單洪偉， 于 鵬， 劉 寬， 于明超，馬 甡

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003； 2.通威股份有限公司，四川 成都 610041)

益生菌可以促進(jìn)蝦的生長(zhǎng)、影響其消化酶活力、增強(qiáng)其免疫應(yīng)答水平、提高其對(duì)病原菌的抵抗能力等，被廣泛應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖中[1-2]。目前，凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)養(yǎng)殖常用的益生菌種類包括光合細(xì)菌、酵母菌(Saccharomycessp.)、乳酸菌(Lactobacillussp.)及芽孢桿菌(Bacillussp.)等。其中，由于芽孢桿菌在養(yǎng)殖環(huán)境中分布廣泛，致病性較低，已經(jīng)在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用并取得了很好的效果。飼料添加是益生菌主要應(yīng)用方式之一，除了直接在飼料中添加菌體外，細(xì)菌源活性物質(zhì)，如肽聚糖、脂多糖、葡聚糖等可以作為免疫增強(qiáng)劑添加到飼料中以提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗病力[3-4]。

生物機(jī)體的能量代謝與各種生理功能密切相關(guān)，其在機(jī)體生長(zhǎng)、繁育以及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持系統(tǒng)之間的分配存在一種利于自我生存的調(diào)控平衡態(tài)，一旦失衡就會(huì)引發(fā)組織功能紊亂，影響到機(jī)體整體的活力以及健康水平[5-6]。已有研究表明，凡納濱對(duì)蝦在感染白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)后，能量代謝過程遭到破壞，機(jī)體能量代謝速率變緩，并會(huì)引發(fā)Warburg 效應(yīng)，使體內(nèi)乳酸含量增加，最終導(dǎo)致死亡[7-8]。因此，凡納濱對(duì)蝦的能量代謝與其抗病能力密切相關(guān)。但是目前，基于能量代謝角度探討益生菌相關(guān)作用機(jī)制的研究較少。

該實(shí)驗(yàn)以前期篩選得到的一株芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)材料，粗提取其胞外蛋白和胞內(nèi)多糖組分后與配合飼料混合并飼喂凡納濱對(duì)蝦，探究芽孢桿菌2種粗提物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、能量代謝水平、消化酶活力及抗WSSV能力的影響。本研究一方面為芽孢桿菌功能組分在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料，另一方面嘗試從能量代謝的角度闡明芽孢桿菌的益生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和條件

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及組分提取 以本實(shí)驗(yàn)室篩選出的芽孢桿菌BZ5株為實(shí)驗(yàn)菌株。該菌株篩選自浙江舟山凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘，經(jīng)16SrRNA基因序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建結(jié)果顯示，該菌株與巨大芽孢桿菌(B.megaterium)親緣關(guān)系最近，前期研究結(jié)果表明其能夠提高對(duì)蝦抗WSSV能力[9]。

芽孢桿菌BZ5株胞外蛋白粗提物的提取采用硫酸銨沉淀法[10]。主要操作如下：將芽孢桿菌發(fā)酵液離心(4 ℃, 10 000 r/min, 10 min)后，在上清液中加入硫酸銨至80%飽和。靜置24 h后再次離心(4 ℃, 10 000 r/min, 20 min)，并收集沉淀。沉淀用一定量的PBS溶解后，用蒸餾水進(jìn)行透析。透析液凍干后，即得到芽孢桿菌胞外蛋白粗提物。

芽孢桿菌BZ5株胞內(nèi)多糖粗提物的提取采用水提醇沉法[11]。用超聲波破碎芽孢桿菌菌體后，在破碎菌液中加入10倍體積蒸餾水，95 ℃恒溫水煮2 h，然后收集離心(4 000 r/min, 10 min)后的上清液。加無水乙醇至上清液中，使乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到95%，離心(2 000 r/min, 10 min)后取沉淀。并利用Savage試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)去除沉淀中的蛋白層。收集去除蛋白層后的水相，通過冷凍干燥獲得胞內(nèi)多糖粗提物。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用蝦及飼料 實(shí)驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦購(gòu)自山東省青島市寶榮水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司，體色和活力正常，初始體重為(0.88±0.04) g，體長(zhǎng)為(4.19±0.06) cm。

