劉小康,李帥華,張夢珂,潘玉善,劉建華,苑 麗,胡功政

(河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450000)

黏菌素(Colistin)是一種陽離子多肽類抗生素,又名多黏菌素E,是人醫(yī)臨床、獸醫(yī)臨床上常用的抗菌藥物。黏菌素因其腎毒性作用大,在20世紀80年代早期曾被世界大多數(shù)地區(qū)棄用。然而多重耐藥菌的出現(xiàn)以及對革蘭氏陰性微生物有活性的新抗菌藥物的缺乏,黏菌素作為治療革蘭氏陰性菌感染的最后一道防線,被重新應用于治療多重耐藥的陰性菌感染[1]。黏菌素的抗菌機理是通過分子中的聚陽離子環(huán)與細菌細胞外膜上類脂A作用,置換外膜中的鈣和鎂等陽離子,破壞陰性菌帶負電荷的外膜而降低細胞膜的穩(wěn)定性,使細胞內重要物質外流從而產(chǎn)生殺菌作用[2]。然而自2015年由質粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1首次被報道以來,又相繼在中國或其他國家分離的腸桿菌科細菌中檢測出了mcr-2～mcr-10等9種新的mcr基因亞型[3-6]。mcr基因隨著可移動質粒在不同物種不同菌屬之間的水平傳播,顯著加快了黏菌素抗性的傳播速度,給畜牧業(yè)及人類健康帶來了嚴重威脅。

除了上述重要的耐藥機制外,外排泵和外膜的屏障作用是引起黏菌素抗性的非特異性因素[3],故尋求有效的外排泵抑制劑或膜通透性促進劑,是增強黏菌素抗菌活性或增強細菌黏菌素敏感性的有效策略。外排泵抑制劑如氰氯苯腙(CCCP)、2,4—二硝基酚(DNP)和利血平等由于自身的毒性作用,限制了其在臨床上的應用[7]。EDTA作為二價陽離子的螯合劑,被證實可通過競爭性結合與外膜脂多糖靜電相連的Ca2+和Mg2+,使外膜的穩(wěn)定性減弱,并在介質中釋放脂多糖,最終增加革蘭氏陰性菌的外膜通透性[8]。據(jù)Banin E等[9]報道，與EDTA聯(lián)用時慶大霉素對銅綠假單胞菌的殺滅效果可達1000倍以上。盡管EDTA作為膜通透性促進劑,已被證實增強了多種抗菌藥物的活性[10,11],但關于EDTA對腸桿菌科細菌的黏菌素敏感性的影響尚未見研究報道。本研究選定從豬和雞中分離的沙門菌、大腸桿菌,從表型上觀察了膜通透性促進劑 EDTA對黏菌素作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 51株沙門菌和34株大腸桿菌,以及臨床分離的黏菌素天然耐藥菌奇異變形桿菌3株和摩氏摩根菌1株(對照菌),均是由本實驗室保存的經(jīng)過鑒定的臨床分離菌株。鼠傷寒沙門菌標準株CVCC?541(命名為JS),購自中國獸藥監(jiān)察所;質控菌株為大腸埃希菌ATCC?25922,購自中國普通微生物菌種保存中心。

1.1.2 藥品儲備液的制備 黏菌素(效價為23988 U/mg,購于河北圣雪大成唐山制藥有限責任公司):用無菌去離子水配成5120 mg/L的儲備液。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na):用無菌去離子水配成5000 mg/L的儲備液。以上儲備液均要過濾除菌,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3主要試劑及培養(yǎng)基 瓊脂糖(Takara,Japan)、2×Taq Master Mix酶、DM2000 DNA Marker (Takara, Japan)、TE緩沖液和熒光染料溴化乙錠EB均購于上海生工生物技術服務有限公司; LB肉湯、LB瓊脂、MHB肉湯、麥康凱瓊脂和SS瓊脂,均購于青島海博生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌的復蘇 將保存在-80 ℃的甘油菌取出,融化后上下顛倒搖勻,吸取100 μL接種于4 mL新鮮LB肉湯培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)過夜。用接種環(huán)蘸取適量，在麥康凱或SS瓊脂培養(yǎng)基上劃線,于37 ℃培養(yǎng)16～18 h,再挑取單菌落接種到4 mL LB肉湯中。將純化后的臨床菌置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2mcr基因的檢測 采用煮沸法提取基因組DNA,參考有關文獻報道的mcr基因引物[4-6,12-14],通過PCR擴增和測序分析檢測質粒介導的黏菌素抗性基因mcr-1～mcr-10。

