李正 陳翊 王玉 張玉 張麗

（1.杭州市余杭區(qū)疾病預(yù)防控制中心 浙江杭州 311100；2.安徽省蕪湖市第一中學(xué))

1 前言

有機(jī)磷農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)上廣泛應(yīng)用的殺蟲劑，會(huì)對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和血液系統(tǒng)等產(chǎn)生不同程度的毒副作用，使人體出現(xiàn)中毒癥狀，甚至?xí)T發(fā)癌癥，危害生命[1，2]。 目前，檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的方法主要有色譜法[3，4]、光譜法（如紅外分光光度法[5]、紫外分光光度法[6]）、快速檢測(cè)法[7]（酶抑制法、納米粒子-酶生物傳感器法）等。

本文通過(guò)靜電吸附依次將聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、金核鉑殼納米粒子（Au@Pt）、PVP、乙酰膽堿酯酶修飾到玻碳電極（GC CME）上，得到乙酰膽堿酯酶（AChE）/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME，考察Au@Pt 雙金屬納米粒子對(duì)硫代乙酰膽堿的電催化反應(yīng)，并用該電極測(cè)定磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中的甲基對(duì)硫磷。

2 試驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

儀器：KQ218 型超聲波清洗儀 （昆山市超聲儀器有限公司）；電化學(xué)分析儀（上海辰華儀器公司CHI604E 型）。

試劑：四水合氯化金（HAuCl4·4H2O）、氯鉑酸（H2PtCl6·6H2O）、檸檬酸鈉、PVP(均為 AR，國(guó)藥集團(tuán))； PBS 緩沖溶液：磷酸一氫鈉（Na2HPO4）+磷酸二氫鈉（NaH2PO4）+氯化鉀（KCl）；氯化乙酰硫代膽堿（ATCl）、AChE（C3899，500 U/mg，Sigma 公司）；甲基對(duì)硫磷（濃 100 mg/L，美國(guó) o2si 公司）。

HAuCl4·4H2O 與 H2PtCl6·6H2O 儲(chǔ)備液：將 0.5 g HAuCl4·4H2O 和 0.5 g HAuCl6·6H2O 分別溶解于水，定容至50 mL。

2.2 AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME 的制備

2.2.1 Au@Pt 核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的制備

將 100 mL 含 0.01 g 的 HAuCl·44H2O 與 3 mL 1%的檸檬酸鈉攪拌混合均勻，然后加熱回流，即得到平均直徑為13 nm 的金納米粒子[8]。 吸取一定濃度的H2PtCl6·6H2O 和適量上述制備的納米金晶種混合均勻，加入少許新配置的抗壞血酸溶液，在30℃～50℃溫度下攪拌15 min，溶液由原來(lái)的淡紅色變?yōu)樽睾谏吹玫紸u@Pt 核殼結(jié)構(gòu)納米粒子。

2.2.2 AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME 自組裝修飾電極的制備

將玻碳電極在2000 目的金相砂紙上打磨，再用氧化鋁（Al2O3）粉拋光至鏡面，沖洗干凈后，超聲清洗。 在一定范圍內(nèi)電位下循環(huán)伏安掃描約30 圈，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖。

將預(yù)處理好的GC CME 在飽和PVP 乙醇溶液中浸泡12 h 后，用水沖洗，再將此電極置于核殼結(jié)構(gòu)納米粒子溶液中，用電極掃描100 圈，沖洗干凈后修飾一層Au@Pt，即得到自組裝電極——Au@Pt/PVP/GC CME。再將此電極在飽和PVP 乙醇溶液中浸泡12 h，用去離子水洗凈，晾干，并在該電極表面滴涂一定濃度的AChE，得到AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME，電極修飾示意詳見(jiàn)圖1。

圖1 AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME 自組裝示意圖

3 結(jié)果

3.1 AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME 對(duì) ATCl 的電化學(xué)反應(yīng)

將制得的AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME 放入pH=7.4 的 PBS 緩沖溶液中，在電位為 0.2～0.9 V 進(jìn)行微分脈沖伏安掃描，結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