以煙臺(tái)大樂凡納濱對(duì)蝦配合飼料為基礎(chǔ)飼料。飼料的主要營(yíng)養(yǎng)成分包括：粗蛋白含量≥39%、粗脂肪≥4%、粗纖維≤6%、鈣≤5%、總磷≥1.2%、水分≤11.0%。將提取物用適量的水稀釋，采用噴淋攪拌的方式與配合飼料進(jìn)行混勻，于30 ℃條件下干燥并保存至-20 ℃條件下備用。以上2種粗提物添加量均為1%，即每kg配合飼料添加10 g粗提物。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)條件 該實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)養(yǎng)殖水循環(huán)系統(tǒng)中進(jìn)行。該水循環(huán)系統(tǒng)組成包括：玻璃缸(50 cm×35 cm×50 cm)、砂濾罐、紫外消毒器、泡沫分離器。整個(gè)養(yǎng)殖期間水質(zhì)條件如下：水溫(26.00±1.00)℃，鹽度30.00±1.50，pH為7.7～8.1，DO≥6 mg/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與管理

1.2.1 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組(Blank)、胞外蛋白組(Ex-Pro)及胞內(nèi)多糖組(In-Poly)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置4個(gè)平行組，每個(gè)平行15只對(duì)蝦。其中，對(duì)照組只投喂配合飼料；胞外蛋白組投喂含1%芽孢桿菌胞外蛋白粗提物的配合飼料；胞內(nèi)多糖組投喂含1%芽孢桿菌胞內(nèi)多糖粗提物的配合飼料。養(yǎng)殖期間每天投喂3餐，根據(jù)對(duì)蝦的生長(zhǎng)及攝食情況合理調(diào)整投喂量，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)共持續(xù)28 d。

1.2.2 WSSV感染實(shí)驗(yàn) 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，凡納濱對(duì)蝦停食1 d，參照Feng[12]等的方法將各實(shí)驗(yàn)組剩余的蝦進(jìn)行WSSV注射感染實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)所用WSSV由中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫學(xué)研究室提供，提取自感染W(wǎng)SSV病毒的中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)鰓組織。使用前用0.01 mol/L PBS稀釋1 000倍，在蝦腹部第四、五節(jié)之間注射，注射劑量為50 μL。觀察、統(tǒng)計(jì)各組凡納濱對(duì)蝦死亡數(shù)并計(jì)算累積死亡率。

1.3 樣品采集與測(cè)定

1.3.1 樣品采集與保存 于實(shí)驗(yàn)第0天從所有實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦中隨機(jī)取3只對(duì)蝦，實(shí)驗(yàn)過程中，分別在14和28 d隨機(jī)從各實(shí)驗(yàn)組取3只對(duì)蝦，將對(duì)蝦肝胰腺、肌肉及腸道組織取出后放入超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品測(cè)定 準(zhǔn)確稱取各組對(duì)蝦肝胰腺、肌肉及腸道組織0.2 g于預(yù)冷的生理鹽水(樣品質(zhì)量與生理鹽水體積比為1∶9)中充分勻漿，離心(2 500 r/min, 10 min)取上清液進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定。肝胰腺及肌肉中能量代謝相關(guān)酶指標(biāo)包括己糖激酶(HK)活力、磷酸果糖激酶(PFK)活力、丙酮酸激酶(PK)活力、乳酸脫氫酶(LDH)活力、琥珀酸脫氫酶(SDH)活力、脂肪酸合酶(FAS)含量，腸道消化酶指標(biāo)包括蛋白酶活力、淀粉酶活力、脂肪酶活力。以上指標(biāo)均使用南京建成試劑盒測(cè)定，具體操作按照相應(yīng)試劑盒操作說明完成。

肝胰腺中電子傳遞系統(tǒng)(Electron Transport System, ETS)活力參考De Coen等[13]的方法進(jìn)行測(cè)定，操作步驟為：將肝胰腺組織放入緩沖液(75 mmol/L MgSO4,1.5 g/L polyvinypyrrolidone, 0.2% Triton X-100 and 0.1 mol/L TriseHCl, pH=8.5)中勻漿后，離心(800g, 10 min)并取上清液50 μL加入到150 μL反應(yīng)體系(1.7 mmol/L NADH, 0.25 mmol/L NADPH, 0.2% Triton X-100 and 0.1 mmol/L TriseHCl, pH=8.5)中。在體系中繼續(xù)加入100 μL p-Iodonitroterazolium，20 ℃下反應(yīng)10 min，立即加入50 μL終止液(50%甲醛，50% 1 mol/L H3PO4)使反應(yīng)終止，利用分光光度計(jì)測(cè)定體系最終吸光度OD490。通過ε=15 900/(mol·L-1)計(jì)算甲瓚的生成量，然后通過甲瓚的生成量換算成O2的消耗量(體系每生成2 mmol甲瓚消耗1 mmol O2)，以消耗的O2量表示ETS活力。