1.2.3 EDTA對黏菌素MIC的影響 參照CLSI規(guī)定的操作方法[15],使用二倍微量肉湯稀釋法分別測定黏菌素和EDTA對受試菌株的最小抑菌濃度(MICs)。再測定亞抑菌濃度(sub-MIC)的EDTA存在時黏菌素對各菌株的MIC。以黏菌素天然耐藥菌奇異變形桿菌、摩氏摩根菌和沙門菌(標準菌株JS)為對照。以大腸桿菌ATCC?25922作為質控菌株。試驗重復3次。

1.2.4 體外殺菌曲線 選擇3株代表性沙門菌(標準菌株JS、臨床分離的雞源耐黏菌素沙門菌CS23和CS18),分別測定1/2MIC的黏菌素、sub-MIC的EDTA、1/2MIC的黏菌素+sub-MIC的EDTA的殺菌作用,分別在0、2、4、6、8、16和24 h取樣,涂板,置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后計數(shù),測定活細胞數(shù),繪制體外殺菌曲線。試驗重復3次。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 通過方差分析對EDTA作用前后黏菌素的MIC進行差異顯著性評估,當P值<0.05時被認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 質粒介導的黏菌素耐藥基因

在85株臨床分離的沙門菌和大腸桿菌中,只檢測到mcr-1基因,擴增片段長度為1626 bp,與預期大小相符(圖1)。其中沙門菌和大腸桿菌中的mcr-1陽性菌株分別有12株和11株(表1),檢出率總計為27.1%(23/85)。沒有檢測到mcr-2～mcr-10的陽性菌株。

M: DNA分子量標準;1～4:臨床分離株的PCR產(chǎn)物;N:陰性對照;P:陽性對照。圖1 部分mcr-1基因的凝膠電泳結果

2.2 藥敏試驗結果

黏菌素對沙門菌、大腸桿菌的MIC范圍見表1。根據(jù)CLSI規(guī)定的折點,以黏菌素MIC≥4 mg/L標準判定為耐藥[15]。對照菌3株奇異變形桿菌和1株摩氏摩根菌對黏菌素天然耐藥(MIC>512 mg/L)。沙門菌的MIC最高達64 mg/L,其MIC50為1 mg/L,MIC90為32 mg/L。大腸桿菌的MIC范圍為0.5～32.0 mg/L,其MIC50、MIC90分別為0.5、8.0 mg/L.

表1 mcr-1檢出情況以及黏菌素對受試菌株的MIC值

表2展示了黏菌素及其與sub-MIC的EDTA聯(lián)用時,對臨床分離菌及對照菌株的抗菌活性。沙門菌和大腸桿菌對黏菌素的耐藥率分別為37.3%(19/51)、29.4%(10/34),耐藥率總計為34.1%(29/85)。EDTA對受試菌株的MIC范圍在125～500 mg/L,表明其體外抑菌作用十分微弱。黏菌素聯(lián)合EDTA后,對沙門菌和大腸桿菌的MIC不同程度地下降,但對奇異變形桿菌和摩氏摩根菌的MIC沒有變化。其中,60 mg/L的EDTA對沙門菌和大腸桿菌黏菌素耐藥率的影響有一定的差異,此濃度的EDTA使大腸桿菌的耐藥率從29.4%降低至2.9%,逆轉了9株大腸桿菌對黏菌素的抗性,但僅逆轉了5株沙門菌對黏菌素的抗性,使其耐藥率從37.3%降低至27.5%。方差分析結果顯示，在EDTA作用前后,黏菌素對分離菌的MIC存在顯著差異(P<0.001)。經(jīng)30 mg/L的EDTA作用后,統(tǒng)計結果顯示P值為0.00439,說明此EDTA濃度對黏菌素的抑菌活性仍有一定的增強作用。15 mg/L EDTA對大部分菌株的MIC基本上不產(chǎn)生影響。聯(lián)合EDTA后，黏菌素對沙門菌標準株JS的MIC降低了2～4倍。由此可見,EDTA對黏菌素的MIC的影響呈濃度依賴性,≥30 mg/L的EDTA可增強除天然黏菌素耐藥菌株之外的臨床分離菌株和標準菌株對黏菌素的敏感性。