由圖2 可知，在0.5 V 左右出現(xiàn)一個(gè)氧化峰，這是AChE 水解PBS 中的底物ATCl 產(chǎn)生硫代膽堿（巰基膽堿），而巰基在正電壓下被氧化所致。 核殼結(jié)構(gòu)納米粒子對(duì)ATCl 的氧化峰電流響應(yīng)最大（圖2c）。當(dāng)AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME 受到一定濃度的甲基對(duì)硫磷農(nóng)藥的抑制后，峰電流相應(yīng)變?。▓D2d、2e）。

3.2 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

試驗(yàn)表明，當(dāng)PBS 的pH 為7.0 時(shí)，測(cè)得底物的氧化電流最大，說(shuō)明在中性溶液中酶的活性最大，所以本試驗(yàn)選擇pH=7.0 的PBS 溶液作為底液。將AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME 在含 5×10-5mol/L 的甲基對(duì)硫磷溶液中浸泡不同時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)隨著浸泡時(shí)間的增加，酶所受的抑制率逐漸增加，在15 min 后抑制率趨于平衡狀態(tài)，所以本試驗(yàn)選擇甲基對(duì)硫磷的浸泡時(shí)間為15 min。

圖2 不同電極在相同底液中的微分脈沖伏安圖

3.3 AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GCE CME 對(duì)甲基對(duì)硫磷濃度的測(cè)定

隨著有機(jī)磷濃度的增加，AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME 對(duì)底物ATCl 的氧化電流減弱（圖3），經(jīng)計(jì)算并作圖（圖4），發(fā)現(xiàn)在 1.5×10-5～1.0×10-3mol/L 酶抑制率與有機(jī)磷農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)成正比關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R≥0.998。該電極對(duì)PBS 中甲基對(duì)硫磷的檢出限達(dá) 5.0×10-6mol/L。

圖3 AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME 對(duì)不同濃度甲基對(duì)硫磷的微分脈沖伏安圖

圖4 酶抑制率（百分?jǐn)?shù)）與有機(jī)磷農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)關(guān)系圖

3.4 AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME 的穩(wěn)定性與選擇性

為了考察所修飾電極的穩(wěn)定性，使用AChE/PVP/Au@Pt/PVP/GC CME 在含 5×10-5mol/L甲基對(duì)硫磷的PBS 中浸泡15 min 后，對(duì)一定濃度的 ATCl 進(jìn)行平行測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.5%，該電極具有良好的重復(fù)性。 將修飾電極在冰箱里保存，每隔3 d 對(duì)ATCl進(jìn)行測(cè)定，其峰電流沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明電極的穩(wěn)定性良好。在優(yōu)化的條件下，考察了未知樣品中可能存在的離子對(duì)甲基對(duì)硫磷的干擾，結(jié)果表明，0.2 mol/L的鈉離子（Na+）、鎂離子（Mg2+）、銅離子（Cu2+）、鋅離子（Zn2+）、鈣離子（Ca2+）、硫酸根離子（SO42-）、硝酸根離子（NO3-）和磷酸根離子（PO43-）對(duì) 5×10-5mol/L 甲基對(duì)硫磷的測(cè)定基本沒(méi)有干擾。

4 結(jié)論

本文研究了Au@Pt 核殼納米粒子修飾的酶電極在中性PBS 介質(zhì)中對(duì)甲基對(duì)硫磷的測(cè)定。 研究發(fā)現(xiàn)，Au@Pt 納米修飾電極比單獨(dú)納米金和納米鉑修飾電極對(duì)ATCl 具有更加顯著的催化水解性能，說(shuō)明納米金和納米鉑具有一定的協(xié)同催化能力。 雙金屬納米粒子修飾電極測(cè)定甲基對(duì)硫磷具有良好的穩(wěn)定性和選擇性，且具有較寬的線性范圍和較低的檢出限。