在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)量各組蝦的質(zhì)量，并計(jì)算其相對(duì)增重率(Weight gain rate, WGR)和特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate, SGR)，計(jì)算公式如下：

WGR=[(Wt-W0)/W0] ×100；

SGR(%·d-1)=[(lnWt-lnW0)/T] ×100。

式中：W0表示初始質(zhì)量(g)；Wt表示養(yǎng)殖結(jié)束后的質(zhì)量(g)；T表示間隔天數(shù)(d)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)表示，酶學(xué)測(cè)定時(shí)每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理重復(fù)3次(N=3)，對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)不同實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，應(yīng)用Duncan多重比較檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)之間的差異性。通過軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，P<0.05即表示具有顯著差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 芽孢桿菌蛋白和多糖粗提物對(duì)幼蝦生長(zhǎng)性能的影響

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組凡納濱對(duì)蝦的終末體重、WGR、SGR和成活率如表1所示。在飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物后，凡納濱對(duì)蝦的體重、WGR、SGR及成活率與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。

表1 各組凡納濱對(duì)蝦的終末體重、相對(duì)增重率、特定生長(zhǎng)率及成活率Table 1 Final body weight, WGR, SGR, and survival rate of L. vannamei in different groups

2.2 芽孢桿菌蛋白和多糖粗提物對(duì)幼蝦肝胰腺中能量代謝相關(guān)酶活力的影響

飼喂胞內(nèi)多糖粗提物使HK活力下降，且胞內(nèi)多糖組HK活力在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)前期顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(見圖1A)。在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)前期，胞外蛋白組PFK活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(見圖1B)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，胞外蛋白組與對(duì)照組之間無顯著差異(P>0.05)。各組凡納濱對(duì)蝦PK活力無顯著差異，但隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(見圖1C)。

胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組LDH活力在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)前期顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(見圖1D)。但在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期，胞外蛋白組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，而胞內(nèi)多糖組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

胞外蛋白組SDH活力在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)前期與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，但養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(見圖1E)。飼喂胞內(nèi)多糖粗提物后，凡納濱對(duì)蝦SDH活力與對(duì)照組無顯著性差異及明顯變化規(guī)律(P>0.05)(見圖1E)。

飼喂胞外蛋白粗提物和胞內(nèi)多糖粗提物一段時(shí)間后，幼蝦FAS含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(見圖1F)，但飼喂隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組之間FAS含量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 芽孢桿菌蛋白和多糖粗提物對(duì)幼蝦肌肉中能量代謝相關(guān)酶活力的影響

胞外蛋白組的凡納濱對(duì)蝦在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期HK活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(見圖2A)。胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組PFK活力在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(見圖2B)，且胞外蛋白粗提物的效果更加顯著。與對(duì)照組相比，飼喂胞外蛋白粗提物和胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)PK活力無顯著影響(P>0.05)(見圖2C)，但在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期，胞外蛋白組顯著低于胞內(nèi)多糖組(P<0.05)。

飼喂2種不同粗提物對(duì)LDH活力均表現(xiàn)出顯著影響(P<0.05)(見圖2D)。其中，飼喂胞外蛋白粗提物后，凡納濱對(duì)蝦LDH活力顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。胞內(nèi)多糖組LDH活力在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)前期與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)，但隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

SDH活力在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期受到2種不同粗提物的顯著影響(P<0.05)(見圖2E)，在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期，胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組SDH活力均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)前期，飼喂胞外蛋白粗提物和胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)FAS含量無顯著影響(P>0.05)(見圖2F)，但隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期，胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組FAS含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中胞內(nèi)多糖組效果尤其顯著。

(同一時(shí)間點(diǎn)上不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。At each time point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

