林建城, 周文虎, 林娟娟
(莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點實驗室, 福建 莆田 351100)
幾丁質(zhì)酶可降解幾丁質(zhì)中N-乙酰葡萄糖胺C1和C4間的糖苷鍵,是屬于糖基水解酶類。Broadway等[1]根據(jù)幾丁質(zhì)酶作用機理不同,認為其至少包含有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)等3種不同組分,其中NAGase主要是通過對幾丁質(zhì)外切生成β-N-乙酰葡萄糖胺單體和寡聚糖,并將外切幾丁質(zhì)酶酶解幾丁質(zhì)產(chǎn)生的幾丁二糖繼續(xù)降解為單體。幾丁質(zhì)酶在動植物、微生物體內(nèi)普遍存在,在不同生物體中也發(fā)揮著不同的生理作用[2];其中節(jié)肢動物幾丁質(zhì)酶除了起到對含幾丁質(zhì)的食物進行酶解消化外,還與節(jié)肢動物周期性蛻皮蛻殼的生理現(xiàn)象密切相關(guān)[3]。為了闡明幾丁質(zhì)酶在昆蟲、蝦蟹、鱟等這些節(jié)肢動物周期性蛻皮過程的生理作用,幾丁質(zhì)酶的組成結(jié)構(gòu)及其催化機理成為了研究熱點[4]。
目前,對幾丁質(zhì)酶功能基團的研究方法主要有蛋白質(zhì)化學(xué)修飾法和定點突變技術(shù)。Fan等[5]用酶的定點突變技術(shù)研究了舞毒蛾(Lymantriadispar)幾丁質(zhì)酶的功能基團,發(fā)現(xiàn)Asp143、Asp145和Trp146三個具有高度保守性的氨基酸殘基與酶催化活性密切相關(guān);Lu等[6]也用該技術(shù)研究表明:煙草天蛾(Manducasexta)幾丁質(zhì)酶Trp142、Asp144和Glu146是酶活性部位的必需基團,Glu146在幾丁質(zhì)降解中主要起酸堿催化作用。Jin等[7]則采用蛋白質(zhì)化學(xué)修飾法研究了鋸緣青蟹(Scyllaserrata)NAGase的功能基團,證明了色氨酸是酶活性的必需基團,而酶中二硫鍵和精氨酸的胍基不是酶活性所必需的;Xie等[8]也對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)NAGase進行化學(xué)修飾,結(jié)果證明色氨酸是對蝦NAGase的必需基團,酶反應(yīng)動力學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)對蝦NAGase酶分子催化活性只需一個色氨酸殘基參與。課題組已從中國鱟(Tachypleustridentatus)分離純化到NAGase[9],在研究其酶學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上,本研究進一步通過化學(xué)修飾法探討了中國鱟NAGase的功能基團,為揭示中國鱟在生活周期中蛻皮與幾丁質(zhì)酶活性之間的相關(guān)性奠定理論基礎(chǔ)。
參照文獻[9]所述方法分離純化中國鱟NAGase,分別通過抽提、30%和80%的飽和硫酸銨分級分離、Sephadex G-200凝膠層析以及DEAE-32離子交換層析分離,純化后獲得聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)單一純的酶制劑,比活力為505.21 U/mg,酶制劑在4 ℃下經(jīng)過雙蒸餾水透析后,用于酶化學(xué)修飾的研究。
NAGase催化的底物對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-β-D-GlcNAc),由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生化室合成;Sephadex G-200出自Pharmacia;纖維素DEAE-32是Whatman產(chǎn)品;對氯汞苯甲酸(p-chloromercuribenzoate,pCMB)是Sigma產(chǎn)品;苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)為Merk公司產(chǎn)品;甲醛、乙酸酐、三硝基苯磺酸(Trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)、二巰基蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)、乙酰丙酮(Acetylacetone,AA)、溴代乙酸(Bromoacetic acid,BrAc)、碘代乙酸(Iodoacetic acid,IAc)、N-溴代琥珀酰亞胺(N-bromosuccinimide,NBS),以及其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2.1 中國鱟內(nèi)臟NAGase活力測定 中國鱟內(nèi)臟NAGase活力的測定方法參考文獻[9]。在2 mL的酶測活體系中,包含1 mL 75 mmol/L HAC-NaAC緩沖液(pH=5.4),0.2 mL 5 mmol/L的底物pNP-β-D-GlcNAc,0.78 mL的雙蒸餾水,20 μL酶液。在37 ℃下反應(yīng)10 min,以2 mL 0.5 mol/L NaOH終止反應(yīng),測定A405 nm,以未加入酶制劑的為空白對照組。
