楊 燕,楊再華,楊茂發(fā)

(1.貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550018；2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550001；3.貴州大學(xué)昆蟲(chóng)研究所/貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

云南木蠹象(Pissodesyunnanensis)屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)木蠹象屬(Pissodes)，是貴州、云南、四川的云南松林區(qū)的重要蛀干蛀梢害蟲(chóng)，其生活史重疊，幾乎在每個(gè)時(shí)期都有不同的蟲(chóng)態(tài)，各地采用人工清理結(jié)合化學(xué)、生物藥劑防治該蟲(chóng)，防治效果各異[1-4].云南木蠹象在貴州省威寧縣危害較重，內(nèi)吸劑防治幼蟲(chóng)和蛹效果不佳，且成蟲(chóng)具有假死性，一有風(fēng)吹草動(dòng)即落入枯枝落葉層中，藥劑很難噴到成蟲(chóng)體上，所以目前當(dāng)?shù)蒯槍?duì)云南木蠹象的防治仍以燒毀被害枝梢為主，此方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)工、費(fèi)錢(qián)，同時(shí)不利于水土保持和森林生態(tài).因此，探索有效、安全、經(jīng)濟(jì)的防治新方法和新技術(shù)是目前亟待解決的問(wèn)題.

信息化合物在害蟲(chóng)治理中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，其在天敵搜尋寄主的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，該類(lèi)化合物來(lái)源于寄主本身及其分泌物、與寄主相關(guān)的有機(jī)體或寄主取食的植物等[5-7].例如：白背飛虱(Sogatellafurcifera)的雌、雄成蟲(chóng)和卵的利它素能激發(fā)寄生蜂稻虱纓小蜂(Anagrusnilaparvatae)的觸覺(jué)搜索行為[8]；稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocismedinalis)和二化螟(Chilosuppressalis)幼蟲(chóng)的揮發(fā)物質(zhì)對(duì)螟蛉絨繭蜂(Cotesiaruficrus)有引誘作用[9].筆者在飼養(yǎng)從野外采集的云南木蠹象幼蟲(chóng)和蛹時(shí)曾發(fā)現(xiàn)5種天敵寄生蜂和1種捕食性天敵[10]，這為利用信息化合物防治云南木蠹象成為可能.目前，有關(guān)云南木蠹象幼蟲(chóng)和蛹的揮發(fā)物成分尚未見(jiàn)報(bào)道，成蟲(chóng)揮發(fā)物僅在王斌[11]對(duì)帶蟲(chóng)枝條揮發(fā)物的研究中有所提及.固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)技術(shù)與氣相色譜質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用儀聯(lián)用，已成為研究信息化學(xué)物質(zhì)的重要手段[12].本試驗(yàn)利用該技術(shù)對(duì)云南木蠹象幼蟲(chóng)、蛹、雌成蟲(chóng)和雄成蟲(chóng)蟲(chóng)體的信息化合物進(jìn)行萃取、分離和鑒定，以期為利用化學(xué)生態(tài)方法防治云南木蠹象提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

采集地為貴州省威寧縣秀水鄉(xiāng)華豐村(N26.85°、E103.91°)云南松林區(qū)，海拔2 430 m.將采集的成蟲(chóng)裝入指形管，管口塞上棉花塞，并采集帶有幼蟲(chóng)、蛹的受害云南松枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室.成蟲(chóng)飼喂健康云南松枝條，帶有幼蟲(chóng)、蛹的受害云南松枝條切口封蠟，都置于恒溫(25±1) ℃、相對(duì)濕度70%±5%、光照周期(L∶D)14 h∶10 h的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng).挑選未受損的幼蟲(chóng)、蛹、雌成蟲(chóng)和雄成蟲(chóng)供試.

1.2 儀器

美國(guó)安捷倫公司HP6890/5975CGC-MS聯(lián)用儀，手動(dòng)固相微萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)，100 μm PDMS萃取頭，樣品瓶,計(jì)時(shí)器.

