張小雪,巫偉峰,傅振星,羅水鑫,吳少云,陳發(fā)興

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院亞熱帶果樹(shù)研究所，福建 福州 350002；2.中國(guó)科學(xué)院廬山植物園，江西 九江 332900；3.福建省農(nóng)資集團(tuán)公司，福建 福州 350001；4.連城縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建 連城 366200；5.連城縣四堡鎮(zhèn)人民政府農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，福建 連城 366205)

李是薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)多年生落葉樹(shù)種，是世界重要的核果類果樹(shù)[1].福建省是我國(guó)李的主要產(chǎn)區(qū)，其中，‘芙蓉李’(PrunussalicinaLindl.)原產(chǎn)于福建省永泰縣，是福建省主栽李品種，已有700多年的種植歷史[2]，因果實(shí)具有誘人的色澤、美味的口感、較高的營(yíng)養(yǎng)成分而深受消費(fèi)者喜愛(ài)[3].李焦葉癥是近年福建省發(fā)生的一種具有較大威脅的李樹(shù)病害，于2013年首次發(fā)現(xiàn)在福建省連城縣四堡鎮(zhèn)，因發(fā)病時(shí)葉緣呈燒焦?fàn)?，?yán)重時(shí)全樹(shù)葉片干枯，呈暗褐色，極似被火燒過(guò)，故當(dāng)?shù)毓r(nóng)稱之為“火燒葉”.該病蔓延、發(fā)展較快，在四堡鎮(zhèn)大部分果園均有不同程度的發(fā)生，導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收，對(duì)當(dāng)?shù)毓r(nóng)增產(chǎn)創(chuàng)收極為不利，也是我國(guó)李產(chǎn)業(yè)健康、良性發(fā)展的潛在威脅.關(guān)于焦葉癥與土壤肥力指標(biāo)的相關(guān)性，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道較少，研究李焦葉癥與礦質(zhì)元素含量間的關(guān)系對(duì)于通過(guò)礦質(zhì)元素的補(bǔ)給與控制來(lái)協(xié)同防控焦葉癥有重要意義.為了探究焦葉癥的發(fā)病根源，前人曾進(jìn)行一些探索.張計(jì)峰等[4]研究顯示，高溫，葉片Na+、Cl-的富集，土壤Cl-含量偏高導(dǎo)致了核桃焦葉病的發(fā)生；柏超等[5]研究表明，銀杏焦葉癥屬生理性病害，由根部吸收和供給不足引起；陳偉[6]研究表明，皺葉菊苣焦葉癥屬于生理性病害，通過(guò)分析其與葉片重酚類物質(zhì)含量、苯丙氨酸解氨酶活力、多酚氧化酶活力的關(guān)系表明，酶促褐變是導(dǎo)致焦葉癥的主要內(nèi)因；高瑞霞[7]研究表明，相對(duì)濕度是引起核桃焦葉癥的主要原因，相對(duì)濕度越大，焦葉癥發(fā)病越輕，焦葉癥的發(fā)生可能還與光照強(qiáng)度、氣溫、土壤含水量、土壤鹽堿度、灌溉用水含鹽量、土壤養(yǎng)分等有關(guān).此外，葉片的失綠、焦枯還與礦質(zhì)元素的缺失或過(guò)剩有關(guān)[8].近年來(lái)在李的病害防治方面開(kāi)展了大量的研究工作，大多集中在細(xì)菌及真菌的防治上[9-11]，而關(guān)于由礦質(zhì)元素的缺失或不平衡引起的生理病害報(bào)道較少.目前，‘芙蓉李’焦葉癥仍未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，其是否與礦質(zhì)元素有關(guān)尚不清楚.因此，本研究采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma massspectrometry,ICP-MS)法對(duì)來(lái)自正常李樹(shù)葉片及其土壤、患病李樹(shù)葉片及其土壤的礦質(zhì)元素進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)熱圖、聚類分析、t檢驗(yàn)、主成分分析等方法分析了‘芙蓉李’焦葉癥與礦質(zhì)元素含量的關(guān)系，旨在為解析‘芙蓉李’焦葉癥的發(fā)病原因提供參考依據(jù)，以盡早提出合理的防治措施.

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

供試材料‘芙蓉李’來(lái)源于福建省連城縣四堡鎮(zhèn).果園年平均氣溫17.8 ℃，年降雨量1 800～2 000 mm，年日照1 900 h，無(wú)霜期250 d，最高氣溫35.5 ℃.果園均為標(biāo)準(zhǔn)化栽培管理.1號(hào)果園(東經(jīng)116°42′30″，北緯25°50′51″)為平地水稻田改造的果園，海拔514 m，其果園發(fā)病率達(dá)34.8%；2號(hào)果園(東經(jīng)116°42′33″，北緯25°51′36″)為山地黃壤果園，海拔482 m，其果園發(fā)病率為32.1%.參照棉花枯黃萎病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[12]，依據(jù)李葉片的焦枯程度，將正常樹(shù)(葉片發(fā)病率低于5%)、病樹(shù)(葉片發(fā)病率超過(guò)20%，發(fā)病葉面呈褐色焦枯狀)的果園樣本進(jìn)行礦質(zhì)元素含量對(duì)比分析.

