王茂彩?李驍?王敏儀?陳姍?陳勍

【摘要】目的 探討細胞周期蛋白D3（Cyclin D3）在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達及其意義。方法 采用免疫組織化學(xué)檢測12例正常子宮內(nèi)膜組織、13例單純型子宮增生內(nèi)膜及45例子宮內(nèi)膜癌（EMC）組織中Cyclin D3蛋白的表達情況，分析Cyclin D3蛋白陽性表達率與臨床病理特征和雌激素受體（ER）及孕激素受體（PR）間的關(guān)系。結(jié)果 與正常子宮內(nèi)膜組織相比，Cyclin D3在EMC的陽性表達率增高（78% vs. 33%，P < 0.05）。在45例EMC組織中，有臟器轉(zhuǎn)移者的Cyclin D3陽性表達率較高（P < 0.05）;但Cyclin D3與病理分化級別、臨床分期、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P均> 0.05），且Cyclin D3的陽性表達率與ER和PR的陽性表達率均無關(guān)（P均> 0.05）。結(jié)論 Cyclin D3的過表達可能參與了EMC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

【關(guān)鍵詞】細胞周期蛋白D3;子宮內(nèi)膜癌;雌激素受體;孕激素受體

Expression and significance of Cyclin D3 in the endometrial carcinoma Wang Maocai， Li Xiao， Wang Minyi， Chen Shan， Chen Qin. Department of Gynaecology， the Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510655， China

Corresponding author， Chen Qin， E-mail： chenq6@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To investigate the expression level and significance of Cyclin D3 in normal， simple hyperplastic and malignant endometrium tissues. Methods The expression level of Cyclin D3 protein was measured in the normal （n = 12）， simple hyperplasia （n = 13） and endometrial carcinoma groups （EMC， n = 45）. The relationship between the positive expression rate of Cyclin D3 protein， clinicopathological characteristics， estrogen receptor （ER） and progesterone receptor （PR） was analyzed. Results Compared with the normal group， the positive expression rate of Cyclin D3 was significantly increased in the EMC group （78% vs 33%， P < 0.05）. In the EMC group， the positive expression of Cyclin D3 in the tissues with organ metastasis was significantly increased （P < 0.05）. However， Cyclin D3 was not significantly correlated with pathological differentiation grade， staging， depth of myometrial invasion or lymph node metastasis （all P > 0.05）. Moreover， the positive expression rate of Cyclin D3 was not remarkably associated with the positive rates of ER and PR （both P > 0.05）. Conclusion Overexpression of Cyclin D3 is probably involved with the incidence and metastasis of EMC.

【Key words】Cyclin D3;Endometrial carcinoma;Estrogen receptor;Progesterone receptor

子宮內(nèi)膜癌（EMC）是女性常見的生殖道惡性腫瘤之一，子宮內(nèi)膜樣腺癌是其中最常見的病理類型。由于EMC發(fā)生率的逐年增高和年輕化趨勢，也使其對女性生殖健康的影響逐漸受到社會的關(guān)注。已有研究顯示，細胞周期蛋白D3（Cyclin D3）是細胞G1/S期的正調(diào)控因子，其與相應(yīng)的周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合成復(fù)合物，參與并促進細胞相關(guān)基因的表達，從而使細胞通過G1/S調(diào)控點，進入自主分裂程序，誘發(fā)癌變[1]。臨床研究表明，Cyclin D在EMC等生殖道腫瘤中呈現(xiàn)過度表達，但不同亞型表達的情況不一，且受PTEN等抑癌基因的調(diào)控[2-4]。因此，本研究擬檢測Cyclin D3在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生及EMC等不同子宮內(nèi)膜組織中的表達，并分析其在不同內(nèi)膜組織中的表達差異、與雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）的表達關(guān)系，以及與臨床分期、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的關(guān)系。

材料與方法

一、標本來源

70例標本來源于2003年1月至2010年12月中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院婦產(chǎn)科住院患者術(shù)中切除的子宮內(nèi)膜組織，均經(jīng)病理活組織檢查（活檢）確診。其中，正常子宮內(nèi)膜12例，取自因“子宮肌瘤、子宮頸上皮內(nèi)瘤樣變”行子宮切除患者的正常子宮內(nèi)膜組織，患者年齡為（40.8±7.3）歲，無其他系統(tǒng)性疾病，其中增生期內(nèi)膜4例、分泌期內(nèi)膜6例、絕經(jīng)期內(nèi)膜2例;子宮增生內(nèi)膜13例，取自子宮切除術(shù)后病理確診為單純型增生患者的子宮內(nèi)膜組織，患者年齡為（42.3±8.4）歲;EMC 45例，取自子宮切除術(shù)后病理證實為子宮內(nèi)膜樣腺癌患者的EMC組織，其中高分化腺癌19例、中分化腺癌14例、低分化腺癌12例，患者年齡為（54.0±9.4）歲。所有患者術(shù)前均未接受化學(xué)治療、放射治療及6個月內(nèi)未接受任何激素治療，并已簽署臨床科研標本采集知情同意書。

