周 芳,唐成芳,曾 輝,李子夏,郭 芳

(1 西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學院口腔正畸學教研室,西安 710021;2 西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學院口腔修復學教研室;3 西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學院口腔內(nèi)科學教研室;4 西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學院口腔外科學教研室;*通訊作者,E-mail:39068416@qq.com)

牙周病是引起患者牙齒缺失的首要病因[1],牙周病患者牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)破壞,不但影響咀嚼功能,還會加速牙槽骨骨量丟失[2],目前全世界有8%-30%的中年人為牙周病患者[3],牙周病的治療已經(jīng)成為口腔醫(yī)學研究的難點和重點。正畸治療是牙周病綜合治療的主要方法[4],有學者認為正畸治療可以解除牙周病的致病因素[5],也有報道稱牙周病患者在正畸治療過程中會出現(xiàn)牙齒松動、牙槽骨形態(tài)異常的情況[6-8]。本研究建立牙周病及靜止期牙周病動物模型并對其牙齒加力,觀察牙齒移動對動物模型牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)及炎癥反應(yīng)的影響,為牙周病患者的治療提供更多治療依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

28周齡SD雄性大鼠72只,平均體質(zhì)量(330±51.7)g,購自空軍軍醫(yī)大學動物中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜)2014-002,實驗動物使用許可證號:SCXK(陜)2014-001。

1.2 主要儀器和試劑

Bruker Skyscan Micro-CT系統(tǒng)(型號:1176),NIKON Eclipse ci顯微鏡。EDTA抗原修復液、檸檬酸抗原修復液、PBS緩沖液、自發(fā)熒光淬滅劑、BSA、一抗、熒光二抗、DAPI,均由Servicebio公司提供。

1.3 動物模型建立及分組

大鼠隨機分為對照組(24只)和實驗組(48只)。對照組不作處理。實驗組大鼠結(jié)扎下頜雙側(cè)第一磨牙牙頸部,6周后見牙齦腫脹,呈暗紅色,探診出血明顯,牙周纖維排列紊亂,大量炎性細胞浸潤,牙槽骨可見破骨細胞及大量骨吸收陷窩。

去除實驗組大鼠結(jié)扎絲,隨機對實驗組半數(shù)大鼠行牙周基礎(chǔ)治療(24只),4周后見治療牙齒牙齦萎縮,探診不出血,探診深度較治療前減小,牙周組織少量炎癥細胞侵潤,牙槽骨遺留少量骨吸收陷窩,膠原纖維修復[9]。實驗組其余大鼠不做處理。

以下頜第一磨牙為觀察對象,近中移動所有實驗組大鼠下頜右側(cè)第一磨牙,力值50 g。將實驗組分為靜止期牙周病組(牙周治療大鼠左側(cè))、靜止期牙周病加力組(牙周治療大鼠右側(cè))、牙周病組(其余實驗組大鼠左側(cè))、牙周病加力組(其余實驗組大鼠右側(cè))。各組于加力0,7,14,21 d,取雙側(cè)下頜骨行micro-CT掃描、免疫熒光染色。

1.4 Micro-CT掃描方式

Bruker Skyscan Micro-CT系統(tǒng)掃描,電壓80 kV,電流310 μA,分辨率18 μm,掃描結(jié)束后采用CTvox3.3軟件對所獲影像行三維重建。 選取動物模型雙側(cè)下頜第一磨牙近中根近中牙槽嵴邊緣至遠中根遠中牙槽嵴邊緣為感興趣區(qū)域(region of interest,ROI),Data Viewer1.5.6軟件測量感興趣區(qū)域內(nèi)骨密度(bone mineral density,BMD),骨體積分數(shù)(bone volume fraction,BV/TV),骨小梁數(shù)量(trabecular bone number,Tb·N),骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb·Th)和骨小梁分離距離(trabecular bone separation distance,Tb·Sp)[10]。

