趙會納,曾隕濤,雷 波,蔡 凱,蔡 斌,余世洲,余 婧,許本波

(1.貴州省煙草科學(xué)研究院,貴州 貴陽 550081;2.中國煙草總公司 貴州省公司,貴州 貴陽 550004;3.長江大學(xué),湖北 荊州 434023)

煙堿、蛋白質(zhì)、氨基酸、葉綠素是煙葉中的主要含氮化合物[1-2],這些化合物不僅具有重要的生理功能,還與煙葉品質(zhì)密切相關(guān)[3-4]。煙堿和總氮等含量受生態(tài)、品種、栽培等多種因素的影響[4-5],其中生態(tài)條件的影響大于品種和栽培措施[5-6],而氣候是最重要的生態(tài)因子[7]。貴州部分煙區(qū)在烤煙旺長期少雨寡日照,存在中度或重度伏旱,成熟后期低溫多雨,對煙葉產(chǎn)質(zhì)量造成了不利影響。調(diào)整移栽期是煙葉生產(chǎn)適應(yīng)生態(tài)因子的關(guān)鍵措施[8],通過調(diào)整移栽期,合理利用氣候資源,可以促進烤煙優(yōu)質(zhì)適產(chǎn)[9],減少不利氣候?qū)熑~產(chǎn)質(zhì)量的影響。

目前,已有一些關(guān)于移栽期對煙株生長、煙葉品質(zhì)、經(jīng)濟性狀影響的研究報道[8-12],但關(guān)于釆烤前煙葉含氮物質(zhì)尤其是氨基酸和葉綠素的研究還鮮有報道。氨基酸具有重要的生理功能,參與調(diào)控?zé)煵輧?nèi)的能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化[2],如氨基酸參與構(gòu)成酶、激素,轉(zhuǎn)變成糖或脂肪,可以平衡氮含量[13]。天門冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、脯氨酸直接參與煙草根系內(nèi)的煙堿合成代謝[14]。脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),在逆境脅迫時積累增多[15-18]。此外,在調(diào)制過程中,游離氨基酸與糖發(fā)生棕色化反應(yīng),生成多種對煙葉香味品質(zhì)有重要貢獻的雜環(huán)化合物[4]。釆烤前正是煙葉落黃成熟即將收獲時的狀態(tài),煙葉的光合能力迅速減弱但分解能力增強,葉綠素含量迅速降低,煙葉顏色由綠轉(zhuǎn)黃,組織逐步變得疏松,煙葉內(nèi)化學(xué)成分趨于協(xié)調(diào),此時煙葉處于工藝成熟期,是成熟衰老過程中的一個階段[19]。此外,煙葉中的煙堿、總氮含量在烘烤過程中變化不大[20-21],還可直接反映烤后煙葉品質(zhì)。因此研究煙葉釆收時的基礎(chǔ)物質(zhì)組成和生理代謝具有重要意義。本試驗采用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)法結(jié)合方差分析,篩選了不同移栽期煙葉的差異含氮物質(zhì),并將其與關(guān)鍵生育期的光、溫和水條件進行了相關(guān)分析,探討了影響差異含氮物質(zhì)含量的氣候因子,以期為烤煙移栽期的調(diào)整、優(yōu)質(zhì)煙葉種植環(huán)境的選擇,以及煙葉的生理代謝研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為K326,按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙栽培技術(shù)進行生產(chǎn)管理。試驗在貴州省黔東南州天柱縣平甫進行。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)置3個移栽期處理:T1(3月31日移栽)、T2(4月28日移栽)、T3(5月31日移栽)。每個處理3次重復(fù),小區(qū)隨機排列。每個小區(qū)植煙80株(8行,每行10株),留葉數(shù)為每株18片。

1.3 樣品采集

在中部煙葉成熟時,采集長勢相同的煙株的中部煙葉(從下往上第9葉位),去除主脈后迅速放入液氮中帶回實驗室,每個處理取12片葉片,每4片煙葉混勻為1個重復(fù),共3個重復(fù),冷凍干燥后用于含氮物質(zhì)含量的測定。3個移栽期煙葉樣品的采集日期分別為7月19日、8月5日、9月6日。

1.4 含氮化合物含量的測定

煙堿[22]、蛋白質(zhì)含量的測定[23]采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；可溶性蛋白質(zhì)含量的測定采用南京建成科技有限公司的總蛋白測定試劑盒(考馬斯亮藍法)A045-2；氨基酸和銨離子含量的測定參照文獻[24]中的方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件進行相關(guān)分析、方差分析和多重比較,其中多重比較采用Duncan氏法。采用Simca-p 13.0軟件進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)。采用HemI 1.0.3軟件進行熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同移栽期的氣象條件分析

