對(duì)hsa-miR-224和hsa-miR-532的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并各選取其中15個(gè)，hsa-miR-224的靶基因?yàn)椋篜AX9、CDK9、BRCA1、CACNB2、LRP6、HTR1D、CAMK2D、HSBP1、KPNA4、DTNA、GLS、ACSL4、TRIM37、GSK3B、H3F3B；hsa-miR-532的靶基因?yàn)椋篈LCAM、CALM3、GNG7、GUCY1A3、DYNC1L12、DRP2、COL1A1、CHRNB2、CELSR3、ATP1A2、ASTN1、CIRBP、ACHE、DES、DDB1。利用Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建了以hsa_circ_0004662、hsa-miR-224和hsa-miR-532以及56個(gè)mRNAs為核心的circRNA-miRNA-mRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，可顯示它們之間的相互作用。見圖5。

2.6靶基因合集的GO富集及KEGG通路分析GO分析結(jié)果顯示，hsa-miR-224和has-miR-532的靶基因分別在12個(gè)生物學(xué)過程條目和13個(gè)分子功能條目中顯著富集。其中最顯著富集的GO生物過程條目包括神經(jīng)沖動(dòng)傳遞、行為、蛋白氨基酸磷酸化，最顯著的分子功能條目包括蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。KEGG通路分析結(jié)果顯示，該靶基因合集在Wnt信號(hào)通路和泛素介導(dǎo)的蛋白降解信號(hào)通路顯著富集(P<0.05)，見圖6。

圖 5 hsa_circ_0004662的ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖

a：生物過程GO富集分析；b:分子功能GO富集分析；c: KEGG通路分析

3 討 論

根據(jù)目前circBase數(shù)據(jù)庫的收錄信息，SOD2基因可經(jīng)反向剪接產(chǎn)生4個(gè)環(huán)狀RNA，分別為hsa_circ_0005472、hsa_circ_0004662、hsa_circ_0078541、lme_circ_0000314，其中hsa_circ_0004662樣本分布最廣泛，被高通量測(cè)序檢測(cè)到的相關(guān)研究最多[24-26]，提示該環(huán)狀RNA功能相對(duì)重要，因此本研究重點(diǎn)關(guān)注到了hsa_circ_0004662。通過PCR擴(kuò)增、一代測(cè)序?qū)sa_circ_0004662反向剪接位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，并結(jié)合RNase R處理實(shí)驗(yàn)，證實(shí)hsa_circ_0004662正確成環(huán)。將hsa_circ_0004662的序列與基因組序列進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其由SOD2基因轉(zhuǎn)錄本NM_001024465的3個(gè)外顯子(exon2、exon3、exon4)經(jīng)反向剪接而成，剪接點(diǎn)前后的序列都分別是AG和GT，符合環(huán)狀RNA產(chǎn)生的剪接規(guī)律[27]。

SOD2基因編碼的蛋白MnSOD在真核生物中多為四聚體，整體形狀呈倒“L”形，共包含有7個(gè)α螺旋和3個(gè)β折疊。MnSOD在多個(gè)物種中的一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性很高，其形成活性中心、催化中心以及與金屬連接的氨基酸都是保守的，包括5個(gè)形成活性中心的特征性氨基酸(Gly76、Gly77、Phe84、Gln154和Asp155)以及其他17個(gè)與活性位點(diǎn)或次級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)的保守氨基酸[28]。本研究利用circRNADb數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，來源于SOD2 基因的環(huán)狀RNA hsa_circ_0004662具有翻譯蛋白的潛能；將hsa_circ_0004662的潛在蛋白序列比對(duì)到MnSOD蛋白，分析顯示該潛在蛋白保留了MnSOD蛋白質(zhì)中的6個(gè)α螺旋和3個(gè)β折疊(僅缺少第一個(gè)α螺旋)，5個(gè)形成活性中心的特征性氨基酸亦都保留了下來，表明hsa _circ_0004662 翻譯的蛋白可能具有MnSOD的酶活功能。但對(duì)于hsa_circ_0004662 的蛋白翻譯能力及其酶活功能還需要進(jìn)一步深入研究。

環(huán)狀RNA的功能與其在細(xì)胞內(nèi)亞定位有關(guān)，位于細(xì)胞質(zhì)中的環(huán)狀RNA可以與miRNA相結(jié)合，通過行使miRNA海綿作用來發(fā)揮功能[29-31]。本研究hsa_circ_0004662主要分布于細(xì)胞質(zhì)。本研究hsa_circ_0004662具有多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可能通過行使hsa-miR-224或hsa-miR-532的分子海綿作用競爭結(jié)合hsa-miR-224或hsa-miR-532進(jìn)而影響其下游靶基因的表達(dá)，為hsa_circ_0004662作為ceRNA發(fā)揮功能提供了證據(jù)。

研究表明，SOD2基因編碼的MnSOD在炎癥過程中具有重要作用，可預(yù)測(cè)潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)患者活動(dòng)性和病情的嚴(yán)重程度[32]。對(duì)于SOD2基因來源的環(huán)狀RNA hsa_circ_0004662，研究發(fā)現(xiàn)其在UC組織以及給予炎癥因子刺激后的腸上皮細(xì)胞中都明顯上調(diào)[33-34]；張育軍等[34]發(fā)現(xiàn)該環(huán)狀RNA在UC中上調(diào)并可能通過減弱腸上皮屏障功能來介導(dǎo)UC的發(fā)生。另外，UC患者中miR-224表達(dá)水平的下調(diào)與其對(duì)糖皮質(zhì)激素耐受有關(guān)[35]。本研究中，功能注釋表明除了部分傳統(tǒng)的SOD2基因參與的通路之外，hsa-miR-224和hsa-miR-532的靶基因還參與神經(jīng)肌肉相關(guān)的生物學(xué)過程，例如神經(jīng)沖動(dòng)傳遞、突觸傳遞、膠質(zhì)細(xì)胞再生以及肌肉收縮的負(fù)調(diào)控等；通路分析表明，hsa-miR-224和hsa-miR-532的靶基因參與Wnt信號(hào)通路。已有研究報(bào)道表明Wnt/β-catenin 信號(hào)通路與UC有關(guān)[36-38]。對(duì)此，我們推測(cè)hsa_circ_0004662可能通過競爭結(jié)合hsa-miR-224進(jìn)而調(diào)控下游靶基因來介導(dǎo)UC的發(fā)生發(fā)展。此外，鑒于hsa_circ_0004662 潛在翻譯蛋白可能具有MnSOD的酶活功能，故hsa_circ_0004662對(duì)UC的調(diào)控作用亦有可能與其酶活性相關(guān)。當(dāng)然，這些結(jié)論的證實(shí)仍需進(jìn)一步的研究。

近年來，隨著國內(nèi)外學(xué)者對(duì)環(huán)狀RNA關(guān)注度的提高，越來越多的環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)功能也被逐漸認(rèn)識(shí)。然而，大量的環(huán)狀RNA的功能研究還是空白的。本研究分析了hsa_circ_0004662的特征，預(yù)測(cè)了其蛋白翻譯潛能，并利用生物信息學(xué)方法成功構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)暗示了hsa_circ_0004662可能通過ceRNA機(jī)制發(fā)揮作用；本研究為進(jìn)一步研究環(huán)狀RNA hsa_circ_0004662的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。