1.5 免疫熒光染色

標本脫鈣、脫水、包埋、切片、脫蠟、免疫熒光染色。細胞核在紫外光下為藍色,IL-6特異性染色為細胞膜呈紅色。應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件將紅色熒光單色照片轉(zhuǎn)換為黑白圖片后選取相同的黑色作為判斷陽性的統(tǒng)一標準,計算平均光密度值(average optical, AO)=累積光密度值(increase optical density,IOD)/組織像素面積(AREA),AO越大表示陽性表達越高(見圖1)。

A.DAPI×400,細胞核藍染 B.圖A、C merge圖×400 C.IL-6×400,細胞膜紅染 D.圖C轉(zhuǎn)換為黑白圖片圖1 AO的計算方式Figure 1 Calculation method of average optical

1.6 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad prism8.0.2軟件處理數(shù)據(jù),多樣本間的比較采用單因素方差分析,各組方差齊性時, 采用LSD-t檢驗,方差不齊時,采用Tamhane’T2法檢驗,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)

加力0,7,14,21 d,牙周病組、牙周病加力組、靜止期牙周病組和靜止期牙周病加力組BMD、BV/TV、Tb·Th均低于對照組(P<0.05),Tb·N、Tb·Sp高于對照組(P<0.05)。加力0,7,14,21 d,靜止期牙周病組BMD和Tb·Th均高于牙周病組,Tb·Sp低于牙周病組(P<0.05);加力14 d和21 d,靜止期牙周病組Tb·N低于牙周病組(P<0.05,見表1-5)。加力0,7,14,21 d,靜止期牙周病加力組BMD、BV/TV、Tb·Th均高于牙周病加力組(P<0.05),Tb·Sp低于牙周病加力組(P<0.05);加力14 d和21 d,靜止期牙周病加力組Tb·N低于牙周病加力組(P<0.05,見表1-5)。

牙周病組和牙周病加力組BMD、BV/TV、Tb·Th隨加力時間逐漸降低,Tb·N、Tb·Sp逐漸升高;靜止期牙周病組骨微結(jié)構(gòu)各項指標無明顯變化;靜止期牙周病加力組BMD、BV/TV在加力14 d時降至最低,Tb·N、Tb·Sp升至最高(見表1-5、圖2)。

表1 各組BMD的差異Table 1 Comparison of BMD among five

表2 各組BV/TV的差異Table 2 Comparison of BV/TV among five

表3 各組Tb·N的差異Table 3 Comparison of Tb·N among five

表4 各組Tb·Th的差異Table 4 Comparison of Tb·Th among five

表5 各組Tb·Sp的差異Table 5 Comparison of Tb·Sp among five

A.加力0 d B.加力7 d C.加力14 d D.加力21 d圖2 靜止期牙周病加力組micro-CTFigure 2 Micro-CT of the mandible bones in quiescent periodontitis with force group

2.2 IL-6的表達

相同加力時間下,牙周病組、牙周病加力組、靜止期牙周病組、靜止期牙周病加力組AO均高于對照組(P<0.05);加力7 d和14 d,牙周病加力組AO高于牙周病組(P<0.05);加力7,14,21 d,靜止期牙周病加力組AO高于靜止期牙周病組(P<0.05),加力0,7,21 d,牙周病加力組AO高于靜止期牙周病加力組(P<0.05,見表6)。

牙周病組AO隨加力時間逐漸升高,牙周病加力組AO在加力7 d升至最高,靜止期牙周病組AO無明顯變化;靜止期牙周病加力組AO在加力14 d升至最高(見表6、圖3)。

表6 各組AO的差異Table 6 Comparison of AO among five

A.加力0 d B.加力7 d C.加力14 d D.加力21 d圖3 靜止期牙周病加力組IL-6的表達Figure 3 IL-6 expression in quiescent periodontitis with force group