由圖1B可以看出,從3月下旬至9月上旬,氣溫總體呈先持續(xù)增加后小幅降低的變化趨勢。由圖1A可以看出：T1處理的烤煙從生根期到成熟期(3月31日～7月19日)的平均氣溫持續(xù)增加；T2處理的烤煙從生根期到旺長期(4月28日～6月26日)的平均氣溫持續(xù)增加,之后略有降低；T3處理的烤煙在3個關(guān)鍵生育期(5月31日～9月6日)的平均氣溫整體較高且平穩(wěn)。

由圖2B可以看出,從5月下旬至6月中旬,有明顯降雨。由圖2A可以看出：T1處理從旺長期到成熟期(5月5日～7月19日)平均日降雨量有明顯增加；T2處理在旺長期(6月2日～6月26日)平均日降雨量較多,而在生根期(4月28日～6月1日)和成熟期(6月27日～8月5日)平均日降雨量較少；T3處理在旺長期(7月5日～8月4日)平均日降雨量較少,在生根期(5月31日～7月7日)和成熟期(8月5日～9月6日)平均日降雨量較多。

由圖3B可以看出,從4月下旬至6月上旬,日照時數(shù)較少。由圖3A可以看出：T1處理從生根期到旺長期(3月31日～5月29日)平均日照時數(shù)明顯減少,之后至成熟期(5月30日～7月19日)有所增加；T2和T3處理從生根期至成熟期(分別是4月28日～8月5日和5月31日～9月6日)平均日照時數(shù)持續(xù)增加。

總降雨量的變化規(guī)律(見圖4)和日降雨量的變化規(guī)律(見圖2)一致。T1處理從旺長期到成熟期(5月5日～7月19日)的總降雨量有明顯增加。T2處理在旺長期(6月2日～6月26日)的總降雨量較多,在生根期(4月28日～6月1日)和成熟期(6月27日～8月5日)較少。T3處理在旺長期(7月5日～8月4日)的總降雨量較少,在生根期(5月31日～7月7日)和成熟期(8月5日～9月6日)較多。

A圖是3個移栽期處理在關(guān)鍵生育期的平均氣溫,其中生根期指移栽后0～35 d，旺長期指移栽后36～60 d，成熟期指移栽后61 d～成熟采收，下同。B圖是3月下旬～9月上旬的氣溫。圖1 不同移栽期的日均氣溫分析

A圖是3個移栽期處理在關(guān)鍵生育期的平均日降雨量。B圖是3月下旬～9月上旬的日降雨量。圖2 不同移栽期的日降雨量分析

由圖5B可以看出,4月下旬至6月上旬,總?cè)照諘r數(shù)較少。由圖5A可以看出,T1處理從生根期到旺長期(3月31日～5月29日)總?cè)照諘r數(shù)減少,之后至成熟期(5月30日～7月9日)有較大幅度增加。T2和T3處理從生根期至旺長期(分別是4月28日～6月26日和5月31日～8月4日)總?cè)照諘r數(shù)有小幅增加,至成熟期(分別是8月5日和9月6日)有較大的增加。

2.2 不同移栽期烤煙主要含氮化合物含量的差異分析

對中部煙葉樣品的含氮物質(zhì)數(shù)據(jù)進行了主成分分析(PCA),從圖6可以看出,移栽期對煙葉含氮物質(zhì)的影響較大,每個移栽期的樣品各自聚在一起。采用偏最小二乘-判別分析并結(jié)合非參數(shù)檢驗篩選不同移栽期的差異含氮物質(zhì)。

圖6 中部煙葉含氮物質(zhì)主成分散點圖

A圖是3個移栽期處理在關(guān)鍵生育期的平均日照時數(shù)。B圖是3月下旬～9月上旬的日照時數(shù)。圖3 不同移栽期的日照時數(shù)分析

A圖是3個移栽期處理在關(guān)鍵生育期的總降雨量。B圖是3月下旬～9月上旬的旬降雨量。圖4 不同移栽期的總降雨量分析

采用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)法將3個移栽期處理烤煙樣品的含氮物質(zhì)數(shù)據(jù)進行兩兩比較,分別篩選出VIP>1.0的差異物質(zhì)。由變量載荷圖(圖7)可以看出：T1和T2處理間煙葉的差異物質(zhì)是總氮、煙堿、游離態(tài)煙堿、蛋白質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)、谷氨酸、絲氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、葉綠素、蘇氨酸、γ-氨基丁酸和蛋氨酸;T1和T3處理間煙葉的差異物質(zhì)是葉綠素、精氨酸、蛋氨酸、游離態(tài)煙堿、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、色氨酸、組氨酸、精氨酸、纈氨酸和瓜氨酸；T2和T3處理間煙葉的差異物質(zhì)是總氮、可溶性蛋白質(zhì)、瓜氨酸、色氨酸、精氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、組氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天門冬酰胺、亮氨酸、絲氨酸、銨離子及蘇氨酸。

