楊照輝,楊海成,張宏偉,張 龍,史康杰,溫鈺鵬,張永國(guó),褚志強(qiáng),陳 騫,楊 婧,趙梅鳳,劉詩(shī)文,張示杰

0 引 言

泡狀棘球蚴病又稱為泡型包蟲病，是由多房棘球絳蟲幼蟲寄生于人體引起的人畜共患寄生蟲疾病，呈世界性分布[1-3]。在我國(guó)的新疆、西藏、四川及青海等牧區(qū)均有流行，嚴(yán)重危害牧民生命健康安全，已成為全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[4-5]。該病隱匿起病，潛伏期長(zhǎng)，通常初次感染 10 年以上才出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，被發(fā)現(xiàn)時(shí)一般都處在疾病的中晚期，大多數(shù)患者已有廣泛的肝浸潤(rùn)及肺、腦轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。晚期患者主要長(zhǎng)期口服阿苯達(dá)唑但有明顯的不良反應(yīng)。盡管有新的藥物劑型問(wèn)世，但效果仍然不理想[6-9]。

骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是由 Senger 等[10]最先發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤上皮細(xì)胞分泌的一種帶負(fù)電荷，具有親水性的分泌型酸性磷蛋白。作為一種分泌蛋白，OPN在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌等，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)OPN信號(hào)傳導(dǎo)途徑被各種刺激激活時(shí)與多種病理變化有關(guān)并發(fā)揮重要作用，其中包括參與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和遷徙[11-13]。OCT4-SOX2復(fù)合體調(diào)控下游的OPN靶基因時(shí)二聚體形式的OCT4可以激活OPN基因的轉(zhuǎn)錄，而SOX2可能通過(guò)干擾二聚體形成抑制OPN的表達(dá)[14]。Cook等[15-17]報(bào)道缺乏OPN并不會(huì)影響某些原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)，但卻顯著降低了腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能，而且OPN水平的升高會(huì)唆使惰性腫瘤的轉(zhuǎn)移[18]。目前OPN已被用于某些腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物，也可作為抗癌治療的預(yù)后指標(biāo)[19]。以上結(jié)果都支持OPN是一個(gè)函待研究并且有吸引力的治療腫瘤轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)的觀點(diǎn)。

目前為止，對(duì)于泡球蚴OPN基因全長(zhǎng)序列的研究幾乎未見(jiàn)， Cheng等[20]研究報(bào)道對(duì)多房棘球蚴同源基因EmOCT4進(jìn)行了克隆得到了其全長(zhǎng)序列，確定了對(duì)其生發(fā)層干細(xì)胞的維持和調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)OPN在肝多房棘球蚴纖維囊壁的生發(fā)層和炎細(xì)胞中高表達(dá)并且當(dāng)外源性給予抗 OPN 抗體時(shí)可抑制多房棘球蚴侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[21-22]。本研究對(duì)多房棘球球蚴OPN同源基因片段鑒定并采用DNA快速擴(kuò)增技術(shù)克隆其全長(zhǎng)基因序列，以期在核酸水平發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)，為臨床上泡狀棘球蚴病晚期患者的治療、手術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)提供一個(gè)新思路、為多房棘球蚴生發(fā)層干細(xì)胞多能性的內(nèi)源因子及其作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠20只，雌雄各10 只，鼠齡6～8周，體重(40 ±5)g，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)疾控中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(新)2017-0021。飼養(yǎng)于透明塑料籠中，溫度(25±2) ℃，相對(duì)濕度 (35±5) %，每 12 小時(shí)明暗交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。實(shí)驗(yàn)由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2015-018-01)。

1.1.2主要試劑及酶無(wú)水乙醇、異丙醇、氯仿均購(gòu)自天津福宇精細(xì)化工有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)購(gòu)自大連寶生生物公司；PBS、瓊脂糖、柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自購(gòu)自上海生工生物工程；TRIzolTMReagent購(gòu)自Ambion公司，5X All-In-One RT MasterMix購(gòu)自ABM公司；2×EasyTaq PCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RevertAid Premium Reverse Transcriptase、RNase H、Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)購(gòu)自Thermo ；LA Taq、pMD18-T 載體連接試劑盒購(gòu)自 TaKaRa公司。

