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中國鱟N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性必需基團的研究*

2020-11-26 01:29:52林建城周文虎林娟娟
關(guān)鍵詞:化學(xué)修飾幾丁質(zhì)二硫鍵

林建城, 周文虎, 林娟娟

(莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點實驗室, 福建 莆田 351100)

幾丁質(zhì)酶可降解幾丁質(zhì)中N-乙酰葡萄糖胺C1和C4間的糖苷鍵,是屬于糖基水解酶類。Broadway等[1]根據(jù)幾丁質(zhì)酶作用機理不同,認為其至少包含有內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)等3種不同組分,其中NAGase主要是通過對幾丁質(zhì)外切生成β-N-乙酰葡萄糖胺單體和寡聚糖,并將外切幾丁質(zhì)酶酶解幾丁質(zhì)產(chǎn)生的幾丁二糖繼續(xù)降解為單體。幾丁質(zhì)酶在動植物、微生物體內(nèi)普遍存在,在不同生物體中也發(fā)揮著不同的生理作用[2];其中節(jié)肢動物幾丁質(zhì)酶除了起到對含幾丁質(zhì)的食物進行酶解消化外,還與節(jié)肢動物周期性蛻皮蛻殼的生理現(xiàn)象密切相關(guān)[3]。為了闡明幾丁質(zhì)酶在昆蟲、蝦蟹、鱟等這些節(jié)肢動物周期性蛻皮過程的生理作用,幾丁質(zhì)酶的組成結(jié)構(gòu)及其催化機理成為了研究熱點[4]。

目前,對幾丁質(zhì)酶功能基團的研究方法主要有蛋白質(zhì)化學(xué)修飾法和定點突變技術(shù)。Fan等[5]用酶的定點突變技術(shù)研究了舞毒蛾(Lymantriadispar)幾丁質(zhì)酶的功能基團,發(fā)現(xiàn)Asp143、Asp145和Trp146三個具有高度保守性的氨基酸殘基與酶催化活性密切相關(guān);Lu等[6]也用該技術(shù)研究表明:煙草天蛾(Manducasexta)幾丁質(zhì)酶Trp142、Asp144和Glu146是酶活性部位的必需基團,Glu146在幾丁質(zhì)降解中主要起酸堿催化作用。Jin等[7]則采用蛋白質(zhì)化學(xué)修飾法研究了鋸緣青蟹(Scyllaserrata)NAGase的功能基團,證明了色氨酸是酶活性的必需基團,而酶中二硫鍵和精氨酸的胍基不是酶活性所必需的;Xie等[8]也對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)NAGase進行化學(xué)修飾,結(jié)果證明色氨酸是對蝦NAGase的必需基團,酶反應(yīng)動力學(xué)研究還發(fā)現(xiàn)對蝦NAGase酶分子催化活性只需一個色氨酸殘基參與。課題組已從中國鱟(Tachypleustridentatus)分離純化到NAGase[9],在研究其酶學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上,本研究進一步通過化學(xué)修飾法探討了中國鱟NAGase的功能基團,為揭示中國鱟在生活周期中蛻皮與幾丁質(zhì)酶活性之間的相關(guān)性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

參照文獻[9]所述方法分離純化中國鱟NAGase,分別通過抽提、30%和80%的飽和硫酸銨分級分離、Sephadex G-200凝膠層析以及DEAE-32離子交換層析分離,純化后獲得聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)單一純的酶制劑,比活力為505.21 U/mg,酶制劑在4 ℃下經(jīng)過雙蒸餾水透析后,用于酶化學(xué)修飾的研究。

