張凱強(qiáng)， 常志成， 溫海深， 李吉方， 齊 鑫， 張曉燕， 李 昀

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

花鱸(Lateolabraxmaculatus)隸屬于鱸形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)花鱸屬(Lateolabrax)，俗名海鱸、鱸魚(yú)、七星鱸、寨花等，廣泛分布于中國(guó)沿海以及朝鮮沿海，是中國(guó)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類[1]。由于花鱸具有廣溫廣鹽性的特點(diǎn)，已經(jīng)成為南北方網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要對(duì)象，養(yǎng)殖規(guī)模正逐步擴(kuò)大。同時(shí)花鱸耐受能力強(qiáng)，是環(huán)境因子脅迫研究的理想對(duì)象。

溶解氧是影響水生動(dòng)物生長(zhǎng)、代謝等生命活動(dòng)的重要環(huán)境因子，是維持水生動(dòng)物生存的基本條件[2]。而當(dāng)今人口增長(zhǎng)、溫室效應(yīng)，魚(yú)類高密度養(yǎng)殖等因素致使魚(yú)類面臨著低氧環(huán)境的威脅，低氧對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)、存活、行為、生理生化以及發(fā)育和繁殖等產(chǎn)生影響[3]。生物體在適應(yīng)低氧環(huán)境的長(zhǎng)期進(jìn)化中已經(jīng)形成了一系列的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。這些基因能夠接受低氧信號(hào)的調(diào)節(jié)并參與低氧應(yīng)答，是低氧應(yīng)答機(jī)制中重要的分子基礎(chǔ)[4]。低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia Inducible Factors，hifs)是其中的關(guān)鍵基因之一，在生物體的環(huán)境缺氧應(yīng)答機(jī)制中起著非常重要的作用。

低氧誘導(dǎo)因子(hifs)最先由Semenza等[5]在低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)，是由α和β亞基組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子。HIFa亞基主要包括3種：HIF1α、HIF2α和HIF3α三者均受氧氣濃度的調(diào)節(jié)與影響，并能夠使HIF的活性發(fā)生變化[6]。HIF1b也稱為芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator，arnt)，是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對(duì)氧濃度的變化不敏感，其功能主要與其他轉(zhuǎn)錄因子形成異源二聚體參與調(diào)控過(guò)程，如低氧下與HIFa聚合成二聚體參與低氧基因的調(diào)控[7-10]以及參與器官形成、神經(jīng)發(fā)育[18]等。hifs基因在催化低氧相關(guān)基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，研究表明hifs可通過(guò)與低氧反應(yīng)元件(Hypoxia Response Element, HRE)相結(jié)合來(lái)調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，從而參與低氧狀態(tài)機(jī)體的生理響應(yīng)，例如：促進(jìn)紅細(xì)胞生成、血管生成，碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，線粒體代謝和凋亡等[7-8,11-12]。

目前，關(guān)于魚(yú)類hifs的研究主要集中在hifα亞基[13-15]。有關(guān)花鱸低氧調(diào)控的研究也較少，其分子機(jī)制尚不清楚。本研究對(duì)花鱸4個(gè)hifs基因序列進(jìn)行了全面的分析研究，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR手段檢測(cè)了花鱸hifs在各組織中的表達(dá)模式，對(duì)hifs在低氧脅迫下的表達(dá)變化以及相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行了探討。本研究結(jié)果為深入研究花鱸4個(gè)hifs基因在低氧調(diào)控中的功能提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為了解其它魚(yú)類在低氧脅迫時(shí)機(jī)體的生理調(diào)控與分子調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

實(shí)驗(yàn)于中國(guó)海洋大學(xué)魚(yú)類繁殖生理與種子工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)對(duì)象為體長(zhǎng)(21.43±0.77)cm、體重(149.20±19.22)g的花鱸幼魚(yú)。實(shí)驗(yàn)用魚(yú)于400 L的塑料圓桶中暫養(yǎng)2周，暫養(yǎng)期間溶氧為7.5～8.0 mg/L，溫度為(19±0.5)℃，鹽度為30。每天09:00和17:00投餌2次，投餌后清除殘餌并換水。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一天停止投喂。