1.1.3主要儀器高速冷凍離心機(jī)(Heraeus Multifuge X1R)為賽默飛世爾科技公司；微量分光光度計(jì)(Nano-100)為杭州奧盛儀器有限公司；常規(guī)電泳儀電源(BG-Power600i)為北京百晶生物技術(shù)有限公司；電泳槽(DYCZ-21)為北京市六一生物有限科技公司；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 2500)為上海天能科技有限公司；PCR儀(MyCycler Thermal Cycler)為美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1 多房棘球蚴原頭節(jié)的提取取感染多房棘球蚴長(zhǎng)爪沙鼠1只，吸入乙醚麻醉3 min后，將沙鼠仰臥位固定于解剖臺(tái)，腹部備皮，全腹碘伏消毒3遍，作正中切口，完全暴露腹腔內(nèi)感染病灶，用無(wú)菌小剪分離感染灶，將分離下感染組織反復(fù)用PBS沖洗沖洗去除血漬。用無(wú)菌剪刀將病灶修剪小塊，放入玻璃研磨器研磨后倒入100目大小篩網(wǎng)上，取沉淀用PBS沖洗至上清液清亮為止，制成泡球蚴原頭節(jié)混懸液。抽取1 μL混懸液錐蟲藍(lán)染色后放置10倍鏡下原頭節(jié)計(jì)數(shù)，將濃度調(diào)整約為10 000個(gè)原頭節(jié)/mL。

1.2.2總RNA的提取和cDNA鏈的合成在無(wú)菌工作臺(tái)取含有原頭節(jié)約3000～5000個(gè)。用TRLZOL試劑裂解原頭節(jié)，提取泡球蚴總RNA，加入RNase-free水于-80 ℃保存?zhèn)溆?，取少量總RNA用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并測(cè)定A260/A280比值及濃度。采用5X All-In-One RT MasterMix試劑盒合成cDNA第一鏈，(詳細(xì)方法參照說(shuō)明書)按Total RNA 1 μg，5X All-In-One RT MasterMix 4 μL，加入RNase-free水至20 μL，振蕩器混勻后離心。PCR反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s取出，結(jié)束反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)；將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA置于-20 ℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3泡球蚴OPN基因同源性片段的獲得與引物設(shè)計(jì)因OPN基因高度保守[23]，從NCBI基因庫(kù)中找到人的OPN基因序列，然后與泡球蚴全基因組進(jìn)行blast對(duì)比，發(fā)現(xiàn)可能的OPN基因同源性片段EMmg-13d08.q1k。設(shè)計(jì)引物序列，如下：OPN-F:5'-CAG TCT GAT GAG ATG TAT AGC AAA G -3'; OPN-R: 5'- ACA TTC AAG AGA CAA GAT TTA TTC AC -3'(引物由歐易生物有限公司合成)。