NAGase催化的底物對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-β-D-GlcNAc),由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生化室合成;Sephadex G-200出自Pharmacia;纖維素DEAE-32是Whatman產(chǎn)品;對氯汞苯甲酸(p-chloromercuribenzoate,pCMB)是Sigma產(chǎn)品;苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)為Merk公司產(chǎn)品;甲醛、乙酸酐、三硝基苯磺酸(Trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)、二巰基蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)、乙酰丙酮(Acetylacetone,AA)、溴代乙酸(Bromoacetic acid,BrAc)、碘代乙酸(Iodoacetic acid,IAc)、N-溴代琥珀酰亞胺(N-bromosuccinimide,NBS),以及其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 中國鱟內(nèi)臟NAGase活力測定 中國鱟內(nèi)臟NAGase活力的測定方法參考文獻[9]。在2 mL的酶測活體系中,包含1 mL 75 mmol/L HAC-NaAC緩沖液(pH=5.4),0.2 mL 5 mmol/L的底物pNP-β-D-GlcNAc,0.78 mL的雙蒸餾水,20 μL酶液。在37 ℃下反應(yīng)10 min,以2 mL 0.5 mol/L NaOH終止反應(yīng),測定A405 nm,以未加入酶制劑的為空白對照組。

1.2.2 中國鱟內(nèi)臟NAGase功能基團的化學(xué)修飾 選擇TNBS等10種化學(xué)修飾劑,分別在不同修飾體系中對中國鱟NAGase進行化學(xué)修飾。TNBS、乙酸酐和DTT等3種修飾劑對酶的修飾在0.01 mol/L Tris-HCl(pH=8.0)緩沖體系37 ℃下進行,PMSF對酶的修飾采用同樣的緩沖體系,但是在25 ℃下進行;甲醛和NBS均在37 ℃下0.20 mol/L NaAc-HAc(pH=5.4)的緩沖體系中對酶進行修飾;乙酰丙酮則是在37 ℃下,0.01 mol/L Tris-HCl(pH=9.0)的緩沖體系中對酶進行修飾;在0.10 mol/L NaAc-HAc(pH=6.0)緩沖體系中,溴代乙酸在25 ℃下,碘代乙酸在37 ℃下分別對酶進行修飾;而pCMB是在0.05 mol/L NaAc-HAc(pH=5.8)緩沖體系中,37 ℃下對酶進行修飾。

修飾酶活力的測定:在NAGase酶液中按一定比例(V酶∶ V修飾劑=1∶3)分別加入不同的修飾劑,于各自的修飾體系中修飾30 min,然后取出50 μL的修飾酶,在NAGase測活體系中測定酶的剩余活力,設(shè)立了對照組,在化學(xué)修飾試驗中,為了排除修飾劑本身對試驗的干擾,在對照組設(shè)置中,則是在加入2 mL 0.5 mol/L NaOH后再加入50 μL修飾酶制劑。以測得的未修飾酶活力為100%,而修飾酶活力以相對酶活力(%)表示。

1.2.3 NBS對NAGase紫外吸收光譜和內(nèi)源熒光發(fā)射光譜的影響 NAGase經(jīng)0、2、 3、5、10 μmol/L濃度NBS化學(xué)修飾后,分別用日本島津UV-2550型紫外分光光度計掃描,測定NAGase經(jīng)修飾后的紫外吸收峰。此外,NAGase經(jīng)0、2、5、10、15、20 μmol/L濃度NBS化學(xué)修飾后,分別用美國Cary Eclipse熒光分光光度計掃描,在酶內(nèi)源熒光激發(fā)光譜波長為230.9 nm下,測定NAGase經(jīng)修飾后的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國鱟內(nèi)臟NAGase的分離純化

中國鱟內(nèi)臟NAGase通過抽提、硫酸銨沉淀分級分離、凝膠層析以及離子交換層析后,獲得NAGase酶制劑,透析后經(jīng)PAGE和SDS-PAGE檢定,電泳圖譜均顯示一譜帶(見圖1),說明經(jīng)分離純化后NAGase已達到電泳純,用此純酶制劑進行酶的化學(xué)修飾試驗。