1.3 固相微萃取

分別取云南木蠹象幼蟲(chóng)20頭、蛹7頭、雌成蟲(chóng)和雄成蟲(chóng)各3頭，對(duì)各蟲(chóng)態(tài)的蟲(chóng)體揮發(fā)物進(jìn)行固相微萃取[13-14].將測(cè)試蟲(chóng)體放入50 mL樣品瓶中，在室溫(25±1) ℃下保持30 min，使樣品瓶?jī)?nèi)樣品與頂空中的揮發(fā)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，將裝有100 μm PDMS纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器針頭插入樣品瓶，固定好固相微萃取裝置的手柄，推出萃取纖維頭，頂空萃取45 min(幼蟲(chóng)和雌、雄成蟲(chóng)均在室溫條件下萃取，蛹在30 ℃的平板加熱條件下萃取)，快速移出萃取頭并插入GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)行GC-MS測(cè)試，250 ℃熱解析5 min.

1.4 GC-MS分析條件

GC條件：色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫45 ℃，保留2 min，以5 ℃·min-1升溫至250 ℃，保留2 min；運(yùn)行時(shí)間45 min；柱前壓5.07×104Pa，載氣流量1.0 mL·min-1；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；分流比20∶1，分流進(jìn)樣，溶劑延遲0.5 min.

MS條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；四極桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；倍增器電壓1 200 V；質(zhì)量范圍20～450 u.

經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)對(duì)總離子流圖中的各峰檢索及Nist 14、Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖核對(duì)進(jìn)行定性，用峰面積歸一化法測(cè)定各化學(xué)成分的相對(duì)含量[15].

2 結(jié)果與分析

2.1 云南木蠹象蟲(chóng)體揮發(fā)物成分分析

云南木蠹象各蟲(chóng)態(tài)氣味揮發(fā)性成分總離子流圖見(jiàn)圖1. GC-MS分離、鑒定出的各蟲(chóng)態(tài)揮發(fā)性成分及相對(duì)含量見(jiàn)表1.

由表1可知，云南木蠹象蟲(chóng)體主要揮發(fā)性化合物總共23種，包括8種醇類(lèi)、5種單萜、5種倍半萜、2種烷烴、2種酮類(lèi)和1種酯類(lèi).不同發(fā)育階段蟲(chóng)體的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)差異明顯.幼蟲(chóng)含有的揮發(fā)物成分較多，達(dá)21種，包括5種倍半萜、4種單萜、7種醇類(lèi)、1種酯類(lèi)、2種酮類(lèi)、2種烷烴物質(zhì)，占總峰面積的96.16%；蛹鑒定出12種成分，包括5種單萜、4種倍半萜、1種酯類(lèi)、2種醇類(lèi)，占總峰面積的97.09%；雌成蟲(chóng)鑒定出8種成分，包括3種倍半萜、2種單萜、1種酯類(lèi)、2種醇類(lèi)，占總峰面積的87.63%；雄成蟲(chóng)含有的揮發(fā)物成分較少，僅5種，包括1種醇類(lèi)、2種倍半萜、1種單萜、1種酯類(lèi)，占總峰面積的64.84%.其中，幼蟲(chóng)揮發(fā)物組分中相對(duì)含量最大的是反式-石竹烯，達(dá)28.68%，α-蒎烯(17.03%)次之；蛹揮發(fā)物組分中相對(duì)含量最大的是α-蒎烯，達(dá)41.95%，乙酸龍腦酯(14.8%)次之；雌成蟲(chóng)揮發(fā)物組分中相對(duì)含量最大的是反式-石竹烯，為24.71%，α-蒎烯(23.4%)和乙酸龍腦酯(15.6%)次之；雄成蟲(chóng)揮發(fā)物組分中相對(duì)含量最大的是桃金娘烯醇，為22.61%，反式-石竹烯(12.69%)和α-蒎烯(15.41%)次之.

A.幼蟲(chóng)；B.蛹；C雌成蟲(chóng)；D.雄成蟲(chóng).豐度是指在選定的質(zhì)量范圍內(nèi)，離子(信號(hào))強(qiáng)度的總和.圖1 云南木蠹象揮發(fā)物總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatiles from P.yunnanensis

