李明昊，李小成，劉丹丹，張 瓊，吳杰穎，田玉鵬

(安徽大學 化學化工學院，安徽 合肥 230601)

applications

多光子吸收是一種非線性光學(NLO)過程.在這種過程中，多個光子被同時吸收，以達到激發(fā)態(tài)，然后在一定條件下回落到基態(tài)[1].近20年來，多光子吸收材料已廣泛應用于生物成像、光動力學治療、上轉(zhuǎn)換激光、三維光學數(shù)據(jù)存儲和光學極限等領域[2-4].在生物成像應用領域，與大多數(shù)常見的單光子熒光探針相比，具有較大斯托克斯位移的多光子熒光探針具有很大的優(yōu)勢[5]，因為在近紅外第二窗口中可以使用1 000～1 700 nm的激發(fā)波長，這在生物成像中提供了更高的空間分辨率和對比度，以及較高的光物理穩(wěn)定性和較低的組織損傷[6].

線粒體(mitochondrion)是細胞的“能量工廠”，它是由兩層膜包裹的細胞器，是細胞有氧呼吸的重要場所.線粒體除了為細胞供能外，還參與細胞的新陳代謝，擁有調(diào)控細胞周期和細胞生長的能力[7-8].所以通過對細胞線粒體狀態(tài)的檢測，可以準確對機體進行疾病診斷和治療[9-11]，探索高效低毒性的線粒體熒光探針得到了研究者的關注[12-15].目前研究的線粒體探針主要是小分子熒光探針，并且多是單光子熒光探針，這類探針與上述多光子探針的特點相比，存在一定的局限性.因此，開發(fā)一種親生物、光穩(wěn)定性好且長波段激發(fā)的多光子熒光探針尤為必要.

1 實驗部分

1.1 試 劑

N,N-二甲基甲酰胺，N, N-二丁基苯胺，三氯氧磷，2-乙?；拎ぃ瑲溲趸?，氨水，六水合硝酸鋅，α-噻吩甲?；燃淄?，四氫呋喃，乙腈，二甲基亞砜，以上試劑均為分析純，使用前按標準方法純化.

1.2 儀 器

1H-NMR和13C-NMR分別在Bruker Avance 400 MHz和100 MHz核磁共振光譜儀上記錄；質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Micro-mass GCT-MS記錄(ESI源)；紫外可見吸收光譜使用SPECORD S600分光光度計測定；單光子發(fā)射熒光光譜(SPEF)使用日立F-7000熒光分光光度計進行；雙光子熒光光譜(2PEF)使用飛秒激光脈沖鈦寶石系統(tǒng)測定 (Chameleon Ultra II, 680～1 080 nm, 80 MHz, 140 fs) (熒光素作為參比溶液)；三光子吸收光譜(3PA)使用飛秒激光脈沖鈦寶石光學參量振蕩器系統(tǒng)測定(Chameleon Compact OPO, 1 100～1 600 nm, 140 fs)；Hela細胞的激光共聚焦顯微成像使用Zeiss LSM 710 META正置共聚焦激光掃描顯微鏡獲得；圖像數(shù)據(jù)的采集和處理使用Zeiss LSM Image Browser，Zeiss LSM Image Export和Image J.

1.3 MTT

細胞毒性運用MTT的方法進行檢測.將人宮頸癌細胞(HeLa)種于96孔板中，每個孔種5×103個細胞，待細胞貼壁后，設置2個一樣的實驗組.使用DMSO溶解配合物配置成濃度為1×10-3mol·L-1的母液，測試時用DMEM∶DMSO=99∶1比例稀釋成1×10-5mol·L-1,分別加入5，10，15，20 μL的體積梯度，每組設置6個平行，每孔加培養(yǎng)基至100 μL，空白組中加入純培養(yǎng)基做對照，加樣后置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 18 h 后，將其中一組置于紫外燈下進行光照，30 s一次，共照5 min，再置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后用 MTT 比色法進行檢測.

1.4 細胞培養(yǎng)

將人宮頸癌細胞(HeLa)放置于含有10%的胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當細胞培養(yǎng)增殖至大約鋪滿培養(yǎng)瓶底部時，去除老舊的培養(yǎng)基，加入2 mL已經(jīng)預熱至37 ℃的PBS溶液對細胞進行清洗，加入1 mL 0.25% 胰蛋白酶溶液浸潤細胞，離心去除胰酶，置于37 ℃下消化50 s，置于光學顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化..最后加入2 mL DMEM 培養(yǎng)液，輕輕吹打細胞使得其落壁形成單細胞懸液，分成多份并加入 DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞.

1.5 細胞顯影

將HeLa細胞以每孔5×104個細胞的密度接種在培養(yǎng)皿中，24 h后加入待測化合物，化合物最終濃度為1×10-5mol·L-1.在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)6 h. 隨后吸除培養(yǎng)基溶液后用PBS洗滌3遍，用共聚焦顯微鏡觀察細胞顯影效果.