圖1 中國鱟NAGase的PAGE(a)及SDS-PAGE(b)圖譜

2.2 氨基的化學(xué)修飾

采用甲醛和乙酸酐兩種氨基修飾劑[10],分別對中國鱟NAGase進行化學(xué)修飾,發(fā)現(xiàn)NAGase經(jīng)8 mmol/L甲醛修飾后,酶活力僅剩4.1%(見圖2);而乙酸酐在0~200 mmol/L濃度范圍內(nèi),對NAGase化學(xué)修飾的結(jié)果表明:隨乙酸酐修飾劑濃度的增加,NAGase活力逐漸下降,呈濃度效應(yīng),當乙酸酐修飾劑濃度達到200 mmol/L時,NAGase活力喪失了97.8%(見圖3)。有許多化合物可以修飾酶蛋白中賴氨酸ε-氨基,TNBS也是其中非常有效的一種[11]。研究發(fā)現(xiàn),隨著化學(xué)修飾劑TNBS濃度的增大,NAGase活力逐漸下降,20 mmol/L TNBS可使中國鱟NAGase活力喪失94.7%(見圖4)。這些結(jié)果表明了:NAGase的賴氨酸ε-氨基被化學(xué)修飾后,酶的活性變化大,賴氨酸ε-氨基是中國鱟NAGase活性的必需基團。

圖2 甲醛對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.2 Modification of NAGase from T. tridentatus by formaldehyde

圖3 乙酸酐對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.3 Modification of NAGase from T. tridentatus by Acetic anhydride

圖4 TNBS對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.4 Modification of NAGase from T. tridentatus by TNBS

2.3 羥基的化學(xué)修飾

PMSF是蛋白質(zhì)中絲氨酸羥基的專一化學(xué)修飾劑[11]。在偏堿性條件下,采用PMSF對中國鱟NAGase酶蛋白中絲氨酸羥基進行專一的化學(xué)修飾。結(jié)果見圖5,隨著修飾劑PMSF濃度的升高,修飾后酶的活力逐漸降低,當修飾劑PMSF濃度達到200 mmol/L時,NAGase活力幾乎喪失,結(jié)果表明:中國鱟NAGase酶蛋白中絲氨酸的羥基對酶活力是必需的,是酶的必需基團。

圖5 PMSF對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.5 Modification of NAGase from T. tridentatus by PMSF

2.4 巰基的化學(xué)修飾

巰基基團是蛋白質(zhì)分子中極易發(fā)生反應(yīng)的側(cè)鏈基團,其中有機汞試劑是最早使用的巰基修飾試劑,其中pCMB能專一修飾酶蛋白中半胱氨酸巰基[12]。選用有機汞試劑pCMB對中國鱟NAGase進行化學(xué)修飾,結(jié)果(見圖6)表明,NAGase經(jīng)pCMB化學(xué)修飾后,酶活力發(fā)生較大變化,當修飾劑pCMB濃度達到0.5 mmol/L時,NAGase活力已喪失83.4%,NAGase活力下降應(yīng)該是由于半胱氨酸巰基被修飾后酶蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生變化所致,說明半胱氨酸巰基是中國鱟NAGase活性的必需基團。

圖6 pCMB對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.6 Modification of NAGase from T. tridentatus by pCMB

2.5 二硫鍵的化學(xué)修飾

在偏堿性條件下,常用DTT將蛋白質(zhì)中的二硫鍵還原成游離巰基,對其進行特異性的化學(xué)修飾[12]。DTT對中國鱟NAGase酶蛋白的化學(xué)修飾結(jié)果如圖7所示,可見隨著修飾劑DTT濃度的提高,NAGase活力呈不斷下降趨勢,當DTT濃度達120 mmol/L時,酶活力則喪失了81.3%。DTT還原了NAGase酶蛋白中的二硫鍵,而二硫鍵的還原導(dǎo)致酶蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變,從而使酶催化活力發(fā)生改變。說明中國鱟NAGase酶蛋白中的二硫鍵與酶活力密切相關(guān),其二硫鍵在維系酶蛋白的三維空間構(gòu)象中起重要作用。