1.2 低氧脅迫實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)容器為3個(gè)400 L的塑料圓桶，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前通過(guò)快速注入氮?dú)鈦?lái)降低溶氧含量，利用溶氧儀(YSI DO200)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)桶內(nèi)溶氧水平。當(dāng)溶氧量達(dá)到2 mg/L時(shí)，往3個(gè)實(shí)驗(yàn)圓桶內(nèi)平均放入40尾花鱸幼魚(yú)，適應(yīng)10 min后開(kāi)始計(jì)時(shí)，期間通過(guò)注入少量空氣以及適量氮?dú)鈦?lái)維持桶內(nèi)溶解氧的相對(duì)穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)分為低氧脅迫與常氧恢復(fù)兩個(gè)階段，低氧為(1.56±0.24)mg/L，低氧脅迫24 h。24 h后通過(guò)迅速注入純氧使氧氣水平達(dá)到8 mg/L，期間通過(guò)注入純氧和適量氮?dú)鈦?lái)維持溶解氧的相對(duì)穩(wěn)定，常氧維持在(7.72±0.18)mg/L。低氧脅迫期間的取樣時(shí)間點(diǎn)分別為3、6、12和24 h，復(fù)氧取樣時(shí)間點(diǎn)分別為3和12 h。

1.3 樣品采集與處理

對(duì)低氧脅迫與常氧恢復(fù)的各時(shí)間點(diǎn)以及暫養(yǎng)桶中樣品進(jìn)行取樣，其中暫養(yǎng)桶中樣品作為對(duì)照組取樣，每個(gè)桶每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取樣3尾花鱸幼魚(yú)，用MS-222(200 mg/L)進(jìn)行麻醉，然后快速解剖進(jìn)行肝、鰓、肌肉、腦、垂體、心臟、腸、胃、脾、腎組織的取樣。樣品迅速放于液氮中速凍后放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA的提取與cDNA的合成

總RNA的提取采用Trizol (Invitrogen, USA)提取法。cDNA按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (RR047A Takara)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行合成。合成的cDNA暫時(shí)存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 花鱸4個(gè)hifs基因序列與進(jìn)化分析

花鱸4個(gè)hifs基因序列來(lái)自花鱸基因組(未公開(kāi))及轉(zhuǎn)錄組(SRR4409341 (LS)和 SRR4409397 (HS))，通過(guò)NCBI-Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線分析軟件進(jìn)行比對(duì)，初步確定各基因，利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線分析軟件，對(duì)確定的基因序列進(jìn)行閱讀框、氨基酸序列推定。同時(shí)通過(guò)DNAMAN Version 6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性的比較。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)一步確定各基因，采用的方法為鄰接法(Neighbor-joining, NJ)，bootstrap數(shù)值為1 000。

1.6 共線性分析

為進(jìn)一步注釋花鱸4個(gè)hifs基因，本研究進(jìn)行了共線性分析。共線性分析是基于花鱸4個(gè)hifs基因與其它物種對(duì)應(yīng)基因間臨近基因進(jìn)行對(duì)比建立起來(lái)的。對(duì)于hifs各基因臨近基因的查找來(lái)自花鱸基因組，其它物種基因位置的確定來(lái)自Genomicus[16]和Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.ensembl.org/)。

1.7 花鱸4個(gè)hifs基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)表達(dá)分析

根據(jù)花鱸基因組4個(gè)hifs基因序列，設(shè)計(jì)相關(guān)qRT-PCR引物(見(jiàn)表1)。20 μL qRT-PCR反應(yīng)體系包括：10 μL SYBR?FAST qPCR Master Mix (2×)，0.4 μL ROX Reference Dye (50×)，2 μL cDNA模板，上下游引物各0.4 μL以及6.8 μL的ddH2O。使用Step One Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystems)PCR儀進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃，5 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。18s RNA作為內(nèi)參基因，基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR表達(dá)分析的引物序列Table 1 Primer sequences for mRNA expression analysis

1.8 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用軟件SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)及Duncan多重比較，以P<0.05作為差異顯著水平，用Excel2010進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 花鱸4個(gè)hifs基因序列分析

對(duì)花鱸hifs基因序列信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(見(jiàn)表2)。如表2所示，hifs基因CDS序列長(zhǎng)度范圍為2 043～2 676 bp，分別編碼733～891個(gè)氨基酸。用于花鱸hifs基因同源性分析的物種包括人(Homosapiens)、鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、斑馬魚(yú)(Daniorerio)。對(duì)花鱸hifs基因與以上物種同源性分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(見(jiàn)表3)。如表3所示，hif1a與其它物種同源性為59.8%～65.1%，hif2a為48.8%～61.6%，hif3a為39.9%～58.5%，hif1b為59.6%～82.0%。

表2 hifs基因序列信息統(tǒng)計(jì)

表3 花鱸與其他物種hifs基因間氨基酸序列比對(duì)Table 3 Comparison of the amino acid sequences of the hifs genes between the spotted sea bass and other species