1.6 化合物的合成步驟及表征

化合物合成路線如圖1 所示.

圖1 化合物的合成路線

具體合成步驟如下：

N,N-二丁胺基苯甲醛的合成：在100 mL圓底燒瓶中加入二甲基甲酰胺7.30 g (2 mmol)，攪拌，溶解后置于冰水浴中，在攪拌下用恒壓滴液漏斗緩慢滴加三氯氧磷11 mL (1.5 mmol)，形成凍鹽.用氯仿溶解N, N-二丁基苯胺10.30 g (1 mmol)，再滴加到上述凍鹽中，待滴加完畢，轉(zhuǎn)移至油浴，回流4 h.反應結束后，將反應液倒入冰水中，先用氫氧化鉀溶液調(diào)溶液的pH，使溶液pH在7左右.二氯甲烷萃取多次，蒸干溶劑.將粗產(chǎn)物過硅膠劑柱層析，用石油醚做展開劑淋洗，第一組分即為所需產(chǎn)物，產(chǎn)物呈淺黃色油狀.MS (ESI-MS): calc: 233.36, found: 233.12 [M].

L1的合成：稱取 N,N-二丁胺基苯甲醛2.30 g (1 mmol)溶于100 mL的乙醇中, 攪拌下分批加入2-乙酰基吡啶3.10 g (2.5 mmol)、氫氧化鉀2.30 g( 4 mmol), 常溫下攪拌30 min，分批加入40 mL氨水，攪拌10 min，然后升溫至78 ℃, 反應6 h，冷卻、過濾并用乙醇重結晶得亮黃色固體3.00 g，產(chǎn)率68%.1H-NMR (400 MHz, d6-acetone, ppm) δ 8.76 (dd,J=62.4, 45.6 Hz, 4H), 8.08-7.90 (m, 2H), 7.44 (t,J=25.5 Hz, 4H), 7.27 (t,J=16.5 Hz, 1H), 7.17—6.94 (m, 1H), 6.69 (t,J=19.6 Hz, 2H), 3.47—3.23 (m, 4H), 1.58 (t,J=18.5 Hz, 4H), 1.38 (dt,J=27.3, 13.6 Hz, 4H), 1.13—0.80 (m, 6H).13C-NMR (100 MHz, d6-acetone, ppm)δ154.19, 151.80, 148.26, 139.25, 128.79, 124.05, 119.73, 111.53, 53.49, 30.07, 21.77, 13.79. MS (ESI-MS): calc: 436.60, found: 437.27 [M]+H+.

ZnL12(NO3)2的合成: 稱取配體L1 0.22 g(2 mmol)和六水合硝酸鋅0.082 g (1.1 mmol)溶于甲醇溶液中，加熱回流3 h，停止反應，冷卻至室溫，逐漸有紅色粉末析出.甲醇重結晶，得紅色固體0.34 g，產(chǎn)率64 %.1H-NMR (400 MHz, d6-acetone, ppm) δ 8.72 (dd,J=32.0, 24.4 Hz, 12H), 8.03-7.88 (m, 4H), 7.82 (d,J=8.3 Hz, 4H), 7.42 (d,J=25.6 Hz, 4H), 6.89 (d,J=8.4 Hz, 4H), 3.43 (t,J=7.4 Hz, 8H), 1.75-1.59 (m, 8H), 1.42 (dd,J=14.7, 7.3 Hz, 8H), 1.08—0.88 (m, 12H).13C-NMR (100 MHz, d6-acetone, ppm)157.21, 151.51, 149.80, 144.90, 136.76, 130.81, 128.55, 125.18, 124.05, 118.47, 112.48, 110.00, 53.72, 30.05, 20.15, 13.56. MS (ESI-MS): calc: 468.23, found: 468.22 [M]+.

ZnL12Eu(TTA)42的合成: 稱取配體L1 0.22 g (2 mmol ) 加熱溶于10 mL甲醇中，然后向其加入溶有六水合硝酸鋅0.082 g (1.1 mmol)的甲醇溶液30 mL，加熱回流約3 h，然后將溶有HEu(TTA)4配合物的甲醇溶液滴加上述溶液中，回流3 h，蒸出甲醇，冷卻，得到黃色固體0.81 g，產(chǎn)率53%.ESI-MS m/z in positive ion mode: 468.23, found: 468.22[M]+.

2 結果與討論

2.1 吸收光譜和單光子熒光性質(zhì)

化合物(L1, ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在DMSO中的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜如圖2所示.配合物在DMSO中的光譜學數(shù)據(jù)列于表1.