2.6 胍基的化學(xué)修飾

精氨酸殘基含有一個呈堿性的胍基,酶活性部位的胍基能結(jié)合帶有陰離子的底物,乙酰丙酮則能專一地修飾酶蛋白精氨酸殘基中胍基[13],在偏堿性條件下,乙酰丙酮與胍基相互作用后改變了精氨酸側(cè)鏈基團的結(jié)構(gòu),從而影響酶蛋白的性質(zhì),導(dǎo)致與底物的親和力發(fā)生變化。在本試驗中,發(fā)現(xiàn)乙酰丙酮在0~140 mmol/L濃度范圍內(nèi),中國鱟NAGase經(jīng)乙酰丙酮修飾后酶活力基本沒有變化,說明精氨酸胍基與NAGase活性無關(guān),精氨酸胍基不是中國鱟NAGase活性的必需基團。

圖7 DTT對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.7 Modification of NAGase from T. tridentatus by DTT

2.7 咪唑基的化學(xué)修飾

組氨酸咪唑基是許多酶活性部位的組成部分,在偏酸性的條件下,BrAc對酶蛋白中組氨酸殘基進行取代反應(yīng),生成羧甲基衍生物,可以特異性修飾蛋白質(zhì)中的組氨酸咪唑基[11]。BrAc對中國鱟NAGase的化學(xué)修飾結(jié)果(見圖8)表明,當BrAc濃度達到150 mmol/L時,NAGase活力只剩5.4%,幾乎喪失酶活力。進一步采用IAc作為中國鱟NAGase組氨酸咪唑基的化學(xué)修飾劑[10],結(jié)果如圖9所示,120 mmol/L IAc可使酶活力喪失93.5%。說明組氨酸咪唑基與中國鱟NAGase活力密切相關(guān),組氨酸咪唑基是中國鱟NAGase活性所必需的。

2.8 吲哚基的化學(xué)修飾

NBS是蛋白質(zhì)中色氨酸的特異性修飾試劑,可使吲哚基團氧化成羥吲哚衍生物,導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生變化[7]。NBS化學(xué)修飾中國鱟NAGase的結(jié)果(見圖10)表明:經(jīng)低濃度的NBS修飾后NAGase活力則迅速下降,25 μmol/L NBS修飾酶后,NAGase活力幾近喪失,說明中國鱟NAGase色氨酸吲哚基被氧化后酶催化活力發(fā)生較大變化。

圖8 BrAc對中國鱟NAGase活力的影響Fig.8 Modification of NAGase from T. tridentatus by BrAc

圖9 IAc 對中國鱟NAGase活力的影響Fig.9 Modification of NAGase from T. tridentatus by IAc

此外,中國鱟NAGase經(jīng)NBS修飾后,酶蛋白的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜強度也發(fā)生相應(yīng)變化。在0~5 μmol/L濃度范圍內(nèi),隨著修飾劑NBS濃度的增大,NAGase酶蛋白在273 nm波長處的紫外吸收峰值逐漸降低,10 μmol/L NBS下紫外吸收峰消失(見圖11)。而NAGase酶蛋白內(nèi)源熒光發(fā)射光譜峰在330.9 nm波長處,但NBS修飾后NAGase酶蛋白的熒光強度發(fā)生變化(見圖12),隨修飾劑NBS濃度增大,酶蛋白熒光強度呈不斷下降趨勢,熒光發(fā)射光譜峰出現(xiàn)向短波長移動(“藍移”)現(xiàn)象,20 μmol/L NBS使NAGase酶蛋白的熒光發(fā)射幾近焠滅,說明NBS對NAGase的生色基團——色氨酸的苯環(huán)修飾后,酶蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生較大變化,導(dǎo)致酶活力喪失;由于苯環(huán)共軛體系破壞,加上Trp殘基經(jīng)NBS修飾后其疏水性可能有所增強,導(dǎo)致熒光發(fā)射光譜峰發(fā)生“藍移”現(xiàn)象,隨著NBS濃度增大,“藍移”越多[14-15]。上述結(jié)果表明:色氨酸是中國鱟NAGase活性的必需基團。

圖10 NBS對中國鱟NAGase的修飾作用Fig.10 Modification of NAGase from T. tridentatus by NBS

(曲線1~5:NBS濃度分別為 0、2、3、5、10 μmol·L-1。The final concentrations of NBS were 0, 2, 3, 5 and 10 μmol·L-1for curves 1~5, respectively.)