2.2 花鱸4個(gè)hifs基因系統(tǒng)進(jìn)化與共線性分析

對(duì)花鱸和不同物種的4個(gè)hifs基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖1)。如圖1所示，選擇的物種主要包括人、鼠、雞、斑馬魚(yú)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)、青鳉(Oryziaslatipes)等。進(jìn)化樹(shù)共分為兩大分支：hif1α、hif2α和hif3α共同聚為其中一個(gè)較大的分支；同時(shí)又分為兩個(gè)分支，其中hif1α和hif2α聚為一支，說(shuō)明hif1α和hif2α同源關(guān)系相對(duì)較近，hif3α單獨(dú)聚為一支。而hif1β單獨(dú)聚為另一分支。說(shuō)明hif1β在進(jìn)化關(guān)系上與hif1α、hif2α和hif3α同源性相對(duì)較遠(yuǎn)。

(黑色圓點(diǎn)表示花鱸hifs基因。The black dots in the chart indicate the positions of the hifs genes.)圖1 花鱸和其它物種hifs基因的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

對(duì)花鱸和不同物種的4個(gè)hifs基因進(jìn)行共線性分析(見(jiàn)圖2)。如圖2所示，用于共線性分析的物種為人、鼠、虹鱒、斑點(diǎn)叉尾鮰。對(duì)于hif1α基因(見(jiàn)圖2(A))，花鱸與虹鱒具有相同的臨近基因trmt5，花鱸與人也具有相同的臨近基因trmt5，但排列順序相反，其它相同基因的排列順序不一致?；|和人、鼠hif2α基因臨近的pigf、msh2基因相同(見(jiàn)圖2(B))。花鱸hif3a基因與人、鼠有相同臨近基因pak4(見(jiàn)圖2(C))。對(duì)于hif1β基因(見(jiàn)圖2(D))，花鱸與斑點(diǎn)叉尾鮰具有相同的臨近基因rps9和cnot3，花鱸與人臨近基因相同但排列順序不同。因此，各hif基因的共線性相對(duì)保守，進(jìn)一步證明本研究對(duì)花鱸hif基因注釋的正確性。

((A)表示hif1α基因；(B)表示hif2α基因；(C)表示hif3α基因；(D)表示hif1β基因。(A) indicatedhif1αgene; (B) indicatedhif2αgene;(C) indicatedhif3αgene;(D) indicatedhif1βgene.)

圖2 花鱸和其它物種hifs基因共線性分析

Fig.2 Syntenic analysis forhifs genes in spotted sea bass and other species

2.3 花鱸4個(gè)hifs基因在10個(gè)組織中的表達(dá)分析

花鱸10個(gè)組織分別為肝、鰓、肌、腦、垂、心、腸、胃、脾、腎。其中以表達(dá)量較小的肌肉組織作為參照，進(jìn)行4個(gè)hifs基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算(見(jiàn)圖3)。由圖3可知，hifs基因在10個(gè)組織中的表達(dá)情況不同，其中hif1α在花鱸脾中表達(dá)量最高，其表達(dá)量是肌肉16.59倍，在肌肉中表達(dá)量最低，其它組織依次為心臟，鰓，腎，腸，肝，胃，垂體，腦；hif2α在肌肉、腦中的表達(dá)量較低，而在鰓中的表達(dá)量最高，約為肌肉中的24.76倍；hif3α在腸和胃中表達(dá)相對(duì)較高，其次為脾臟、心臟和腎，其它組織的表達(dá)量相對(duì)較低；hif1β在鰓組織中的表達(dá)量最高，其表達(dá)量約為肌肉的22.33倍。

2.4 花鱸4個(gè)hifs基因?qū)Φ脱醯捻憫?yīng)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以對(duì)照組0 h基因的表達(dá)量為參照，測(cè)定了低氧脅迫與常氧恢復(fù)階段花鱸肝組織和鰓組織hifs基因的表達(dá)情況(見(jiàn)圖4和5)。由圖4和5可知，hifs各個(gè)基因?qū)Φ脱醯捻憫?yīng)時(shí)間和響應(yīng)程度存在顯著差異。如圖4所示，肝組織中，低氧脅迫3 h后，hifs基因相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著升高(P<0.05)，其中hif1α、hif2α、hif3α分別升高了3.76，3.81，3.82倍，hif1β升高2.51倍；低氧脅迫12 h后，僅有hif1α表達(dá)量仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；低氧脅迫24 h以及恢復(fù)正常溶氧3和12 h時(shí)，各基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比均沒(méi)有顯著差異。如圖5所示，鰓組織中，低氧脅迫3 h后，hif1α、hif2α與hif3α相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，其中hif1α升高2.43倍，hif2α升高1.76倍，hif3α升高6.89倍；低氧脅迫6h后，僅hif3α、hif1β基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，hif3α相對(duì)表達(dá)量升高6.01倍，hif1β則升高2.11倍；而其它時(shí)間點(diǎn)各基因相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著差異。

(10個(gè)組織從左至右分別為：1：肝，2：鰓，3:肌肉，4:腦，5:垂體，6:心臟，7:腸，8:胃，9:脾，10:腎。The order of ten tissues from left to right: 1:liver, 2:gill, 3:muscle, 4:brain, 5:pituitary, 6:heart, 7:intestine, 8:stomach, 9:spleen, 10:kidney.)

