沈 濤,徐遠志,彭 前,周 蓉,劉海霞,祁勝財,從少華
(1.南京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京210029;2.昆山市第一人民醫(yī)院口腔科,江蘇 昆山 215300;3.同濟大學(xué)附屬上海市第十人民醫(yī)院口腔科,上海 200011;4.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院口腔科,上海 200011)
牙周炎屬于口腔科臨床較為常見的疾病,主要是由口腔致病微生物導(dǎo)致的以牙周組織損害為主要表現(xiàn)的感染性疾病。厭氧菌為該病主要致病微生物之一,若不予以及時有效的治療,隨著病情的不斷進展可能促進牙周袋形成、牙槽骨吸收甚至牙齒松動,病情嚴重患者甚至可能出現(xiàn)牙齒脫落,對患者的身心健康均造成不利影響[1-2]。由此可見,有效控制牙周致病菌,恢復(fù)口腔正常菌群生態(tài)環(huán)境是治療牙周炎的關(guān)鍵所在。目前認為牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎最重要的致病菌之一,且與患者病情加重和治療后復(fù)發(fā)密切相關(guān)[3-4]。尋找安全性高、能夠高效清除牙齦卟啉單胞菌的藥物,對慢性牙周炎的治療至關(guān)重要。丹皮酚屬于毛茛科植物牡丹根皮和蘿科植物徐長卿干燥根或全草的主要有效成分,其具有鎮(zhèn)靜、催眠、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌等藥理作用[5-6]。本研究探討了丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌的抗菌效果,以期為臨床治療慢性牙周炎提供更多的藥物選擇。
牙齦卟啉單胞菌購自同濟大學(xué)的口腔醫(yī)學(xué)院。牛心腦浸瓊脂型培養(yǎng)基(brain heart infusion,BHI;美國Difco公司);胰蛋白酶大豆肉湯(Tryptic Soy Broth,TSB;碧迪醫(yī)療器械有限公司);丹皮酚(美國Sigma公司);死/活菌型熒光染色試劑(貨號:LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 7012;美國Molecular Probes 公司)。DY-2型厭氧培養(yǎng)箱(浙江義烏冷凍機總廠);BioTek酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)。氯己定(上海優(yōu)培諾生物科技有限公司)。
1.2.1 菌液制備:取凍存在-80 ℃冰箱中的純種牙齦卟啉單胞菌放置在25 ℃室溫下解凍,取30 μl接種在3 ml已經(jīng)過滅菌處理的新鮮TSB液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如下,溫度37 ℃,二氧化碳濃度10%,培養(yǎng)時間18 h,約OD600=0.08~0.09,相應(yīng)的菌液濃度為3.2×106cfu/ml,即得標準菌液。
1.2.2 直接接觸法:取100 μl的標準菌液和含有不同濃度丹皮酚的新鮮培養(yǎng)基混合,配制成濃度為0、1.5、3、7.5、15及20 mmol/L的混合液,記作丹皮酚組。同法配制含1%氯己定的混合液記作陽性對照組。將不含丹皮酚以及菌液的TSB新鮮培養(yǎng)基作為空白對照組。分別將上述三組混合液接種在96孔板中,每孔100 μl,每組分別設(shè)置5個復(fù)孔,放置在厭氧培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如下,溫度37 ℃,二氧化碳濃度10%,每隔30 min于酶標儀下完成每孔吸光值的讀取,并完成統(tǒng)計分析。
1.2.3 菌落形成計數(shù)法:根據(jù)上述方式將牙齦卟啉單胞菌進行分組后,放置在厭氧培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如下,溫度37 ℃,二氧化碳濃度10%,培養(yǎng)時間為4 h。分別吸取三組混合溶液100 μl,與含有丹皮酚的新鮮培養(yǎng)基均勻混合后配制成終濃度為0、3、7.5、15和20 mmol/L的均勻混合液為丹皮酚組;陽性對照組為含1%氯己定的混合液,共培養(yǎng)1 h,稀釋100萬倍后接種于BHI 瓊脂培養(yǎng)基平板上,每組3個復(fù)孔。37 ℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,觀察計算細菌菌落數(shù)并拍照,進行統(tǒng)計分析。
1.2.4 活死細菌染色:滴加3.2×106cfu/ml的牙齦卟啉單胞菌懸液300 μl到細胞爬片上,于37 ℃的厭氧條件下靜置60 min后,順著24孔板側(cè)壁加入TSB培養(yǎng)液2 ml。再次置于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)24 h,使其產(chǎn)生牙齦卟啉單胞菌的生物膜。隨后用移液槍將培養(yǎng)基小心吸出,再以PBS緩沖液重復(fù)洗滌3次,分別加入含有丹皮酚終濃度為0、1.5、3、7.5、15及20 mmol/L的新鮮培養(yǎng)基2 ml。各組分別培養(yǎng)30 min后,將藥液吸凈,以PBS輕輕洗滌蓋玻片3次,于避光條件下滴加活死細菌熒光染色劑200 μl。經(jīng)避光靜置孵育約15 min,并用PBS緩沖液對其實施重復(fù)洗滌3次,而后封片。放在激光共聚焦的顯微鏡下仔細觀察拍照菌斑生物膜情況,其中死菌染色顯示紅色,活菌染色顯示綠色。