圖11 中國鱟NAGase在NBS中的紫外吸收光譜
Fig.11 UV absorption spectra of NAGase from
T.tridentatusmodified by NBS

(曲線1~6, NBS濃度分別為 0、2、5、10、15、20 μmol·L-1。The final concentrations of NBS were 0,2,5,10,15 and 20 μmol·L-1for curves 1~6, respectively.)

圖12 中國鱟NAGase在NBS中的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜
Fig.12 Fluorescence emission spectra of NAGase from
T.tridentatusmodified by NBS

3 討論

蛋白質(zhì)化學(xué)修飾法已廣泛應(yīng)用在酶蛋白活性基團的研究中。石艷等[12]采用化學(xué)修飾法研究了菜青蟲(Pierisbrassicae)表皮NAGase活性的必需基團,結(jié)果表明:半胱氨酸(Cys)的巰基、色氨酸(Trp)的吲哚基、組氨酸(His)的咪唑基是NAGase的必需基團;精氨酸(Arg)殘基及賴氨酸(Lys)的ε-氨基不是菜青蟲NAGase的必需基團。Jin等[7]也研究了鋸緣青蟹(Scyllaserrata)內(nèi)臟NAGase的必需基團,結(jié)果顯示Trp的吲哚基、His的咪唑基、Lys的ε-氨基是NAGase活性所必需的,Arg胍基和二硫鍵則不是鋸緣青蟹NAGase的必需基團。Xie等[8]對凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)NAGase的必需基團研究表明:Trp的吲哚基、His的咪唑基、Lys的ε-氨基是NAGase活性所必需的,而Arg胍基和二硫鍵不是凡納濱對蝦NAGase活性所必需的。此外,林心宇等[16]研究了槐豬精液中NAGase的功能基團,研究判斷Cys的巰基、Trp的吲哚基、His的咪唑基以及Lys的ε-氨基是NAGase活性中心的功能基團,二硫鍵也是槐豬精液NAGase活性所必需的,但Arg的胍基不是酶活性所必需的基團。前已研究的蠑螺(TurbocornutusSolander)[11]內(nèi)臟NAGase的必需基團,發(fā)現(xiàn)Cys巰基和絲氨酸(Ser)羥基不是酶活性的必需基團,而Trp的吲哚基、Lys的ε-氨基是蠑螺NAGase活性部位的必需基團,而His的咪唑基是酶催化活性所必需的,但可能不處于酶的活性部位。

本研究結(jié)果表明:中國鱟NAGase中Lysε-氨基、His咪唑基、Trp吲哚基和Ser羥基經(jīng)化學(xué)修飾后,酶活力幾近喪失,這些氨基酸基團判斷為中國鱟NAGase活性的必需基團,且可能處于酶的活性部位;Cys巰基經(jīng)修飾后酶活力下降,但不完全失活,說明Cys巰基是中國鱟NAGase催化活性所必需的,但可能不處于酶的活性部位;DTT修飾NAGase中的二硫鍵后,酶活力明顯下降,證明二硫鍵在維系中國鱟NAGase酶蛋白三維空間構(gòu)象中起重要作用;而Arg胍基經(jīng)修飾后NAGase活性基本不變,說明Arg胍基不是中國鱟NAGase的必需基團。

總之,從不同生物來源NAGase酶蛋白的必需基團分析,Trp的吲哚基、His的咪唑基是大多數(shù)生物NAGase活性的必需基團,Arg胍基、Lys的ε-氨基、Cys巰基和二硫鍵在不同生物來源的NAGase中發(fā)揮著不同作用。

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