3 討論

牙周病患者的牙周支持組織被破壞,且骨吸收活躍[11],常導致牙齒移位,影響功能和美觀,相比常規(guī)的牙周基礎(chǔ)治療,牙周-正畸聯(lián)合治療可以控制牙周炎癥,排齊牙列,改善咀嚼功能及外觀,解除咬合創(chuàng)傷,有利于牙周組織的恢復。但是有學者發(fā)現(xiàn)部分牙周病患者在正畸治療中牙周炎癥被激活,出現(xiàn)了牙槽骨加速吸收的情況[12,13],因此,對牙周病患者正畸治療過程中牙槽骨的變化及其影響因素的研究具有重要的臨床意義。

micro-CT的檢測指標中,BMD可以反映骨骼的質(zhì)量和強度,BV/TV可以反應(yīng)骨骼代謝情況,Tb·N、Tb·Sp、Tb·Th決定骨骼的強度[10]。本研究發(fā)現(xiàn),加力0 d,牙周病組和牙周病加力組BMD、BV/TV、Tb·Th分別較靜止期牙周病組和靜止期牙周病加力組降低,Tb·N、Tb·Sp升高,而且在相同加力時間下,牙周病加力組BMD、BV/TV、Tb·Th較靜止期牙周病加力組降低,Tb·N、Tb·Sp升高。說明經(jīng)過牙周基礎(chǔ)治療,靜止期牙周病動物模型牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)有一定的恢復,而且牙齒移動后,靜止期牙周病動物模型牙槽骨的破壞程度相較牙周病動物模型減輕。以往有學者發(fā)現(xiàn)牙周病大鼠牙槽骨改建的最活躍時期為加力后的第7天[14],本研究發(fā)現(xiàn),牙周病加力組BMD、BV/TV、Tb·Th隨加力時間逐漸降低,Tb·N、Tb·Sp逐漸升高,而靜止期牙周病加力組BMD、BV/TV在加力14 d時降至最低,Tb·N、Tb·Sp升至最高。說明牙齒移動后,牙周病動物模型牙槽骨吸收持續(xù)存在,而靜止期牙周病動物模型牙槽骨在加力14 d骨吸收最活躍,骨強度最低,這可能是由于牙周組織的狀態(tài)不同導致對正畸力的敏感性有所差別。當力學刺激超過牙周組織相關(guān)骨改建細胞反應(yīng)的“閾值”下限時,細胞才會應(yīng)答[15],由此可見,靜止期牙周病動物模型牙周組織中相關(guān)骨改建細胞對力學刺激反應(yīng)的“閾值”升高,使得骨改建變得緩慢。

目前的研究認為牙齒移動實質(zhì)是牙周組織的炎性反應(yīng),牙周膜在應(yīng)力作用下分泌并表達多種生長因子,調(diào)控牙槽骨的沉積和吸收,從而使牙齒移動到新的位置。與牙周炎癥和正畸牙齒移動骨改建相關(guān)的細胞因子較多,白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)與牙齒移動骨代謝密切相關(guān),在牙周病的發(fā)生發(fā)展及正畸牙齒移動中起著重要作用,被認為是骨吸收的標志物之一[16,17],而且其表達量與牙周炎癥嚴重程度呈正相關(guān),可以作為表示牙周破壞程度的指標[18]。本研究中,相同加力時間下,牙周病加力組、靜止期牙周病加力組AO均高于對照組;加力0,7,21 d,牙周病加力組AO均高于靜止期牙周病加力組。說明牙齒移動后,靜止期牙周病動物模型確實出現(xiàn)了牙周炎癥加重的情況,但牙周破壞程度較牙周病動物模型減輕。

綜上所述,靜止期牙周病動物模型牙槽骨骨微結(jié)構(gòu)有一定恢復,牙齒移動初期也會出現(xiàn)牙周炎癥加重,骨強度下降的現(xiàn)象,并且在加力14 d時牙槽骨吸收最活躍,但在整個牙齒移動過程中牙周組織的破壞程度較牙周病動物模型減輕。