對比各組直接接觸法結(jié)果、菌落形成計數(shù)法結(jié)果及各組活死細菌染色結(jié)果。
丹皮酚濃度為1.5、3、7.5及15 mmol/L時,牙齦卟啉單胞菌的OD600顯著降低,并且表現(xiàn)為濃度依賴性,見圖1。
圖1 OD(600 nm)曲線圖
丹皮酚濃度為3、7.5、15及20 mmol/L時,對牙齦卟啉單胞菌均有一定的抗菌結(jié)果,隨著丹皮酚濃度的升高,其抗菌效果增強,且各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2—3。
圖2 平板克隆圖
圖3 定量分析圖
不同濃度的丹皮酚(3、7.5、15及20 mmol/L)處理牙齦卟啉單胞菌生物膜后,發(fā)現(xiàn)空白對照組以綠色熒光為主,紅色熒光不明顯;丹皮酚組及陽性對照組以紅色熒光為主,綠色熒光較弱,提示在丹皮酚組以及陽性對照組死菌數(shù)量占主導(dǎo),說明丹皮酚針對牙齦卟啉單胞菌的生物膜存在較好的殺滅作用,且隨著丹皮酚濃度從3~15 mmol/L逐漸升高,對牙齦卟啉單胞菌生物膜的殺滅作用越強,各組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而15、20 mmol/L的丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌生物膜的殺滅作用相似,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4—5。
圖4 CLSM掃描顯微鏡圖
圖5 活死細菌染色定量分析圖
慢性牙周病的臨床表現(xiàn)通常包含牙齦出血、牙周袋產(chǎn)生、牙槽骨吸收和進行性的附著喪失等[7-8]。隨著近年來人們生活方式的不斷改變,慢性牙周病的發(fā)病率正呈逐年升高趨勢,且發(fā)病年齡開始趨于年輕化,其中35~44歲人群慢性牙周病的發(fā)病率高達97.20%[9-10]。由此可知,加強對慢性牙周病的發(fā)生、發(fā)展機制的研究,有利于早期防控,從而降低其發(fā)病率。目前,臨床上關(guān)于慢性牙周病發(fā)病機制的研究主要集中在食物嵌塞、內(nèi)分泌異常、全身性疾病及口腔解剖結(jié)構(gòu)等方面。針對上述發(fā)病機制制定預(yù)防干預(yù)措施,雖可有效降低慢性牙周炎的發(fā)病風(fēng)險,但效果并不十分理想。隨著相關(guān)研究的日益深入,越來越多學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種致病微生物可能在牙周病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。而牙齦卟啉單胞菌被公認為是牙周毒性較強的一類致病菌,其可合成并分泌出大量毒力因子,進而介導(dǎo)患者牙周炎的形成、發(fā)展及針對牙周組織的損害[11-12]。因此,探尋一類可較好抑制該病原菌的藥物十分必要,亦是當(dāng)前牙科醫(yī)師所共同關(guān)注的研究熱點。
本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),丹皮酚的濃度為1.5、3、7.5及15 mmol/L時可對牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生較強的抗菌性,且呈現(xiàn)出濃度的依賴性。同時,活死細菌染色法的結(jié)果表明,丹皮酚在濃度含量為3、7.5、15及20 mmol/L時,牙齦卟啉單胞菌的生物膜活菌百分比明顯降低,這在陳筑等[13]的研究結(jié)果中得以佐證,提示了丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌具有良好的體外抗菌效果。此外,牙齦卟啉單胞菌能有效地激活宿主的自身免疫細胞及巨噬細胞,進而誘導(dǎo)炎癥有關(guān)基因的自主轉(zhuǎn)錄,加速促炎因子的形成及分泌,如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1及白細胞介素6等,促使炎癥反應(yīng)發(fā)生,發(fā)揮顯著的細胞毒性以及組織損傷性[14-16]。同時,牙齦卟啉單胞菌會引起牙周結(jié)締組織的損傷以及牙槽骨吸收。在正常的機體生理狀態(tài)之下,牙槽骨自身的骨改建是終身動態(tài)平衡的一個重塑的過程,其通常由成骨/破骨細胞調(diào)控的相關(guān)骨形成及骨吸收完成。慢性牙周病的主要臨床特征是牙槽骨吸收,這也表明了大量破骨細胞得以形成,并使骨吸收較骨形成更快,從而促進了牙槽骨的不斷吸收。因此,有效地控制機體內(nèi)巨噬細胞的相關(guān)炎癥反應(yīng)也是抑制患者牙周組織損壞的關(guān)鍵。丹皮酚具有較好的免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用,其能通過下調(diào)機體內(nèi)TNF-α誘導(dǎo)的有關(guān)血管內(nèi)皮的細胞炎癥因子的自我表達,繼而抑制內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)[17]。此外,丹皮酚還能對脂多糖誘導(dǎo)的心形膠質(zhì)類細胞炎癥因子的合成分泌產(chǎn)生有效抑制,并通過對核因子κB的受體活化因子有關(guān)配體誘導(dǎo)的破骨細胞產(chǎn)生抑制作用,從而達到保護牙周組織的目的。這充分說明了將丹皮酚用于慢性牙周病,具有極大的潛在價值。
綜上所述,丹皮酚對牙齦卟啉單胞菌具有較佳的體外抗菌效果,可將其作為治療慢性牙周炎的藥物成分之一,臨床應(yīng)用前景良好。