1.2.4PCR擴(kuò)增目的基因與鑒定采用2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：cDNA 1μL，F(xiàn)orward Primer(10 μmol/L) 0.5 μL，Reverse Primer(10 μmol/L) 0.5 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，按94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s的順序35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最后回收目的基因條帶，送歐易生物有限公司測(cè)序。測(cè)序序列上傳NCBI BLAST與人、EMmg-13d08.q1k進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.5獲得泡球蚴OPN基因的3′末端片段、5′末端片段根據(jù)泡球蚴OPN基因片段序列采用DNAman 8設(shè)計(jì)引物,3′RACE-F ATGGCTACTGCATTTTCATGGTTGTT, 5′RACE-R GATGAGCTGTCTACTGTCTAATTCATGAGAAACACGGA,引物由歐易生物有限公司合成，利用引物合成3′RACE cDNA第一鏈，以3′RACE cDNA為模板進(jìn)行巢氏PCR反應(yīng)，第一輪條件：95 ℃預(yù)變性3 min，按94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s，72 ℃延伸7 min，33個(gè)循環(huán)；以第一輪PCR產(chǎn)物稀釋后為模板進(jìn)行巢氏PCR第二輪反應(yīng)，第二輪條件：95 ℃預(yù)變性3 min，按94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s，72 ℃延伸7 min，33個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察特異性條帶并測(cè)序，同理合成5′RACE cDNA第一鏈，得到5′RACE cDNA純化及TdT處理后進(jìn)行巢氏PCR反應(yīng)，第一輪條件：95 ℃預(yù)變性3 min，按94 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s，72 ℃延伸7 min，33個(gè)循環(huán)；以第一輪PCR產(chǎn)物稀釋后為模板進(jìn)行巢氏PCR第2輪反應(yīng)，第2輪條件：95 ℃預(yù)變性3 min，按94 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s，72 ℃延伸7 min，33個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳將條帶回收與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后測(cè)序。

1.2.6序列拼接生物學(xué)分析用CExpress軟件對(duì)泡球蚴OPN基因保守序列、3′-RACE測(cè)序序列、5'-RACE測(cè)序序列進(jìn)行校正拼接，最終得到泡球蚴OPN基因全長(zhǎng)序列。用工具 DNAstar推測(cè)出OPN開放閱讀框所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。利用Protean、Phyre2及SOPMA進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及抗原位表位分析。

2 結(jié) 果

2.1泡球蚴總RNA的提取與檢測(cè)提取泡球蚴總RNA后在紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260/A280比值為1.99，表明提取純度高。經(jīng)1.8%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，總RNA比較完整。見(jiàn)圖1。

圖 1 泡球蚴總RNA提取

2.2泡球蚴OPN基因同源性片段的擴(kuò)增以cDNA為模板PCR擴(kuò)增泡球蚴OPN基因同源片段，獲得目的基因片段，見(jiàn)圖2。測(cè)序序列上傳至NCBI BLAST與EMmg-13d08.q1k比對(duì)同源性為97%。

M:Marker; 1: 目的條帶

2.3泡球蚴OPN基因3′RACE、5′RACE擴(kuò)增結(jié)果3′RACE 巢氏PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物切膠回收測(cè)序得到一長(zhǎng)度為113 bp帶有PolyA尾的堿基序列。5′RACE 巢氏PCR擴(kuò)增后將產(chǎn)物回收與pMDl8-T 載體連接，進(jìn)行菌落PCR后正反雙向測(cè)序分別得到長(zhǎng)度為582 bp、578 bp的序列，經(jīng)工具拼接長(zhǎng)度為955 bp大小堿基序列。見(jiàn)圖3。

M:Marker; 1: 3′RACE擴(kuò)增條帶 ;2:5′RACE擴(kuò)增條帶

2.4獲得泡球蚴OPN全長(zhǎng)序列及生物學(xué)分析將已獲得的955 bp的5′RACE序列、617 bp的中間序列和113 bp的3′RACE序列導(dǎo)入CExpress進(jìn)行拼接，獲得長(zhǎng)度為1390 bp的全長(zhǎng)序列。相對(duì)分子質(zhì)量為50 363.75，理論等電點(diǎn)(pl)為11.18，其中含有411個(gè)腺嘌呤、297個(gè)胞嘧啶、334個(gè)鳥嘌呤、348個(gè)胸腺嘧啶。運(yùn)用DNAstar查找泡球蚴OPN全長(zhǎng)序列ORF，發(fā)現(xiàn)含有一個(gè)長(zhǎng)度為849 bp，編碼282個(gè)氨基酸的完整的ORF閱讀框，始于96 bp,止于944 bp。通過(guò)SOPMA、DNAstar預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu),顯示α-螺旋(h)占20.81%，β-折疊(e)占15.26%，β-轉(zhuǎn)角(t)占10.08%，無(wú)規(guī)則卷曲(c)占53.85% ，見(jiàn)圖4。jameson-wolf方法對(duì)EmOPN蛋白表面抗原預(yù)測(cè)，可能存在的蛋白質(zhì)抗原表位區(qū)域，見(jiàn)圖5。通過(guò)Phyre2預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖6。