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 土壤取樣時(shí)，在兩果園均按“S”型選取正常樹(shù)、病樹(shù)各5株，在樹(shù)冠滴水線下挖一個(gè)深40 cm的土壤剖面，在剖面上均勻采集深度為0～25、25～40 cm土層的土壤各250 g.土樣帶回實(shí)驗(yàn)室自然陰干后過(guò)篩，分裝，送檢測(cè)定.在采集土壤樣品的20株李樹(shù)中部，隨機(jī)選擇外圍枝葉于東西南北4個(gè)方位上，各采2片葉，每株8片葉；正常樹(shù)、患病樹(shù)每1株作為一個(gè)重復(fù)，設(shè)5個(gè)重復(fù).將所有葉片樣品裝入有孔的干凈塑料袋中，當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，洗凈后，切取中部葉，用真空冷凍干燥機(jī)凍干保存待測(cè).

1.2.2 樣品處理及ICP-MS檢測(cè) 樣品處理及ICP-MS檢測(cè)參照文獻(xiàn)[13]的方法.取0.500 0 g樣品干樣于聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL濃硝酸，輕輕晃動(dòng)消解罐，使樣品完全浸沒(méi)，在設(shè)定的條件下進(jìn)行微波消解.微波消解完成后，自然冷卻.開(kāi)蓋后，將消解液移至25 mL容量瓶中，并用去離子水少量多次洗滌消解罐內(nèi)壁，合并洗滌液于25 mL容量瓶中，定容；同時(shí)作空白對(duì)照.元素含量的測(cè)定是將混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、樣液進(jìn)行ICP-MS測(cè)定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，加入混合內(nèi)標(biāo)校正基體干擾、儀器信號(hào)的漂移.

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 使用Orgin 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及主成分分析.利用R語(yǔ)言pheatmap包進(jìn)行熱圖及聚類分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘芙蓉李’焦葉癥的發(fā)病癥狀

圖1顯示：‘芙蓉李’患病3～6 d時(shí)，葉尖呈水漬燙傷狀；患病6～10 d時(shí)，癥狀沿葉緣蔓延，隨后，葉尖、葉緣都呈焦枯狀，葉片正背面均無(wú)黑粉、白粉、銹狀物、霉?fàn)钗锏染x(chóng)病征；重癥期間，全株葉片幾乎干枯，無(wú)色澤，呈暗褐色如被火烤過(guò)一般.患病影響了葉片正常的光合作用，導(dǎo)致當(dāng)年果實(shí)減產(chǎn)、品質(zhì)下降，同時(shí)樹(shù)勢(shì)亦出現(xiàn)明顯弱化，影響翌年生長(zhǎng).發(fā)病在每年的5月份前后，嚴(yán)重的病株在感病2～3年后枯死.該病有易蔓延、發(fā)展較快、階段式發(fā)展(病癥先局部發(fā)生，后逐步發(fā)展至整株)的特點(diǎn)，同一葉片可二次感病.患病葉隨著發(fā)病天數(shù)的增加病癥加重.

A：正常葉片；B：患病3～6 d；C：患病6～10 d；D：重癥期.圖1 ‘芙蓉李’焦葉癥的主要形態(tài)特征Fig.1 Main symptoms of ‘Furongli’ plum scorched leaves

2.2 ‘芙蓉李’正常葉片的礦質(zhì)元素含量

根據(jù)‘芙蓉李’正常葉礦質(zhì)元素含量平均值的大小可將檢測(cè)的29種礦質(zhì)元素分為極微量元素(含量小于或等于100 μg·kg-1)、微量元素(含量大于100 μg·kg-1，小于或等于1 000 μg·kg-1)、中量元素(含量大于1 000 μg·kg-1，小于或等于10 000 μg·kg-1)、大量元素(含量大于10 000 μg·kg-1).結(jié)果(表1)顯示，正常葉片中的極微量元素有Sb、Hg、Ag、Li、Be、Cd、Mo、V、Tl，微量元素有Co、Sn、As、Se、Ni、Cr，中量元素有Pb、Cu、Ti，大量元素有K、Ca、B、Zn、Sr、Ba、Al、Na、Fe、Mn、Mg.來(lái)自不同果園‘芙蓉李’正常葉片的礦質(zhì)元素含量存在一定的差異，Be含量的變異系數(shù)最大，達(dá)68.28%；Ni、Se、Pb含量的變異系數(shù)也大于40%；而Cr、Ca含量最穩(wěn)定，變異系數(shù)分別為0.52%、0.53%；此外，Mg、K、Sb含量也較穩(wěn)定，變異系數(shù)小于1%.