二、方 法

采用非生物素二步法免疫組織化學(xué)染色（免疫組化）法。先用10%甲醛固定子宮內(nèi)膜標本，石蠟包埋后切片，厚4 μm，脫蠟、修復(fù)抗原;再用3% H2O2去離子水孵育10 min，滴加Cylin D3多克隆抗體（1∶50，奧博森），二氨基聯(lián)苯胺顯色液（羅氏）顯色，蒸餾水充分沖洗，脫水，透明樹膠封片。以Cyclin D3陽性的人子宮內(nèi)膜組織切片作為陽性對照，使用磷酸鹽緩沖液（中杉金橋）代替一抗作為陰性對照。分別記錄70例組織的Cyclin D3陽性表達率，并分析各組間的差異。收集整理45例EMC患者的相關(guān)臨床病理資料，包括病理分化級別、分期（根據(jù)FIGO2010標準修正）、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臟器轉(zhuǎn)移、PR和ER的陽性表達率等。

三、評價標準

以腺上皮細胞中出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒為陽性。在光鏡下計數(shù)400個細胞，采用雙評分半定量法：陽性細胞數(shù)< 5%評0分，5% ～ 25%評1分，26% ～ 50%評2分，> 50%評3分;顯色度評分：細胞核無顯色評0分，淡黃色評1分，棕黃色評2分，棕褐色評3分?？偡譃?項評分相加之和，總分0分為陰性（-）、1 ～ 2分為低表達（+）、3 ～ 4分為中表達（++）、5 ～ 6分為高表達（+++）。陽性表達率=（中表達例數(shù)+高表達例數(shù)）/總例數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 26.0分析數(shù)據(jù)。分類資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，3組間兩兩比較行Bonferroni法校正，對EMC中Cyclin D3的陽性表達與ER、PR表達的關(guān)系行McNemar檢驗。α = 0.05。

結(jié)果

一、不同子宮內(nèi)膜組織中Cyclin D3的表達特點

Cyclin D3在正常子宮內(nèi)膜、單純型子宮增生內(nèi)膜和EMC的組織中均呈現(xiàn)陽性表達。其主要在腺細胞或腺癌細胞中表達明顯，位于細胞漿中，呈淡黃或棕黃色，基質(zhì)細胞中呈現(xiàn)陰性表達或弱表達，見圖1。

二、不同子宮內(nèi)膜組織中Cyclin D3的陽性表達率比較

12例正常子宮內(nèi)膜組織中，有4例為Cyclin D3陽性表達（2例為中表達，2例為高表達），陽性表達率為33%（4/12）。13例單純型子宮內(nèi)膜增生組織中，有9例為Cyclin D3陽性表達（6例為中表達，3例為高表達），陽性表達率為69%（9/13）。45例子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中，35例為Cyclin D3陽性表達（24例為中表達，11例高表達），陽性表達率為78%（35/45）。Cyclin D3在正常子宮內(nèi)膜、單純型子宮內(nèi)膜增生及子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 = 8.687，P = 0.013），其中子宮內(nèi)膜樣腺癌組高于正常子宮內(nèi)膜組（χ2 = 8.661，P = 0.003）。

三、EMC中Cyclin D3陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系

45例EMC組織中，有臟器轉(zhuǎn)移者Cyclin D3陽性表達率較高（P < 0.05），見表1。

四、子宮內(nèi)膜樣腺癌中Cyclin D3的陽性表達與ER、PR表達的關(guān)系

45例EMC中，Cyclin D3表達與ER、PR表達均無關(guān)（P均> 0.05），見表2。

促癌因子比例或表達失常時，細胞的增殖功能可能失控，使細胞出現(xiàn)惡性增殖，從而發(fā)展為腫瘤細胞。Cyclin D是G1/S期轉(zhuǎn)換的重要調(diào)控因子，包括D1、D2及D3三個亞型。已有大量研究證明，Cyclin D3是一種原癌基因，其基因結(jié)構(gòu)和功能異常與多種惡性腫瘤（如乳腺癌、肺癌、卵巢癌等）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，主要是通過調(diào)控點來調(diào)節(jié)細胞的分裂、DNA修復(fù)等過程[5]。

EMC是女性最常見的生殖道惡性腫瘤。既往研究表明，Cyclin D亞型在EMC中均存在表達，Cyclin D3表達存在不一致性。Wu等[2]檢測了105例EMC，其中18%可見Cyclin D3的過度表達。本研究中，Cyclin D3在正常子宮內(nèi)膜組、單純型子宮內(nèi)膜增生組、EMC組中均呈現(xiàn)陽性表達，且陽性表達率逐漸升高，其中EMC中Cyclin D3陽性表達率高于正常子宮內(nèi)膜組織。這可能與本研究所選的病理標本來自單一的子宮內(nèi)膜腺樣癌這一病理類型有關(guān)。