幼蟲(chóng)、蛹、雌成蟲(chóng)和雄成蟲(chóng)揮發(fā)物中都檢測(cè)到α-蒎烯、乙酸龍腦酯、刺伯烯、反式-石竹烯這4種成分.其中，α-蒎烯在蛹體揮發(fā)物組分中相對(duì)含量最高，乙酸龍腦酯在雌成蟲(chóng)揮發(fā)物組分中相對(duì)含量最高，而刺伯烯和反式-石竹烯則在幼蟲(chóng)揮發(fā)物組分中相對(duì)含量最高.對(duì)傘花烴、順式-馬鞭草烯醇、反式-馬鞭草烯醇、龍腦、4-松油醇、α-松油醇、馬鞭草烯酮、十四烷、香葉基丙酮、δ-蓽澄茄烯這10種成分僅在幼蟲(chóng)揮發(fā)物中被檢測(cè)到，β-月桂烯和芳樟醇這2種成分僅存在于蛹體揮發(fā)物中.各蟲(chóng)態(tài)揮發(fā)物組分中都含有萜烯類(lèi)、酯類(lèi)和醇類(lèi)物質(zhì)：萜烯類(lèi)種類(lèi)最多，且其在幼蟲(chóng)、蛹、雌成蟲(chóng)、雄成蟲(chóng)中的相對(duì)含量都較高，分別為73.33%、75.86%、59.58%、35.74%；醇類(lèi)化合物種類(lèi)在幼蟲(chóng)中最多，共檢測(cè)出7種(表1).

在幼蟲(chóng)揮發(fā)物中，有8種化合物相對(duì)含量低于1%，分別為對(duì)傘花烴、1,8-桉葉素、4-松油醇、α-松油醇、馬鞭草烯酮、十四烷、香葉基丙酮、δ-蓽澄茄烯；在蛹體揮發(fā)物中有2種化合物相對(duì)含量低于1%，分別為β-月桂烯和芳樟醇.其中，1，8-桉葉素在幼蟲(chóng)、蛹和雌成蟲(chóng)揮發(fā)物中都被檢測(cè)到，但其在幼蟲(chóng)中的相對(duì)含量(0.75%)比在蛹(5.93%)和雌成蟲(chóng)(5.85%)中的相對(duì)含量都低.昆蟲(chóng)所處的環(huán)境是復(fù)雜的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，微量成分含量變化的原因值得關(guān)注.

2.2 云南木蠹象蟲(chóng)體揮發(fā)物中所含寄主植物成分分析

將云南木蠹象蟲(chóng)體含有的23種氣味化合物與已報(bào)道的固相微萃取方法分離、鑒定出的健康云南松松針、松皮、韌皮部、木質(zhì)部揮發(fā)物[10]相比較，發(fā)現(xiàn)有13種成分相同，包括1種烷烴、1種酯類(lèi)、3種醇類(lèi)、8種單萜和倍半萜，且這13種成分中有12種在受害云南松松針和松皮中也被檢測(cè)到，僅檸檬烯在受害云南松松針和松皮中未被發(fā)現(xiàn)[10](表2).

表1 云南木蠹象不同蟲(chóng)態(tài)氣味揮發(fā)物1)Table 1 Volatiles from different stage of P.yunnanensis

表2 云南木蠹象蟲(chóng)體揮發(fā)物與其寄主植物揮發(fā)物比較1)Table 2 Comparison between the identical components from the volatile compounds of P.yunnanesis and the host-plant Pinus yunnanensis

由表2看出，云南木蠹象幼蟲(chóng)揮發(fā)物與健康松皮、韌皮部和木質(zhì)部揮發(fā)物相比，1種酯類(lèi)物質(zhì)(乙酸龍腦酯)和1種烷烴類(lèi)物質(zhì)(對(duì)傘花烴)均相同，相同的萜烯類(lèi)物質(zhì)分別有6(α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、刺伯烯、α-葎草烯、δ-蓽澄茄烯)、5(α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、刺伯烯、α-葎草烯)和4種(α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、α-葎草烯).末齡幼蟲(chóng)在云南松枝干木質(zhì)部及髓心化蛹，蛹體揮發(fā)物與健康木質(zhì)部有6種成分相同，為α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、β-月桂烯、乙酸龍腦酯、α-葎草烯.成蟲(chóng)取食韌皮部汁液，與健康韌皮部揮發(fā)物相比，雌成蟲(chóng)揮發(fā)物有5種成分相同，為α-蒎烯、莰烯、乙酸龍腦酯、刺伯烯、α-葎草烯；雄成蟲(chóng)揮發(fā)物有3種成分與之相同，為α-蒎烯、乙酸龍腦酯、刺伯烯.此外，乙酸龍腦酯和α-葎草烯在云南松揮發(fā)性成分中的相對(duì)含量(不超過(guò)1.5%和0.5%[10])比在云南木蠹象蟲(chóng)體揮發(fā)物中的相對(duì)含量(大于2.0%)低.