圖1 各組凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中己糖激酶(HK, A)、磷酸果糖激酶(PFK, B)、丙酮酸激酶(PK, C)、
乳酸脫氫酶(LDH, D)、琥珀酸脫氫酶(SDH, E)活性和脂肪酸合酶(FAS, F)含量的變化
Fig.1 Variations of hexokinase (HK, A), phosphofructokinase (PFK, B), pyruvate kinase (PK, C), lactate
dehydrogenase (LDH, D), and succinate dehydrogenase (SDH, E) activity and fatty acid
synthase (FAS, F) content in the hepatopancreas ofL.vannameiin different groups

2.4 芽孢桿菌蛋白和多糖粗提物對(duì)幼蝦腸道消化酶活力的影響

胞外蛋白組蛋白酶活力高于對(duì)照組，且在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)前期達(dá)到顯著水平(P<0.05)(見圖3A)。在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)的14和28 d，胞內(nèi)多糖組蛋白酶活力均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(見圖3A)。飼喂胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)淀粉酶活力無顯著影響(P>0.05)(見圖3B)。脂肪酶活力受胞外蛋白粗提物的顯著影響(P<0.05)(見圖3C)，胞外蛋白組脂肪酶活力低于對(duì)照組，且在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)前期達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.5 芽孢桿菌蛋白和多糖粗提物對(duì)幼蝦肝胰腺中ETS活力的影響

飼喂胞外蛋白與胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)ETS活力具有顯著影響(P<0.05)(見圖4)。胞外蛋白組與胞內(nèi)多糖組凡納濱對(duì)蝦ETS活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中胞外蛋白粗提物的作用尤為顯著。

2.6 WSSV感染階段對(duì)蝦累積死亡率

感染W(wǎng)SSV后，對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦累積死亡率高于胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組(見圖5)。對(duì)照組半致死時(shí)間LT50為42 h，胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組凡納濱對(duì)蝦半致死時(shí)間LT50分別為53和45 h，相較于對(duì)照組分別延長(zhǎng)了26.19%和7.14%。

3 討論

3.1 飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)幼蝦生長(zhǎng)的影響

芽孢桿菌是對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中常用的益生菌，同樣也是飼料中主要益生菌添加種類。唐楊等研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)可提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)速度[14]。但劉強(qiáng)強(qiáng)等將地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)添加至對(duì)蝦飼料中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的促進(jìn)作用不顯著[15]。此外，某些外源蛋白[16]和多糖[17]等飼料添加劑對(duì)對(duì)蝦生長(zhǎng)、存活等方面的提高作用也已被證實(shí)。然而，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白或胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)促進(jìn)幼蝦生長(zhǎng)及提高成活率的效果并不顯著。

(同一時(shí)間點(diǎn)上不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。At each time point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

圖2 各組凡納濱對(duì)蝦肌肉中己糖激酶(HK, A)、磷酸果糖激酶(PFK, B)、丙酮酸激酶(PK, C)、
乳酸脫氫酶(LDH, D)、琥珀酸脫氫酶(SDH, E)活性和脂肪酸合酶(FAS, F)含量的變化
Fig.2 Variations of hexokinase (HK, A), phosphofructokinase (PFK, B), pyruvate kinase (PK, C),
lactate dehydrogenase (LDH, D),and succinate dehydrogenase (SDH, E) activity and fatty acid synthase (FAS, F)
content in the muscle ofL.vannameiin different groups

3.2 飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)幼蝦能量代謝相關(guān)酶的影響

HK、PK、PFK作為糖酵解途徑3個(gè)關(guān)鍵的變構(gòu)調(diào)節(jié)酶，其活力可反映機(jī)體糖酵解途徑的水平[18]。該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，飼喂胞外蛋白粗提物一段時(shí)間后，肝胰腺中PFK活力有一定程度的提高，但在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期，胞外蛋白組肝胰腺及肌肉組織中糖酵解相關(guān)酶活力與對(duì)照組相比差異不顯著，甚至低于對(duì)照組。由以上結(jié)果推測(cè)飼喂胞外蛋白粗提物一定時(shí)間內(nèi)能夠刺激凡納濱對(duì)蝦幼蝦肝胰腺糖酵解能力的增強(qiáng)。但隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，肝胰腺糖酵解途徑水平減弱。而飼喂胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)肝胰腺和肌肉中HK、PK和PFK活力影響不顯著，表明胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)其糖酵解能力無顯著影響。

