蔣麗婷 孫浩洋 趙培靜 周廣彪 楊礎(chǔ)華 梁希揚

（1.廣州市微生物研究所有限公司（廣州工業(yè)微生物檢測中心） 廣東廣州 510663；2.廣東省海洋工程職業(yè)技術(shù)學(xué)校；3.汕頭海關(guān)）

1 前言

霍亂弧菌是一種革蘭陰性菌，在蝦、蟹、牡蠣等甲殼類及貝類水生動物中廣泛存在，可引起烈性腸道傳染病霍亂，發(fā)病急、傳染性強且病死率高，曾在世界上引發(fā)多次大流行，是對人類危害極大的一種食源性致病菌[1，2]。 1817 年至今，歷史上共發(fā)生 7 次霍亂大流行，造成數(shù)百萬人的死亡，霍亂被列入國際檢疫傳染病，在我國被列為甲類法定傳染病。 霍亂在我國南方相對多發(fā)，政府每年都會投入大量的人力、物力進行霍亂防控，因此霍亂弧菌的快速、高效檢測在公共衛(wèi)生防疫方面具有極其重要的意義[3，4]。

目前，傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)鑒定法仍是霍亂弧菌檢測的主要方法，先增菌培養(yǎng)后結(jié)合生化及血清學(xué)方法進行鑒定，這種方法雖然檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但卻存在操作煩瑣、檢測效率與檢測靈敏度低、檢測目標(biāo)單一且耗時長等缺點，為實現(xiàn)霍亂弧菌等致病菌的快速檢測，技術(shù)人員建立了酶聯(lián)熒光免疫檢測法、膠體金試紙條法、API 生化鑒定試紙條法、實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增（LAMP）等方法。其中，實時熒光PCR 及其他相關(guān)的改良方法如雙啟動寡核苷酸引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（DPO-PCR）法等以其靈敏度高、操作簡便快捷等顯著優(yōu)勢，近年來在霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌等致病菌的檢測中，得到越來越廣泛應(yīng)用[5]，但是熒光檢測相關(guān)設(shè)備存在售價偏高、引物探針設(shè)計要求較高、產(chǎn)物片段偏小等缺陷，在很大程度上限制了其推廣應(yīng)用，基層實驗室及非實驗室環(huán)境下現(xiàn)場檢測的推廣應(yīng)用更是受到了極大限制。

重組酶聚合酶擴增技術(shù)（RPA）是繼LAMP 之后的另一種等溫核酸擴增技術(shù)，具有反應(yīng)時間短、恒溫實現(xiàn)核酸的解鏈和退火、檢測結(jié)果易辨識等優(yōu)點[6]。本研究擬根據(jù)編碼霍亂弧菌外膜蛋白（ompW）的基因保守序列，設(shè)計霍亂弧菌RPA 檢測引物，構(gòu)建了一種霍亂弧菌的RPA 檢測手段，并驗證該方法的靈敏度、特異性，從而建立一種高效簡便、靈敏度高、特異性強并適用于現(xiàn)場應(yīng)用檢測的技術(shù)方法。

2 試驗部分

2.1 材料與儀器

材料：霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、金黃色葡萄球菌、河流弧菌、大腸埃希菌、溶藻弧菌、沙門菌、哈維弧菌、單增李斯特菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株（中國科學(xué)院水生生物研究所）；電泳級瓊脂糖、DNA Marker 及顯色劑（寶生物大連生物技術(shù)有限公司）；RPA 擴增試劑盒（TwistDX 公司）；DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

儀器：核酸蛋白分析儀（ND-1000，Thermo fisher公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-1600，天能公司）；PCR擴增儀（Veriti，ABI 公司）；電泳儀（DYY-6C，北京六一生物科技有限公司）。

2.2 試驗方法

2.2.1 基因組DNA 提取

按照傳統(tǒng)國家標(biāo)準(zhǔn)方法先對標(biāo)準(zhǔn)菌株進行復(fù)壯增菌及生化鑒定， 再參照檢測試劑盒中的操作流程，提取上述增菌液的基因組DNA，最后再使用核酸蛋白分析儀對DNA 純度及濃度進行測定，并統(tǒng)一稀釋至 100 ng/μL 備用。

2.2.2 引物設(shè)計

參照RPA 的引物設(shè)計操作方法，結(jié)合霍亂弧菌ompW 基因的保守序列，采用引物設(shè)計軟件（Oligo V6.22），對引物進行設(shè)計和篩選，再采用NCBI 的引物設(shè)計和特異性檢測工具（Primer Blast），對入選的序列進行特異性確認(rèn)，委托上海生物工程技術(shù)有限公司進行合成[7]。 最終設(shè)計檢測霍亂弧菌RPA 檢測引物的擴增產(chǎn)物為280 bp，具體序列為：上游引物：5′- GAAGGTGACTTTATTGTGCGCGCGGGTATTGCC-3′；下游引物：5′-CACCAAAGTAGTATTGGACCAT AAAGGTAGGT-3′。

2.2.3 方法建立

以提取的標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA 為模板，采用設(shè)計的引物進行RPA 擴增，陰性對照為超純水，測定在恒溫（37℃）及 30、40、50、60 min 反應(yīng)時長下的擴增效果。

配制RPA 擴增體系方法為：將再水化緩沖液29.5μL，上、下游引物各 2μL（終濃度為 0.4μmol/L），去離子水 12.5 μL 以及模板 DNA 1 μL 分別加入含有0.2 mL 凍干酶粉的Twist Amp 反應(yīng)管中，最后加入醋酸鎂溶液 2.5 μL（280 mmol/L）。