云南木蠹象蟲(chóng)體中部分揮發(fā)物組分可能是該蟲(chóng)從寄主植物云南松中攝取或通過(guò)化合物轉(zhuǎn)化而累積.將本試驗(yàn)中檢測(cè)到的23種氣味化合物與其他方法[16-23]鑒定出的云南松揮發(fā)性成分相比，蟲(chóng)體上檢測(cè)到的反式-石竹烯、順式-馬鞭草烯醇、反式-馬鞭草烯醇、十四烷、香葉基丙酮5種成分在云南松中未被檢測(cè)到.桃金娘烯醇在松皮上被檢測(cè)出[22]，但其相對(duì)含量(0.7%)比在云南木蠹象蟲(chóng)體中的相對(duì)含量低.

3 討論

信息化合物在自然生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)昆蟲(chóng)的行為調(diào)控發(fā)揮著重要作用，植食性昆蟲(chóng)的揮發(fā)物是天敵尋找寄主的潛在化學(xué)信息，通過(guò)它天敵可探知寄主位置、類(lèi)別以及是否寄生，這些信息化合物包括萜烯、醇、醛、酯、烷烴、含硫及雜環(huán)芳香族化合物等[24-27].本試驗(yàn)利用固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)，測(cè)得云南木蠹象各蟲(chóng)態(tài)揮發(fā)性組分，包括萜烯類(lèi)、醇、酯、烷類(lèi)和酮等，其中，萜烯類(lèi)是種類(lèi)最多的化合物，且其在各蟲(chóng)態(tài)中的相對(duì)含量都較高.

地中海粉螟(Anagastrakuehniella)上顎分泌的酮類(lèi)物質(zhì)能刺激天敵寄生蜂倉(cāng)蛾姬蜂(Venturiacanescens)產(chǎn)卵[28]；稻虱纓小蜂對(duì)香葉基丙酮(0.1 mg·L-1)有顯著的趨向反應(yīng)[29]；α-松油醇能引誘假眼小綠葉蟬(Empoaseavitis)卵期的寄生蜂[30]；二化螟盤(pán)絨繭蜂(Cotesiachilonis)對(duì)特定濃度的芳樟醇和β-石竹烯有顯著偏好[31]；橘小實(shí)蠅(Bactroceradorsalis)的3種寄生蜂對(duì)10 μg·μL-1芳樟醇、檸檬烯、石竹烯能產(chǎn)生觸角電位反應(yīng)[32]；芳樟醇對(duì)天敵寄生蜂薜荔榕小蜂(Blastophagapumilae)有吸引作用[33].在云南木蠹象蟲(chóng)體揮發(fā)物中也檢測(cè)到酮類(lèi)物質(zhì)(香葉基丙酮)、α-松油醇、石竹烯、檸檬烯、芳樟醇等成分，其可能與天敵近距離定位云南木蠹象有關(guān).

王斌[11]將帶有云南木蠹象的松枝揮發(fā)物成分與健康云南松枝條的成分對(duì)比，得到16種云南木蠹象成蟲(chóng)揮發(fā)物組分,但僅雌成蟲(chóng)上發(fā)現(xiàn)的桃金娘烯醇與本研究相同，本研究幼蟲(chóng)、雌成蟲(chóng)和雄成蟲(chóng)上都檢測(cè)到該成分.王超英等[34]鑒定出云南木蠹象雌蟲(chóng)胸部43種、腹部37種和雄蟲(chóng)胸部20種、腹部15種化合物，其中僅α-蒎烯、莰烯和1，8-桉葉素與本研究相同.供試?yán)ハx(chóng)的處理方法及揮發(fā)物的提取方法不同，檢測(cè)的結(jié)果就會(huì)有差異.固相微萃取采用的每種萃取纖維所能吸附的成分有限，還需結(jié)合其他提取方法才能得到更加完善的昆蟲(chóng)揮發(fā)物組分.

本研究共鑒定出23種云南木蠹象蟲(chóng)體揮發(fā)性成分，但這些揮發(fā)性成分是否會(huì)影響該蟲(chóng)天敵的寄主定位和選擇行為，仍需要通過(guò)電生理和行為學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證.