LDH是葡萄糖的無氧分解酶，其作用是將糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸在無氧條件下還原成乳酸[19]。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)前期，胞外蛋白和胞內(nèi)多糖組肝胰腺和肌肉中LDH活力均高于對(duì)照組，而到了養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期，與對(duì)照組之間無顯著差異甚至低于對(duì)照組。肌肉中LDH活性呈現(xiàn)出與肝胰腺中相似的變化規(guī)律，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期，胞外蛋白和胞內(nèi)多糖組幼蝦肌肉中LDH活力顯著低于對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胞外蛋白及胞內(nèi)多糖粗提物能夠在一定程度上加強(qiáng)幼蝦肝胰腺對(duì)糖類能源物質(zhì)的無氧代謝能力，但隨著飼喂時(shí)間延長(zhǎng)，效果逐漸不明顯，甚至?xí)p弱機(jī)體對(duì)糖類的無氧代謝能力。該結(jié)果與粗提物對(duì)糖酵解途徑的影響一致。

SDH是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，可為真核細(xì)胞和多種原核細(xì)胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子[20]，其活力可在一定程度上反映糖類有氧代謝的水平[21]。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼喂胞外蛋白及胞內(nèi)多糖粗提物能不同程度地提高凡納濱對(duì)蝦幼蝦機(jī)體SDH活力，相比較而言，胞外蛋白粗提物的效果更加明顯。SDH活力的提高表明飼喂胞外蛋白及胞內(nèi)多糖粗提物在一定程度上能提高糖類的有氧代謝水平，加快機(jī)體對(duì)糖類的轉(zhuǎn)化利用。

(同一時(shí)間點(diǎn)上不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。At each time point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

圖3 各組凡納濱對(duì)蝦腸道中蛋白酶(Trypsase, A)、
淀粉酶(AMS, B)、脂肪酶(LPS, C)活性的變化
Fig.3 Variations of intestinal protease (A), amylase (B), and
lipase (C) activity ofL.vannameiin different groups

FAS是一種多酶復(fù)合體，在機(jī)體脂類代謝過程中具有重要作用[22]。FAS的多寡、活力的高低一定程度上可以反映動(dòng)物機(jī)體脂質(zhì)代謝水平[23]。有研究表明，動(dòng)物機(jī)體FAS含量受到碳水化合物[24]、蛋白質(zhì)[25]及脂肪酸[26]種類及含量等因素的影響。本實(shí)驗(yàn)中，飼喂胞外蛋白及胞內(nèi)多糖粗提物一段時(shí)間后，幼蝦肝胰腺中FAS含量有所下降，肌肉中FAS含量無明顯變化。表明飼喂胞外蛋白及胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦脂類代謝水平具有一定的抑制作用，且主要作用于肝胰腺中。但隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，各組幼蝦肝胰腺中FAS含量無顯著差異，胞外蛋白組和胞內(nèi)多糖組肌肉中FAS含量顯著低于對(duì)照組，推測(cè)2種粗提物對(duì)脂類代謝的抑制作用逐漸轉(zhuǎn)移至肌肉組織中。其中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

(同一時(shí)間點(diǎn)上不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。At each time point, means with different letters are significantly different (P<0.05).)

圖4 各組凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中電子傳遞系統(tǒng)(ETS)活性的變化
Fig.4 Variations of ETS activity in the hepatopancreas
ofL.vannameiin different groups

圖5 感染W(wǎng)SSV后凡納濱對(duì)蝦的累積死亡率Fig. 5 Cumulative mortality rate of L. vannamei in different groups during the WSSV infection period

3.3 飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)幼蝦腸道消化酶的影響

動(dòng)物的消化器官對(duì)飼料的組成具有較強(qiáng)的敏感性，飼料的組成能調(diào)節(jié)消化酶活力，進(jìn)而對(duì)動(dòng)物的其它生理狀態(tài)造成影響[27]。Ziaei-Nejad等發(fā)現(xiàn)，在對(duì)蝦飼料中添加芽孢桿菌能夠提高對(duì)蝦腸道消化酶活力[28]。胡毅等也發(fā)現(xiàn)在飼料中添加益生菌能夠提高對(duì)蝦腸道蛋白酶和淀粉酶活力，并推測(cè)消化酶活力的提高可能會(huì)促進(jìn)對(duì)蝦的生長(zhǎng)[29]。該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)飼喂芽孢桿菌2種粗提物后，蛋白酶活力均顯著提高，表明2種粗提物均會(huì)增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦幼蝦腸道對(duì)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收。除此之外，還發(fā)現(xiàn)胞外蛋白組的脂肪酶活力顯著低于對(duì)照組，表明胞外蛋白粗提物降低了幼蝦對(duì)脂肪營(yíng)養(yǎng)的吸收利用，這可能與上述胞外蛋白組對(duì)蝦肝胰腺及肌肉組織中FAS含量的較低有一定關(guān)系。