1.2.2 中國鱟內(nèi)臟NAGase功能基團的化學(xué)修飾 選擇TNBS等10種化學(xué)修飾劑,分別在不同修飾體系中對中國鱟NAGase進行化學(xué)修飾。TNBS、乙酸酐和DTT等3種修飾劑對酶的修飾在0.01 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)緩沖體系37 ℃下進行,PMSF對酶的修飾采用同樣的緩沖體系,但是在25 ℃下進行;甲醛和NBS均在37 ℃下0.20 mol/L NaAc-HAc(pH=5.4)的緩沖體系中對酶進行修飾;乙酰丙酮則是在37 ℃下,0.01 mol/L Tris-HCl(pH=9.0)的緩沖體系中對酶進行修飾;在0.10 mol/L NaAc-HAc(pH=6.0)緩沖體系中,溴代乙酸在25 ℃下,碘代乙酸在37 ℃下分別對酶進行修飾;而pCMB是在0.05 mol/L NaAc-HAc(pH=5.8)緩沖體系中,37 ℃下對酶進行修飾。
修飾酶活力的測定:在NAGase酶液中按一定比例(V酶∶ V修飾劑=1∶3)分別加入不同的修飾劑,于各自的修飾體系中修飾30 min,然后取出50 μL的修飾酶,在NAGase測活體系中測定酶的剩余活力,設(shè)立了對照組,在化學(xué)修飾試驗中,為了排除修飾劑本身對試驗的干擾,在對照組設(shè)置中,則是在加入2 mL 0.5 mol/L NaOH后再加入50 μL修飾酶制劑。以測得的未修飾酶活力為100%,而修飾酶活力以相對酶活力(%)表示。
1.2.3 NBS對NAGase紫外吸收光譜和內(nèi)源熒光發(fā)射光譜的影響 NAGase經(jīng)0、2、 3、5、10 μmol/L濃度NBS化學(xué)修飾后,分別用日本島津UV-2550型紫外分光光度計掃描,測定NAGase經(jīng)修飾后的紫外吸收峰。此外,NAGase經(jīng)0、2、5、10、15、20 μmol/L濃度NBS化學(xué)修飾后,分別用美國Cary Eclipse熒光分光光度計掃描,在酶內(nèi)源熒光激發(fā)光譜波長為230.9 nm下,測定NAGase經(jīng)修飾后的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜峰。
中國鱟內(nèi)臟NAGase通過抽提、硫酸銨沉淀分級分離、凝膠層析以及離子交換層析后,獲得NAGase酶制劑,透析后經(jīng)PAGE和SDS-PAGE檢定,電泳圖譜均顯示一譜帶(見圖1),說明經(jīng)分離純化后NAGase已達到電泳純,用此純酶制劑進行酶的化學(xué)修飾試驗。
圖1 中國鱟NAGase的PAGE(a)及SDS-PAGE(b)圖譜
采用甲醛和乙酸酐兩種氨基修飾劑[10],分別對中國鱟NAGase進行化學(xué)修飾,發(fā)現(xiàn)NAGase經(jīng)8 mmol/L甲醛修飾后,酶活力僅剩4.1%(見圖2);而乙酸酐在0~200 mmol/L濃度范圍內(nèi),對NAGase化學(xué)修飾的結(jié)果表明:隨乙酸酐修飾劑濃度的增加,NAGase活力逐漸下降,呈濃度效應(yīng),當乙酸酐修飾劑濃度達到200 mmol/L時,NAGase活力喪失了97.8%(見圖3)。有許多化合物可以修飾酶蛋白中賴氨酸ε-氨基,TNBS也是其中非常有效的一種[11]。研究發(fā)現(xiàn),隨著化學(xué)修飾劑TNBS濃度的增大,NAGase活力逐漸下降,20 mmol/L TNBS可使中國鱟NAGase活力喪失94.7%(見圖4)。這些結(jié)果表明了:NAGase的賴氨酸ε-氨基被化學(xué)修飾后,酶的活性變化大,賴氨酸ε-氨基是中國鱟NAGase活性的必需基團。
圖2 甲醛對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.2 Modification of NAGase from T. tridentatus by formaldehyde
圖3 乙酸酐對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.3 Modification of NAGase from T. tridentatus by Acetic anhydride
圖4 TNBS對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.4 Modification of NAGase from T. tridentatus by TNBS
PMSF是蛋白質(zhì)中絲氨酸羥基的專一化學(xué)修飾劑[11]。在偏堿性條件下,采用PMSF對中國鱟NAGase酶蛋白中絲氨酸羥基進行專一的化學(xué)修飾。結(jié)果見圖5,隨著修飾劑PMSF濃度的升高,修飾后酶的活力逐漸降低,當修飾劑PMSF濃度達到200 mmol/L時,NAGase活力幾乎喪失,結(jié)果表明:中國鱟NAGase酶蛋白中絲氨酸的羥基對酶活力是必需的,是酶的必需基團。
圖5 PMSF對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.5 Modification of NAGase from T. tridentatus by PMSF
巰基基團是蛋白質(zhì)分子中極易發(fā)生反應(yīng)的側(cè)鏈基團,其中有機汞試劑是最早使用的巰基修飾試劑,其中pCMB能專一修飾酶蛋白中半胱氨酸巰基[12]。選用有機汞試劑pCMB對中國鱟NAGase進行化學(xué)修飾,結(jié)果(見圖6)表明,NAGase經(jīng)pCMB化學(xué)修飾后,酶活力發(fā)生較大變化,當修飾劑pCMB濃度達到0.5 mmol/L時,NAGase活力已喪失83.4%,NAGase活力下降應(yīng)該是由于半胱氨酸巰基被修飾后酶蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生變化所致,說明半胱氨酸巰基是中國鱟NAGase活性的必需基團。