2.3 移栽期對主要含氮化合物含量的影響

從方差分析結(jié)果(表1)可以看出,移栽期對中部煙葉的煙堿、總氮、可溶性蛋白質(zhì)、葉綠素、谷氨酸等20種含氮化合物的含量有極顯著的影響(P<0.01),對天冬氨酸、天門冬酰胺、蘇氨酸、亮氨酸含量有顯著的影響(P<0.05),對蛋白質(zhì)和銨離子含量的影響不顯著。

A圖是3個移栽期處理在關(guān)鍵生育期的總?cè)照諘r數(shù)。B圖是3月下旬～9月上旬的旬日照時數(shù)。圖5 不同移栽期的總?cè)照諘r數(shù)分析

將P<0.01且VIP>1.0的差異含氮物質(zhì)含量進行多重比較(表1),可以看出,T2處理煙葉的含氮物質(zhì)(銨離子除外)含量均最低,其中煙堿、總氮、蛋白質(zhì)、絲氨酸、天門冬酰胺、組氨酸、瓜氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、正亮氨酸和色氨酸含量均顯著低于T1和T3處理的煙葉。

表1 初步篩選的差異含氮物質(zhì)含量的方差分析和多重比較結(jié)果(VIP值>1.0)

2.4 含氮化合物與氣象條件相關(guān)分析

由圖8可以看出:在T1煙葉中含量較高的總氮、煙堿、游離態(tài)煙堿、葉綠素、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸、絲氨酸與生根期的日照時數(shù)、總?cè)照諘r數(shù)及成熟期的日降雨量、總降雨量呈顯著正相關(guān),與成熟期的日照時數(shù)和氣溫呈顯著負相關(guān);在T3煙葉中含量較高的可溶性蛋白質(zhì)、組氨酸、纈氨酸、精氨酸、色氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、蛋氨酸與生根期的日降雨量、總降雨量以及成熟期的總?cè)照諘r數(shù)呈顯著正相關(guān),與旺長期的日降雨量和總降雨量呈顯著負相關(guān)。

A圖為T1和T2間比較；B圖為T1和T3間比較；C圖為T2和T3間比較。圖7 不同移栽期處理中部煙葉樣品的含氮物質(zhì)載荷圖(Loadingplot)

圖8 煙葉樣品差異含氮物質(zhì)與氣象條件間的相關(guān)系數(shù)熱圖

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明：3月31日移栽的煙葉中的煙堿、葉綠素、脯氨酸、蛋白質(zhì)含量較高,這些含氮物質(zhì)與生根期的日照時數(shù)、總?cè)照諘r數(shù)以及成熟期的日降雨量、總降雨量呈顯著正相關(guān),與成熟期的日照時數(shù)和氣溫存在顯著負相關(guān)；5月31日移栽的煙葉中的煙堿、蛋白質(zhì)和天冬酰胺含量較高,這些物質(zhì)與生根期的降雨量以及成熟期的總?cè)照諘r數(shù)呈顯著正相關(guān),與旺長期的降雨量存在顯著負相關(guān)；4月28移栽的煙葉的煙堿和總氮含量較為適宜,分別為2.72%和1.84%,其蛋白質(zhì)、葉綠素和多數(shù)氨基酸含量均較低。相關(guān)研究顯示:煙葉的葉綠素在燃吸時會產(chǎn)生明顯的青雜氣和刺激性[25]。蛋白質(zhì)和多數(shù)氨基酸含量與煙葉品質(zhì)存在穩(wěn)定的負相關(guān)關(guān)系[26]；蛋白質(zhì)、脯氨酸和天冬酰胺對卷煙煙氣中氰化氫和氨的累計貢獻率接近90%,會影響煙葉的安全性[27-28]。因此,從煙葉的含氮物質(zhì)含量和安全性來看,4月28日移栽對煙葉品質(zhì)形成更為有利。這可能與4月28日移栽的氣象條件有關(guān),4月28日移栽的烤煙從生根期至成熟期的氣溫在21～25 ℃,在旺長期降水量較多,在成熟期日照時數(shù)較多,有利于煙株的生長和優(yōu)質(zhì)煙葉品質(zhì)的形成[29-32]。3月31日和5月31日移栽的烤煙在需水量最多的旺長期降雨量較少,不利于煙株生長；而在成熟期降雨又較多，易造成煙葉貪青晚熟,煙葉的物質(zhì)轉(zhuǎn)化不充分,對煙葉產(chǎn)質(zhì)量造成不利影響。因本試驗為1年單點試驗,所得結(jié)果可能還存在一定的局限性,因此今后擬結(jié)合初烤煙葉的化學(xué)成分、感官質(zhì)量等,進一步探討更有利于優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的適宜移栽期。