3.4 飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)幼蝦肝胰腺ETS活力的影響

ETS可將電子從待氧化的底物逐級(jí)傳遞到分子氧，同時(shí)釋放能量，其活力可用以反應(yīng)機(jī)體的代謝水平[30]。該實(shí)驗(yàn)中，飼料中添加2種粗提物后可以有效提高幼蝦肝胰腺中的ETS活力，表明胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物能夠提高凡納濱對(duì)蝦幼蝦機(jī)體的整體代謝水平。結(jié)合上述機(jī)體能量代謝相關(guān)酶結(jié)果分析，糖類有氧代謝水平的提高可能是ETS活力增強(qiáng)的原因之一。

3.5 飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)幼蝦抗WSSV能力的影響

芽孢桿菌作為一類在對(duì)蝦養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用的益生菌，已有研究證明其中的某些菌株能夠提高對(duì)蝦抗WSSV能力[31]。此外，已有報(bào)道稱蛋白[32]、多糖[33]等功能性飼料添加劑能夠起到相似的作用。該實(shí)驗(yàn)所選取的芽孢桿菌BZ5株已在前期研究中證明了其能夠提高凡納濱對(duì)蝦抗WSSV能力[9, 34]。該實(shí)驗(yàn)再次證明了該芽孢桿菌的胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物能夠在一定程度延長(zhǎng)WSSV感染后的LT50。其中，胞外蛋白粗提物的作用尤其明顯。因此推測(cè)胞外蛋白和胞內(nèi)多糖可能是該菌株提高凡納濱對(duì)蝦抗WSSV能力的功能組分。

學(xué)者們通常是從提高機(jī)體免疫能力的角度解釋對(duì)蝦抗病能力提高的原因。然而，已有研究表明對(duì)蝦在提高機(jī)體免疫應(yīng)答水平的同時(shí)會(huì)大量消耗能量[35-36]，因此能量代謝水平與凡納濱對(duì)蝦抗病原感染能力密切相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)飼喂2種粗提物提高了幼蝦機(jī)體代謝水平，尤其是糖類的有氧代謝水平。幼蝦感染W(wǎng)SSV后，能源物質(zhì)能夠快速動(dòng)員以抵抗病原感染，因此可能是對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV后LT50延長(zhǎng)的原因之一。而且，胞外蛋白粗提物對(duì)糖類代謝水平的提高作用較胞內(nèi)多糖粗提物更加顯著，這可能是胞外蛋白組幼蝦LT50明顯長(zhǎng)于胞內(nèi)多糖組的原因。

此外，F(xiàn)AS在動(dòng)物抗菌及抗病毒免疫中的作用也逐漸被研究者證明。Yang等研究表明，WSSV會(huì)誘導(dǎo)對(duì)蝦FAS表達(dá)增加，改變宿主體內(nèi)的脂類代謝平衡，直接影響病毒組裝[37]。Hsieh等發(fā)現(xiàn)，在FAS抑制劑存在的條件下，WSSV病毒體的形成受損[38]。該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)飼喂胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物使幼蝦FAS含量下降，一定程度上可能會(huì)提高其抗WSSV感染死亡能力。

4 結(jié)語

在飼料中添加芽孢桿菌胞外蛋白和胞內(nèi)多糖粗提物對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦生長(zhǎng)無顯著性影響，但一定程度上影響了機(jī)體能量代謝水平和腸道消化酶活力。其對(duì)幼蝦能量代謝的影響具體表現(xiàn)在提高了糖類的有氧代謝水平，抑制了脂類代謝水平。2種粗提物對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼蝦抗WSSV能力均有不同程度的提高，通過結(jié)果分析，推測(cè)這種抗病能力的提高與其對(duì)蝦的能量代謝水平的影響密切相關(guān)。