本研究分析了Cyclin D3與EMC患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示有臟器轉(zhuǎn)移者的Cyclin D3陽性表達率高于無臟器轉(zhuǎn)移者，但Cyclin D3的陽性表達與EMC患者的病理分化級別、臨床分期、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)。這可能與EMC的腫瘤細胞無限增殖不是一種細胞周期蛋白過度表達的結(jié)果，而是多種細胞周期蛋白表達異常的共同結(jié)果有關(guān)[6-7]。因此，本研究結(jié)果存在一定的局限性，筆者下一步研究將擴大樣本量并收集患者的生存狀況進一步驗證Cyclin D3與EMC治療和預(yù)后指標的關(guān)系。

研究表明，Cyclin D3與CDK4或CDK6結(jié)合后，可以激活CDK的磷酸激酶活性，使Rb蛋白磷酸化，繼而促進細胞周期的變化。當(dāng)Cyclin D3表達失控時，則可能引起細胞增殖周期的失調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[6， 8]。本研究初步表明，EMC的細胞周期調(diào)控中，Cyclin D3呈現(xiàn)過度表達，是細胞周期的一個重要調(diào)控因子。在EMC的形成過程中，雌激素可上調(diào)CyclinD3表達并參與其發(fā)生發(fā)展[9]。另外大劑量孕激素作為早期EMC患者保留生育能力的治療，具有較高的臨床緩解率[10]。但本研究中卻未見Cyclin D3的陽性表達與ER、PR表達有關(guān)。

總之，Cyclin D3可能參與EMC的細胞增殖調(diào)控，與EMC的臟器轉(zhuǎn)移有關(guān)，但與ER、PR的表達卻無明顯關(guān)系。這些均需要進一步的多中心、大樣本研究加以證實。

參 考 文 獻

[1] Wang H， Nicolay BN， Chick JM， Gao X， Geng Y， Ren H， Gao H， Yang G， Williams JA， Suski JM， Keibler MA， Sicinska E， Gerdemann U， Haining WN， Roberts TM， Polyak K， Gygi SP， Dyson NJ， Sicinski P. The metabolic function of cyclin D3-CDK6 kinase in cancer cell survival. Nature， 2017， 546（7658）：426-430.

[2] Wu W， Slomovitz BM， Soliman PT， Schmeler KM， Celestino J， Milam MR， Lu KH. Correlation of cyclin D1 and cyclin D3 overexpression with the loss of PTEN expression in endometrial carcinoma. Int J Gynecol Cancer， 2006， 16（4）：1668-1672.

[3] Brandmaier A， Hou SQ， Shen WH. Cell cycle control by PTEN. J Mol Biol， 2017， 429（15）：2265-2277.

[4] 段超，王斌，梁霜，劉旭斌，楊崢，張明輝，張文輝，余俐.骨橋蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達及其與腫瘤增殖和患者預(yù)后的關(guān)系. 新醫(yī)學(xué)， 2013， 44（6）：366-369.

[5] Wang B， Wang Z， Han L， Gong S， Wang Y， He Z， Feng Y， Yang Z. Prognostic significance of cyclin D3 expression in malignancy patients： a meta-analysis. Cancer Cell Int， 2019， 19：158.

[6] Giannone G， Tuninetti V， Ghisoni E， Genta S， Scotto G， Mittica G， Valabrega G. Role of cyclin-dependent kinase inhibitors in endometrial cancer. Int J Mol Sci， 2019， 20（9）：2353.

[7] Shevra CR， Ghosh A， Kumar M. Cyclin D1 and Ki-67 expression in normal， hyperplastic and neoplastic endometrium. J Postgrad Med， 2015， 61（1）：15-20.

[8] 賈祝強，張福胤. Cyclin D3與Ki-67在涎腺腺泡細胞癌中的表達及意義.中國醫(yī)療前沿，2008，3（12）：17-19.

[9] 袁丹，劉蒙蒙，周正平，劉俊江，孫小杰.雌激素對人子宮內(nèi)膜樣癌Ishikawa細胞中p57～（kip2）、Cyclin D1、CDK4表達及形態(tài)變化影響的研究.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展， 2018， 27 （4）：249-254.

[10] 周蓉，鹿群，劉國莉，王益勤，王建六. 早期子宮內(nèi)膜癌保留生育功能治療專家共識.臨床醫(yī)學(xué)研究與實踐，2019， 23 （4）：201.

（收稿日期：2020-09-15）

（本文編輯：林燕薇）