圖3 花鱸hifs基因在不同組織中的表達(dá)情況

Fig.3 The expression ofhifs genes of spotted sea bass in different tissues

(0～24 h為低氧脅迫期間的取樣時(shí)間點(diǎn)，R3h和R12h為復(fù)氧取樣時(shí)間點(diǎn)。0～24 h is the sampling time point during hypoxic stress,R3h and R12h is the sampling time point during reoxygenation.The same as below.)

圖4 低氧脅迫下hifs基因在花鱸肝臟中的表達(dá)情況

Fig.4 The expression profile ofhifs genes of spotted sea bass in liver tissue under hypoxia challenge

圖5 低氧脅迫下hifs基因在花鱸鰓中的表達(dá)情況

3 討論

溫室效應(yīng)等導(dǎo)致的全球變暖，以及魚(yú)類高密度養(yǎng)殖，經(jīng)常會(huì)使養(yǎng)殖水體出現(xiàn)短期的急性缺氧狀況，嚴(yán)重的急性缺氧會(huì)造成“翻塘”，引起魚(yú)類的瞬間大量死亡，對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)造成大量的損失。因此，研究與低氧脅迫相關(guān)的基因在急性低氧中的表達(dá)情況，對(duì)魚(yú)類低氧應(yīng)答研究具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。在本實(shí)驗(yàn)中，我們從花鱸4個(gè)hifs基因鑒定、基因組織表達(dá)和低氧誘導(dǎo)hifs表達(dá)三個(gè)方面探索了急性低氧對(duì)花鱸hifs基因的影響。

3.1 花鱸hifs基因序列分析

本文4個(gè)hifs基因序列均來(lái)自花鱸基因組，其氨基酸長(zhǎng)度分別為818、891、680和733 aa，各基因長(zhǎng)度與其他物種相似，說(shuō)明各基因在進(jìn)化過(guò)程中保持著較強(qiáng)的保守性，這可能與其生物學(xué)功能相關(guān)?；?個(gè)hifs基因氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中，各基因首先與魚(yú)類聚為一支，然后在與哺乳類聚在一起，這與Mu等[15]和Shen等[17]對(duì)hif1α和hif2α的研究結(jié)果相一致。共線性結(jié)果表明hifs各基因與相應(yīng)物種具有相同的臨近基因，進(jìn)一步證明了本研究對(duì)花鱸4個(gè)hifs基因命名的準(zhǔn)確性。

3.2 hifs基因在花鱸10個(gè)組織中的差異表達(dá)分析

花鱸hifs基因在10個(gè)組織中的表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：hifs基因在不同組織的表達(dá)豐度不同，如hif1α在花鱸的脾臟中表達(dá)最高，肌肉中表達(dá)最低，hif2α在鰓中表達(dá)最高，肌肉中表達(dá)最低，hif3α在胃中表達(dá)最高，鰓中表達(dá)最低；hif1β表達(dá)量在鰓組織中最高，肌肉組織中最低?？傮w而言，花鱸hifs表達(dá)量在鰓、脾臟、胃中相對(duì)較高，而在肌肉中相對(duì)較低，表明hifs表達(dá)具有組織特異性。姜華鵬等[18]對(duì)高原軟刺裸鯉(Gymnocyprisdobula)hif1B和hif2A的研究得到了與本實(shí)驗(yàn)相似的結(jié)果，其在鰓中表達(dá)量最高，而在脾臟、腦和皮膚中的表達(dá)量較低。而張慧[19]對(duì)黃顙魚(yú)(Pelteonagrusfulvidsco)hif1α的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)不同，其在肝臟中相對(duì)表達(dá)量最高，腎臟次之，鰓中最少。相似的Mohindra V等[20]對(duì)印度鯰(Clariasbatrachus)hifα的研究與本研究結(jié)果也不一致，其表達(dá)量均在腦中最高。以上結(jié)果表明，hifs的表達(dá)同時(shí)具有物種差異性。