表2 黏菌素單用及與不同濃度的EDTA聯(lián)用對臨床分離株和標準株的抗菌活性

2.3 體外殺菌曲線結果

對標準株JS(MIC=1 mg/L)、耐黏菌素的mcr-1陽性菌株CS23(MIC=32 mg/L)和mcr-1陰性菌株CS18(MIC=32 mg/L),分別測定黏菌素(1/2MIC)、EDTA(sub-MIC)及兩藥聯(lián)合的殺菌作用。結果見圖2。在黏菌素單獨作用的前4 h內,3株菌的活菌數(shù)均不同程度地下降,然后開始上升,第8 h后生長速度變慢,最后逐漸趨于平穩(wěn)。單獨使用EDTA基本上沒有抑菌作用,供試菌株的生長趨勢與只有細菌的對照組的生長趨勢基本一致。當黏菌素存在時,EDTA的加入顯著影響了細菌的生長,對于JS和CS18,如圖2a和圖2b所示,在第2 h附近,活菌數(shù)處于最低水平,但之后均開始增加,其中JS在第4 h恢復至單獨黏菌素作用的水平,而CS18則直至第24 h才恢復至單獨黏菌素作用的水平。對于CS23,如圖2c所示,黏菌素聯(lián)合EDTA后,活菌數(shù)始終低于單獨黏菌素作用組,在第8 h后,呈現(xiàn)下降趨勢,且在第8、16 h,活菌數(shù)分別比單獨黏菌素組降低了2和4 log cfu/mL,說明EDTA顯著增強了黏菌素對此菌株的殺菌作用。

圖2 黏菌素、EDTA及兩者聯(lián)用對菌株JS、CS18和CS23的體外殺菌曲線

3 討論與結論

近年來,因用于治療革蘭氏陰性菌感染的碳青霉烯類、頭孢菌素類和氟喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥性普遍提高,黏菌素作為治療革蘭氏陰性菌感染的最后手段被廣泛應用,這使得耐黏菌素的細菌菌株不斷被檢出[16]。本研究報道的85株臨床分離的沙門菌和大腸桿菌中,對黏菌素的耐藥率分別為37.3%(19/51)、29.4%(10/34),mcr-1的陽性率為27.1%(23/85),未檢出mcr-2～mcr-10基因。在23株mcr-1陽性菌株中,有3株對黏菌素不耐藥,說明mcr-1可能在這些菌株中沒有表達或低表達。除此之外,仍有9株mcr-1陰性菌株對黏菌素耐藥,說明除了質粒介導的mcr-1外,其他機制如染色體介導的或非特異性耐藥機制也發(fā)揮著重要作用。在質粒介導的mcr基因被報道以前,染色體介導的雙組分信號轉導系統(tǒng)被認為是介導黏菌素耐藥的主要機制,這一機制是由相關基因如pmrAB、phoPQ、mgrB和pmrD等發(fā)生突變或表達量變化而引起外膜類脂A的糖化(Ara4N化)或乙醇胺化(pETN化)修飾,繼而使LPS的負電荷減少,最終導致陽離子黏菌素與細菌外膜陰性LPS的親和力降低,使細菌耐藥[17]。

本研究的聯(lián)合藥敏試驗結果表明,對于黏菌素天然耐藥菌奇異變形桿菌和摩氏摩根菌,聯(lián)用sub-MIC的EDTA對黏菌素的MIC不產(chǎn)生影響,這可能與菌株天然耐藥的不同機制有關。但有效的EDTA濃度可使黏菌素對大腸桿菌和沙門菌的MIC降低,導致菌株的耐藥率下降,且無論對于質粒介導的黏菌素抗性菌株還是由其他機制介導的黏菌素抗性菌株,EDTA均可增強其對黏菌素的敏感性,這可能是因為EDTA螯合Ca2+與Mg2+引起的外膜解離和滲透作用增強了藥物的抗菌效力[8],其具體分子機制有待研究。本試驗結果表明:EDTA濃度越高，其增效作用越強,其增強黏菌素抑菌活性的作用呈現(xiàn)濃度依賴性。體外殺菌曲線表明:黏菌素聯(lián)合EDTA后,細菌的生長受到明顯抑制,雖然抑制程度在不同菌株之間存在一定差異,但仍能清楚地證實EDTA可增強黏菌素對分離菌株的抗菌活性,且對mcr-1陽性和mcr-1陰性菌株的作用相同,表明其作用不受不同獲得性耐藥機制的影響。統(tǒng)計學分析結果顯示:60 mg/L或30 mg/L的EDTA作用前后,黏菌素對受試菌株的MIC差異顯著。說明≥30 mg/L的EDTA可有效增強黏菌素的抗菌活性。EDTA對黏菌素抗菌活性的增強也表明:外膜屏障作用介導的非特異性耐黏菌素機制可能占據(jù)著不可或缺的地位,與質粒介導的mcr-1或染色體介導的雙組分系統(tǒng)共同導致了菌株對黏菌素的高水平耐藥。

隨著多重耐藥菌株的不斷增加,單一抗菌藥的療法也面臨著巨大挑戰(zhàn),因此使用抗菌藥與抗菌增效劑結合的療法可在一定程度上緩解日益嚴重的耐藥問題,從而進一步增強抗菌藥物的療效。本研究從表型上證實了EDTA可增強不同耐藥機制的沙門菌和大腸桿菌對黏菌素的敏感性,為臨床上潛在藥物如EDTA的應用提供了重要參考,但還需要進一步的研究來探索EDTA在體內的劑量和安全性。