圖6 pCMB對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.6 Modification of NAGase from T. tridentatus by pCMB
在偏堿性條件下,常用DTT將蛋白質(zhì)中的二硫鍵還原成游離巰基,對其進行特異性的化學(xué)修飾[12]。DTT對中國鱟NAGase酶蛋白的化學(xué)修飾結(jié)果如圖7所示,可見隨著修飾劑DTT濃度的提高,NAGase活力呈不斷下降趨勢,當DTT濃度達120 mmol/L時,酶活力則喪失了81.3%。DTT還原了NAGase酶蛋白中的二硫鍵,而二硫鍵的還原導(dǎo)致酶蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變,從而使酶催化活力發(fā)生改變。說明中國鱟NAGase酶蛋白中的二硫鍵與酶活力密切相關(guān),其二硫鍵在維系酶蛋白的三維空間構(gòu)象中起重要作用。
精氨酸殘基含有一個呈堿性的胍基,酶活性部位的胍基能結(jié)合帶有陰離子的底物,乙酰丙酮則能專一地修飾酶蛋白精氨酸殘基中胍基[13],在偏堿性條件下,乙酰丙酮與胍基相互作用后改變了精氨酸側(cè)鏈基團的結(jié)構(gòu),從而影響酶蛋白的性質(zhì),導(dǎo)致與底物的親和力發(fā)生變化。在本試驗中,發(fā)現(xiàn)乙酰丙酮在0~140 mmol/L濃度范圍內(nèi),中國鱟NAGase經(jīng)乙酰丙酮修飾后酶活力基本沒有變化,說明精氨酸胍基與NAGase活性無關(guān),精氨酸胍基不是中國鱟NAGase活性的必需基團。
圖7 DTT對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.7 Modification of NAGase from T. tridentatus by DTT
組氨酸咪唑基是許多酶活性部位的組成部分,在偏酸性的條件下,BrAc對酶蛋白中組氨酸殘基進行取代反應(yīng),生成羧甲基衍生物,可以特異性修飾蛋白質(zhì)中的組氨酸咪唑基[11]。BrAc對中國鱟NAGase的化學(xué)修飾結(jié)果(見圖8)表明,當BrAc濃度達到150 mmol/L時,NAGase活力只剩5.4%,幾乎喪失酶活力。進一步采用IAc作為中國鱟NAGase組氨酸咪唑基的化學(xué)修飾劑[10],結(jié)果如圖9所示,120 mmol/L IAc可使酶活力喪失93.5%。說明組氨酸咪唑基與中國鱟NAGase活力密切相關(guān),組氨酸咪唑基是中國鱟NAGase活性所必需的。
NBS是蛋白質(zhì)中色氨酸的特異性修飾試劑,可使吲哚基團氧化成羥吲哚衍生物,導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生變化[7]。NBS化學(xué)修飾中國鱟NAGase的結(jié)果(見圖10)表明:經(jīng)低濃度的NBS修飾后NAGase活力則迅速下降,25 μmol/L NBS修飾酶后,NAGase活力幾近喪失,說明中國鱟NAGase色氨酸吲哚基被氧化后酶催化活力發(fā)生較大變化。
圖8 BrAc對中國鱟NAGase活力的影響Fig.8 Modification of NAGase from T. tridentatus by BrAc
圖9 IAc 對中國鱟NAGase活力的影響Fig.9 Modification of NAGase from T. tridentatus by IAc
此外,中國鱟NAGase經(jīng)NBS修飾后,酶蛋白的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜強度也發(fā)生相應(yīng)變化。在0~5 μmol/L濃度范圍內(nèi),隨著修飾劑NBS濃度的增大,NAGase酶蛋白在273 nm波長處的紫外吸收峰值逐漸降低,10 μmol/L NBS下紫外吸收峰消失(見圖11)。而NAGase酶蛋白內(nèi)源熒光發(fā)射光譜峰在330.9 nm波長處,但NBS修飾后NAGase酶蛋白的熒光強度發(fā)生變化(見圖12),隨修飾劑NBS濃度增大,酶蛋白熒光強度呈不斷下降趨勢,熒光發(fā)射光譜峰出現(xiàn)向短波長移動(“藍移”)現(xiàn)象,20 μmol/L NBS使NAGase酶蛋白的熒光發(fā)射幾近焠滅,說明NBS對NAGase的生色基團——色氨酸的苯環(huán)修飾后,酶蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生較大變化,導(dǎo)致酶活力喪失;由于苯環(huán)共軛體系破壞,加上Trp殘基經(jīng)NBS修飾后其疏水性可能有所增強,導(dǎo)致熒光發(fā)射光譜峰發(fā)生“藍移”現(xiàn)象,隨著NBS濃度增大,“藍移”越多[14-15]。上述結(jié)果表明:色氨酸是中國鱟NAGase活性的必需基團。
圖10 NBS對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.10 Modification of NAGase from T. tridentatus by NBS
(曲線1~5:NBS濃度分別為 0、2、3、5、10 μmol·L-1。The final concentrations of NBS were 0, 2, 3, 5 and 10 μmol·L-1for curves 1~5, respectively.)