3.3 低氧誘導(dǎo)hifs在花鱸肝、鰓組織中的表達(dá)分析

魚(yú)類鰓器官是魚(yú)體的主要呼吸器官并且與外界水環(huán)境直接接觸，最先感知水體溶解氧的變化，同時(shí)鰓表面積大，具有調(diào)節(jié)滲透壓、酸堿平衡，排泄廢物等功能，相比于其他器官更容易受到低氧脅迫的影響，對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)造成威脅[21-22]。同時(shí)肝臟是動(dòng)物在低氧脅迫時(shí)進(jìn)行代謝調(diào)整的關(guān)鍵器官[23]，并且低氧會(huì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡[24-25]。研究花鱸hifs在低氧脅迫下鰓、肝組織中的表達(dá)情況，對(duì)研究花鱸的低氧應(yīng)答機(jī)制具有理論意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hifs基因?qū)Φ脱醯捻憫?yīng)時(shí)間和響應(yīng)程度存在一些差異。肝組織中，低氧脅迫3 h后，hifs基因表達(dá)量均出現(xiàn)了顯著升高，說(shuō)明在低氧條件下肝器官能夠迅速做出應(yīng)對(duì)；而低氧脅迫12 h后，僅hif1α表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，其余基因與對(duì)照組相比差異不顯著，由此可以看出hif1α基因在肝組織低氧調(diào)控12 h內(nèi)持續(xù)起作用，而其它hifs基因僅在前6 h起作用。在鰓組織中，與肝組織中的變化規(guī)律相似，低氧脅迫3 h后hif1α、hif2α、hif3α顯著升高，hif1β基因表達(dá)無(wú)顯著差異。說(shuō)明前3 h的低氧脅迫中，在鰓組織僅hifα基因起調(diào)控作用。而低氧脅迫6 h后，hif1β基因與hif3α基因表達(dá)量顯著升高，其他基因表達(dá)無(wú)顯著變化，說(shuō)明6 h后，hif3α和hif1β基因共同調(diào)控低氧脅迫。關(guān)于其他魚(yú)類hifα的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相似，如印度鯰[20]、胭脂魚(yú)(Myxocyprinusasiaticus)[26]、河鱸(Percafluviatilis)[27]低氧脅迫后，肝中hifa基因的表達(dá)量顯著升高，斑點(diǎn)叉尾鮰[14]受低氧脅迫5 h后，hifα各基因在鰓、肝中表達(dá)量均顯著升高，許氏鲆鮋(Sebastesschlegeli)[15]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[17]低氧脅迫后，分別在肝、鰓組織中hif2α表達(dá)量顯著升高。在hifs中，常氧條件下α亞基沒(méi)有活性，當(dāng)處于低氧環(huán)境時(shí)，α亞基會(huì)迅速被激活并與相應(yīng)的低氧靶基因反應(yīng)元件結(jié)合，促使基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引發(fā)低氧應(yīng)答[28]。β亞基則較為穩(wěn)定，需與α亞基構(gòu)成二聚體后響應(yīng)低氧脅迫。在本實(shí)驗(yàn)中，肝組織中hif1β基因在低氧3和6 h顯著升高，說(shuō)明花鱸肝組織中hif1β基因可能是配合hifα基因的升高，相互作用共同響應(yīng)低氧應(yīng)答。相似的，鰓組織中在低氧脅迫6 h時(shí)hif1β、hif3α顯著升高，此時(shí)可能是其相互作用響應(yīng)低氧脅迫。hifs基因在對(duì)低氧的響應(yīng)時(shí)間以及強(qiáng)度上存在顯著差異，反映出各個(gè)基因在低氧應(yīng)答中所起的作用以及表達(dá)模式不同，其具體的調(diào)控模式與分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語(yǔ)

低氧誘導(dǎo)因子hifs是低氧應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在魚(yú)類的環(huán)境缺氧應(yīng)答中起著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)鑒定、分析了花鱸4個(gè)hifs基因：hif1α、hif2α、hif3α、hif1β，并檢測(cè)了各個(gè)基因的組織表達(dá)情況。結(jié)果表明花鱸4個(gè)hifs基因存在組織表達(dá)特異性，說(shuō)明hifs參與了不同的生物學(xué)過(guò)程。進(jìn)一步對(duì)hifs基因進(jìn)行低氧脅迫后肝、鰓組織中的表達(dá)分析，結(jié)果表明不同基因在不同組織中對(duì)低氧的響應(yīng)時(shí)間和響應(yīng)程度存在顯著差異。本實(shí)驗(yàn)對(duì)花鱸hifs基因?qū)Φ脱醯捻憫?yīng)模式進(jìn)行了初步的研究，其具體的生理與分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。