圖 4 3′RACE和5′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物EmOPN蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖 5 EmOPN 蛋白抗原表位預(yù)測(cè)

圖 6 EmOPN蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討 論

Frohman等[24]提出以PCR為基礎(chǔ)獲得目的cDNA完整序列的技術(shù)。此方法主要有簡(jiǎn)單、快捷、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于人類、寄生蟲、真菌的未知基因克隆[25]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的發(fā)展基因測(cè)序?qū)⑹墙窈蠖喙δ苎芯康闹髁鞣较?，本研究?yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)獲得3′末端及5′末端目的基因，通過(guò)拼接獲得泡球蚴OPN全長(zhǎng)基因序列。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，許多組織和機(jī)構(gòu)設(shè)計(jì)了信息軟件供生物學(xué)家們易于對(duì)蛋白質(zhì)分析，抗原表位的預(yù)測(cè)可以通過(guò)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性原則、可及性方案、抗原性方案、可塑性方案、電荷分布方案等綜合分析。通過(guò)預(yù)測(cè)EmOPN二、三級(jí)結(jié)構(gòu)為表面抗原的存在提供有力依據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)親水性部位與抗原表位主要在227-234,447-453氨基酸殘區(qū)域并非完全一致性，這說(shuō)明在親水性部位與抗原表位有密切關(guān)系的同時(shí)，疏水性部位也可出現(xiàn)在抗原表位，這與親水性原則中TP Hopp等[26]的發(fā)現(xiàn)呼應(yīng)，雖然本研究預(yù)測(cè)了EmOPN蛋白的抗原表位，但是生物學(xué)效應(yīng)還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

骨橋蛋白參與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的大多數(shù)方面，已報(bào)道了多種類型的癌癥中發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)OPN基因。Lamour[27]等研究發(fā)現(xiàn)OPN可以激活EGFR / Akt / mTOR信號(hào)通路維持膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞中的干細(xì)胞樣表型，當(dāng)下調(diào)OPN基因表達(dá)時(shí)可以使其成球能力和致瘤能力下降，同時(shí)也可以抑制Sox2、Oct3 / 4和Nanog等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。在多房棘球絳蟲的生命周期中，總是保留一群“干細(xì)胞”樣細(xì)胞，即生發(fā)層干細(xì)胞，它們被認(rèn)為是其在宿主中生長(zhǎng)和發(fā)育的基本基礎(chǔ)之一[28]，同時(shí)有研究顯示激活EGFR/ERK信號(hào)通路傳導(dǎo)有助于生發(fā)層干細(xì)胞增殖[29]。結(jié)合前面的研究成果我們推斷當(dāng)EmOPN基因表達(dá)下降時(shí)，將減弱生發(fā)層干細(xì)胞的成球及增殖能力，從而抑制泡球蚴的侵襲生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴球蚴感染的宿主體內(nèi)可見(jiàn)OPN高表達(dá)，主要分布在纖維囊壁的生發(fā)層中[30]，但是由于寄生蟲-宿主之間關(guān)系的原因很難明確高表達(dá)OPN來(lái)自哪一物種，并且由于OPN基因的高度保守性，非特異性的抗OPN抗體對(duì)抑制肝泡狀棘球蚴的轉(zhuǎn)移和侵襲并不能達(dá)到很好的理想效果。本研究成功獲得泡球蚴OPN cDNA序列為合理設(shè)計(jì)重組抗原分子定制特異性靶向藥物提供幫助，這有可能為晚期包蟲患者抗泡球蚴轉(zhuǎn)移藥物治療提供新途徑。目前研究?jī)H僅是在泡球蚴OPN基因水平上初步探索研究，接下來(lái)可進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法、原位雜交技術(shù)等方法補(bǔ)充對(duì)EmOPN基因及蛋白深入研究。