圖11 中國鱟NAGase在NBS中的紫外吸收光譜
Fig.11 UV absorption spectra of NAGase from
T.tridentatusmodified by NBS
(曲線1~6, NBS濃度分別為 0、2、5、10、15、20 μmol·L-1。The final concentrations of NBS were 0,2,5,10,15 and 20 μmol·L-1for curves 1~6, respectively.)
圖12 中國鱟NAGase在NBS中的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜
Fig.12 Fluorescence emission spectra of NAGase from
T.tridentatusmodified by NBS
蛋白質(zhì)化學(xué)修飾法已廣泛應(yīng)用在酶蛋白活性基團的研究中。石艷等[12]采用化學(xué)修飾法研究了菜青蟲(Pierisbrassicae)表皮NAGase活性的必需基團,結(jié)果表明:半胱氨酸(Cys)的巰基、色氨酸(Trp)的吲哚基、組氨酸(His)的咪唑基是NAGase的必需基團;精氨酸(Arg)殘基及賴氨酸(Lys)的ε-氨基不是菜青蟲NAGase的必需基團。Jin等[7]也研究了鋸緣青蟹(Scyllaserrata)內(nèi)臟NAGase的必需基團,結(jié)果顯示Trp的吲哚基、His的咪唑基、Lys的ε-氨基是NAGase活性所必需的,Arg胍基和二硫鍵則不是鋸緣青蟹NAGase的必需基團。Xie等[8]對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)NAGase的必需基團研究表明:Trp的吲哚基、His的咪唑基、Lys的ε-氨基是NAGase活性所必需的,而Arg胍基和二硫鍵不是凡納濱對蝦NAGase活性所必需的。此外,林心宇等[16]研究了槐豬精液中NAGase的功能基團,研究判斷Cys的巰基、Trp的吲哚基、His的咪唑基以及Lys的ε-氨基是NAGase活性中心的功能基團,二硫鍵也是槐豬精液NAGase活性所必需的,但Arg的胍基不是酶活性所必需的基團。前已研究的蠑螺(TurbocornutusSolander)[11]內(nèi)臟NAGase的必需基團,發(fā)現(xiàn)Cys巰基和絲氨酸(Ser)羥基不是酶活性的必需基團,而Trp的吲哚基、Lys的ε-氨基是蠑螺NAGase活性部位的必需基團,而His的咪唑基是酶催化活性所必需的,但可能不處于酶的活性部位。
本研究結(jié)果表明:中國鱟NAGase中Lysε-氨基、His咪唑基、Trp吲哚基和Ser羥基經(jīng)化學(xué)修飾后,酶活力幾近喪失,這些氨基酸基團判斷為中國鱟NAGase活性的必需基團,且可能處于酶的活性部位;Cys巰基經(jīng)修飾后酶活力下降,但不完全失活,說明Cys巰基是中國鱟NAGase催化活性所必需的,但可能不處于酶的活性部位;DTT修飾NAGase中的二硫鍵后,酶活力明顯下降,證明二硫鍵在維系中國鱟NAGase酶蛋白三維空間構(gòu)象中起重要作用;而Arg胍基經(jīng)修飾后NAGase活性基本不變,說明Arg胍基不是中國鱟NAGase的必需基團。
總之,從不同生物來源NAGase酶蛋白的必需基團分析,Trp的吲哚基、His的咪唑基是大多數(shù)生物NAGase活性的必需基團,Arg胍基、Lys的ε-氨基、Cys巰基和二硫鍵在不同生物來源的NAGase中發(fā)揮著不同作用。