2.3 ‘芙蓉李’患病葉與正常葉的礦質(zhì)元素含量比較

聚類分析(圖2a)顯示，‘芙蓉李’患病葉、正常葉分別單獨(dú)成組，說(shuō)明患病葉與正常葉的礦質(zhì)元素含量具有明顯差異.患病葉的Na、Mo、K、Cr、Al、Fe、Cd 7種元素含量高于正常葉，Ca、As、Hg、Mg、Tl、Sr、Ba 7種元素含量低于正常葉.t檢驗(yàn)(圖3)顯示，正常組與患病組達(dá)到極顯著差異(P<0.01)的元素有Ca、Cr，達(dá)到顯著差異的元素有Mg、K、Mo(P<0.05).

2.4 ‘芙蓉李’患病土壤與正常土壤的礦質(zhì)元素含量比較

聚類分析(圖2b)顯示，來(lái)自同一果園的土樣聚在一起，說(shuō)明不同果園土壤元素含量的差異大于患病引起的差異.對(duì)比患病李樹(shù)土壤、正常李樹(shù)土壤的元素含量發(fā)現(xiàn)，患病李樹(shù)土壤的Ti、Ca、Hg 3種元素含量高于正常李樹(shù)土壤，Mg含量低于正常李樹(shù)土壤，但t檢驗(yàn)顯示均未達(dá)到顯著差異.

表1 ‘芙蓉李’正常葉礦質(zhì)元素的含量Table 1 Mineral element contents in normal leaves of ‘Furongli’ plum

a:葉片樣品;b：土壤樣品.圖2 ‘芙蓉李’葉片、土壤中不同礦質(zhì)元素含量的熱圖與聚類分析Fig.2 Heatmap and cluster analysis of mineral elements in leaves and soils of ‘Furongli’plum

2.5 ‘芙蓉李’葉片、土壤中不同礦質(zhì)元素含量的主成分分析

葉片中礦質(zhì)元素含量的主成分分析(圖4a)顯示，主成分1、主成分2分別代表了44.87%、37.18%的信息量，兩者組成的二維分布圖可代表82.05%的信息量.主成分1可將患病組與正常組區(qū)分開(kāi)，主成分2可將1號(hào)果園葉樣與2號(hào)果園葉樣區(qū)分開(kāi)，說(shuō)明主成分1包含了較多患病組、正常組的差異信息.根據(jù)向量在主成分坐標(biāo)軸的載荷量可知，Mo、Cr、K、Ca、Mg 5種元素含量在主成分1坐標(biāo)軸上有較大載荷，其中，Mo、Cr含量與K含量呈正相關(guān)，Mg含量與Ca含量呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明這5種元素可能與李樹(shù)患焦葉癥有關(guān).

土壤中礦質(zhì)元素含量的主成分分析(圖4b)顯示，主成分1、主成分2分別代表了69.76%、22.83%的信息量，二維主成分分布圖可代表92.60%的信息量.主成分1可將不同果園土壤區(qū)分開(kāi)，但兩個(gè)維度均未能有效區(qū)分正常組與患病組，與聚類分析結(jié)果一致.

*表示差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，**表示差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01).圖3 ‘芙蓉李’正常葉片與患病葉片元素含量的比較Fig.3 Comparative analysis of mineral element contents in normal and infected leaves of ‘Furongli’plum

3 討論與結(jié)論

已有研究表明，焦葉癥是一種生理性病害[4-7,14-17]，且該病的發(fā)生與高溫、干旱、鹽害、礦質(zhì)元素含量、相對(duì)濕度有關(guān).蒯傳化等[17]研究顯示，當(dāng)‘紅地球’葡萄果際溫度達(dá)到42.0～42.8 ℃時(shí)發(fā)生日灼.本研究中‘芙蓉李’焦葉癥發(fā)病地的年平均氣溫17.8 ℃，最高氣溫35.5 ℃，該氣溫條件下發(fā)生日灼的可能性極低，因此排除氣溫引發(fā)當(dāng)?shù)亍饺乩睢谷~癥發(fā)病的可能.高瑞霞[7]的研究也表明，溫度對(duì)核桃焦葉癥的影響不顯著，而鹽堿度高的果園，其焦葉癥發(fā)生較重.本研究結(jié)果顯示，‘芙蓉李’患病葉含有較高含量的Na，可能由土壤含鹽量過(guò)高導(dǎo)致，表明土壤的高鹽堿度也可能是‘芙蓉李’焦葉癥的發(fā)病原因之一，但由于正常葉也含有較高含量的Na，表明其不是主要原因.聚類分析、主成分分析均表明，‘芙蓉李’患病葉與正常葉的礦質(zhì)元素含量有明顯差別，其中，患病葉與正常葉的Ca、Cr含量達(dá)到極顯著差異，Mg、K、Mo含量也達(dá)到顯著差異.以上說(shuō)明，高溫、鹽害等因素并不是導(dǎo)致‘芙蓉李’焦葉癥的直接原因，可能與礦質(zhì)元素含量間的平衡關(guān)系更相關(guān)，這需要進(jìn)行一步驗(yàn)證.