反應(yīng)結(jié)束后，將50 μL 苯酚/氯仿溶液加入到RPA擴增產(chǎn)物中，充分混勻，然后在12 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心2 min，取5 μL 上清液點樣于1.5%瓊脂糖凝膠，使用1×TBE 緩沖液在5 V/cm 條件下進行恒壓電泳40～60 min，最終在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

2.2.4 特異性評價

按照RPA 檢測方法，對11 種標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA 進行檢測，并評價所建立RPA 檢測方法的特異性。

2.2.5 靈敏度評價

將提取的霍亂弧菌基因組DNA 進行10 倍梯度稀釋（稀釋成5 個稀釋度），并以稀釋后的DNA 為模板，按照RPA 檢測方法進行方法靈敏度測試，并與魏霜等[8]建立的檢測霍亂弧菌的DPO-PCR 方法進行靈敏度比較，引物序列ompW-F：5′-CGCTCCTGT ATTTGCTCACCAAGIIIIIGACTTTATTGTG-3′；ompW-R：5′-GAGCATTAATCAAAGCCAACGTTAIIIIIAAGT CCCCAT-3′，擴增產(chǎn)物長度為 463 bp。

2.2.6 應(yīng)用效果評價

選取水質(zhì)監(jiān)控樣本及金昌魚、凍鳳尾對蝦、凍蝦仁、活青蟹、凍牡蠣檢測留樣樣品50 份（其中霍亂弧菌陽性樣品5 份），按照建立方法對霍亂弧菌進行檢測，以結(jié)果的一致性來評價方法的應(yīng)用效果。

3 結(jié)果

3.1 RPA 檢測方法的構(gòu)建

按照RPA 檢測方法，測得的不同擴增時長的RPA 檢測效果詳見圖1。檢測結(jié)果顯示，檢測時長在40 min 時就可以達到比較理想的擴增效果，ompW擴增條帶與預(yù)期目的條帶的大小一致，約280 bp，而超純水陰性對照沒有條帶，結(jié)果表明，ompW 基因通過采用建立的RPA 檢測體系可以被準(zhǔn)確檢測到。

3.2 RPA 檢測方法的特異性評價

從ompW 的RPA 特異性評價結(jié)果可以看出，霍亂弧菌可以檢測到280 bp 的特異性條帶，而副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、金黃色葡萄球菌等其他10 株標(biāo)準(zhǔn)菌株均未檢測到條帶，說明該方法特異性較強，詳見圖2。

圖1 RPA 技術(shù)檢測ompW 基因的擴增時長結(jié)果

圖2 ompW 基因的RPA 特異性檢測結(jié)果

3.3 RPA 檢測方法的靈敏度評價

RPA 檢測方法的靈敏度測試結(jié)果詳見圖3。 結(jié)果表明，在反應(yīng)時間為40 min，DNA 含量為0.1 ng 時，RPA 檢測方法可以檢測到280 bp 大小的目的條帶，該靈敏度結(jié)果與魏霜等建立的檢測霍亂弧菌owpW 基因的DPO-PCR 方法一致；而在DNA 的含量為0.01 ng時，RPA 方法與PCR 方法都不能擴增到目的條帶，這種結(jié)果表明，RPA 檢測方法可以實現(xiàn)與PCR 檢測方法相當(dāng)?shù)撵`敏度。

3.4 RPA 檢測方法的應(yīng)用效果

采用建立的RPA 檢測方法， 對50 份留樣樣品進行檢測， 檢測結(jié)果表明，RPA 檢測方法與傳統(tǒng)增菌培養(yǎng)及生化鑒定結(jié)果完全一致，表明RPA 方法測定霍亂弧菌結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)用效果良好。

4 討論

圖3 ompW 基因的RPA 檢測靈敏度

周廣彪、凌莉等[9，10]曾采用 RPA 技術(shù)建立針對擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌特異性基因的檢測方法，并對樣品進行了應(yīng)用測試，結(jié)果表明該方法在靈敏度、特異性及應(yīng)用檢測等方面都能較好實現(xiàn)預(yù)期效果。 為測定RPA 檢測方法對其他致病菌的檢測效果，以更好應(yīng)用于水生動物及其加工制品多種致病菌的檢測和監(jiān)控監(jiān)測，本研究進行了霍亂弧菌的RPA 檢測的研究，并同時進行了應(yīng)用效果的驗證。

靈敏度及特異性是評價檢測方法優(yōu)劣的關(guān)鍵性參數(shù)，本研究建立的RPA 檢測方法特異性強，靈敏度與普通PCR 方法及LAMP 方法相當(dāng)， 但RPA 方法相比普通PCR 方法，反應(yīng)更為快速，且該方法無需依賴PCR 儀，更易滿足基層單位和現(xiàn)場檢測的需要。 而相比于LAMP，RPA 技術(shù)的引物設(shè)計難度更小、產(chǎn)物片段單一，且便于后續(xù)進行測序確證，因而具有更高的使用價值。

RPA 技術(shù)作為一種新興檢測手段，在發(fā)展過程中還存在一些地方需要完善，例如，試劑成本相對較高，對蛋白活性要求較高，且在電泳前需純化去除蛋白等。 但RPA 技術(shù)作為一種后起的核酸擴增技術(shù)，由于其方便快捷、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，正被越來越多得用于病原體檢測及食品安全性檢測等領(lǐng)域，具有廣闊的技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用前景。