a:葉片樣品;b:土壤樣品.圖4 ‘芙蓉李’葉片、土壤中礦質(zhì)元素含量主成分分析的二維分布圖Fig.4 Two dimensional distribution of principal component analysis of mineral element contents in leaves and soil of ‘Furongli’plum

本研究結(jié)果顯示，Mo、Cr、K、Ca、Mg 5種元素含量與患病關(guān)聯(lián)最大，其中，Mo、Cr、K含量與患病呈正相關(guān)，Mg、Ca含量與患病呈負(fù)相關(guān).Mg是葉綠素的組成成分之一，缺Mg會(huì)阻礙葉綠素的合成，使葉片失綠變黃，嚴(yán)重時(shí)形成褐斑壞死[8].Ca具有維持離子平衡、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、膜功能的重要作用[18-19]，是細(xì)胞分裂和增長(zhǎng)所必需的.核桃呈焦葉癥時(shí)，葉片中的Na+、Cl-顯著富集，而Ca含量急劇減少[4]，這一表現(xiàn)與‘芙蓉李’癥狀相近.另外，近年來(lái)化肥的大量使用，土壤中的有機(jī)質(zhì)含量、有益菌群不斷減少，加之Ca是難移動(dòng)元素，土壤供給遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足樹(shù)體的需要.以上說(shuō)明，患病葉中的Mg、Ca含量均顯著低于正常葉可能是造成‘芙蓉李’焦葉癥的原因之一.作物極易吸收過(guò)量的Mo，其過(guò)剩會(huì)使作物葉片出現(xiàn)白色不規(guī)則斑點(diǎn)，并凋萎落葉[20].Cr過(guò)剩導(dǎo)致魔芋除葉脈外的葉色變淡黃色，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)明顯的白色斑紋或白云狀缺綠[20].但本研究未見(jiàn)患病葉出現(xiàn)Mo、Cr過(guò)剩引起的白色斑點(diǎn)或斑紋.葉片中的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)直接來(lái)源于土壤[21].高瑞霞[7]通過(guò)研究土壤養(yǎng)分、鹽分與焦葉癥病情指數(shù)之間的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)：速效K、有機(jī)質(zhì)的含量與病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，速效K、有機(jī)質(zhì)的含量越高，病情指數(shù)越低；土壤鹽分與病情指數(shù)呈正相關(guān)，土壤中的鹽分含量越高，焦葉癥越嚴(yán)重.由此可見(jiàn)，土壤中的礦質(zhì)元素含量是焦葉癥的重要成因之一.但從土壤礦質(zhì)元素含量的分析結(jié)果來(lái)看，來(lái)自不同取樣果園的土壤具有明顯的礦質(zhì)元素特征，導(dǎo)致聚類分析、主成分分析均無(wú)法區(qū)分正常組、患病組的土壤，但這并未說(shuō)明焦葉癥的發(fā)生與土壤無(wú)關(guān)，因?yàn)槿~片的礦質(zhì)元素來(lái)源于根系對(duì)土壤礦質(zhì)元素的吸收.

綜合本研究結(jié)果及前人報(bào)道表明，‘芙蓉李’焦葉癥屬于礦質(zhì)元素間的不平衡所導(dǎo)致的生理性病害.盡管焦葉癥在核桃、板栗、獼猴桃等植物上做了一定的基礎(chǔ)研究，但目前其病因仍不清晰，李葉片焦枯作為一種新型生理疾病，研究基礎(chǔ)更為薄弱.本研究探討了李焦葉癥與目前報(bào)道的29種礦質(zhì)元素含量的關(guān)系，結(jié)果初步表明，李焦葉癥與葉片中的Ca、Mg含量關(guān)系密切，葉片缺Ca、Mg加大了焦葉癥發(fā)病的可能性，礦質(zhì)元素失調(diào)導(dǎo)致的生理性缺Ca、Mg是病害發(fā)生的主要原因，這一結(jié)論為焦葉癥的預(yù)防提供了實(shí)踐指導(dǎo).