圖2 化合物(L1, ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在DMSO中的紫外-可見吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)(化合物濃度：1.0×10-5 mol·L-1)

表1 配合物在DMSO中的光譜學數(shù)據(jù)

量子產(chǎn)率(配合物濃度：1.0×10-6mol·L-1).

由圖2和表1可知，L1、ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2的紫外-可見吸收光譜均位于300～520 nm范圍內(nèi)，L1在350 nm附近的吸收峰可歸屬于整個分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)；ZnL12(NO3)2的吸收峰位置在443 nm處，可歸屬于金屬到配體的電荷轉(zhuǎn)移(MLCT)；ZnL12[Eu(TTA)4]2不僅在340 nm周圍表現(xiàn)出H[Eu(TTA)4]的吸收峰，在420 nm 左右表現(xiàn)出金屬到配體的電荷轉(zhuǎn)移(MLCT)的吸收峰，說明[Eu(TTA)4]-影響了Zn(II)到三聯(lián)吡啶配體的電荷轉(zhuǎn)移[16].

2.2 非線性光學性質(zhì)

為證明ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2的多光子吸收效應，分別用熒光對比法和Z-掃描方法測試其多光子吸收性質(zhì)，并計算配合物的多光子吸收截面.

2.2.1 雙光子吸收性質(zhì)

配合物(ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)的雙光子熒光光譜如圖3所示.

圖3 配合物(ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在700～930 nm波長下的雙光子熒光光譜(配合物濃度：1.0 × 10-3 mol·L-1)

如圖3所示，ZnL12(NO3)2在700～930 nm激發(fā)波長下的雙光子熒光發(fā)射峰位置為578 nm，同單光子熒光發(fā)射峰(557 nm)相比發(fā)生了約20 nm紅移，這是由于高濃度分子運動造成的能量損失所致.而ZnL12[Eu(TTA)4]2的雙光子發(fā)射峰位置相對于單光子熒光發(fā)射峰發(fā)生了藍移，可能由于長波長激發(fā)下沒有激發(fā)出Eu的特征發(fā)射峰，或者是Eu的發(fā)射峰較弱，被三聯(lián)吡啶合鋅配離子的發(fā)射峰所覆蓋.通過熒光對比法計算出其最大吸收截面分別為161 GM和388 GM，如圖4所示，數(shù)據(jù)列于表2中.由于[Eu(TTA)4]-陰離子影響金屬鋅到三聯(lián)吡啶環(huán)的電荷轉(zhuǎn)移，非輻射躍遷降低，雙光子吸收截面增大.

圖4 配合物(ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在DMSO溶液中，700～930 nm激發(fā)波長下的雙光子吸收截面(配合物濃度：1.0×10-3 mol·L-1)

2.2.2 三光子吸收性質(zhì)

為了深入探究ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2的三光子吸收性能，在激發(fā)波長為1 340 nm的條件下通過開孔Z-掃描技術測量化合物的三光子吸收性質(zhì),如圖5所示.利用Z-掃描測試下的三光子截面計算公式[18]

其中：I0是光功率密度，I是入射光強，L是樣品池厚度，γ是三光子吸收系數(shù)，d0是樣品濃度，λ是波長，h是普朗克常數(shù)(6.626×10-34J·s)，NA是阿伏伽德羅常數(shù)(6.022×1023mol-1).計算得到ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2的三光子吸收截面的值分別為4.99×10-82cm6·s2·photon-2和8.11×10-82cm6·s2·photon-2，三光子吸收系數(shù)分別為1.44×10-28cm3·W-2和2.60×10-28cm3·W-2,詳細數(shù)據(jù)列于表2.這些結果表明ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2配合物在近紅外區(qū)都具有良好的雙光子/三光子吸收性質(zhì)，為它們在多光子生物探針方面的研究奠定了基礎.

圖5 配合物(ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在DMSO溶液中，1 340 nm激發(fā)波長下的開孔Z-掃描(配合物濃度：1.0×10-3 mol·L-1)

表2 配合物在DMSO溶液中的多光子吸收性質(zhì)數(shù)據(jù)

三光子有效吸收截面，配合物濃度為1.0×10-3mol·L-1.

2.3 生物學應用

基于以上對ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2光物理性質(zhì)的研究，它們在近紅外區(qū)有較大的雙光子、三光子吸收截面，筆者進一步探索它們在生物學上的應用.在探究生物學測試前，用MTT比色法對配合物的細胞毒性進行了檢測，如圖6所示，當加入配合物的體積達到20 μL時，Hela細胞存活率達到84%，結果表明配合物的毒性很低，有利于共聚焦生物顯影.

圖6 配合物(ZnL12(NO3)2, ZnL12[Eu(TTA)4]2)在 Hela 細胞中的生物毒性(溶劑DMEM∶DMSO=99∶1，配合物濃度為1×10-5 mol·L-1)

為了觀察配合物在細胞中的分布情況，取配合物溶液10 μL加入Hela細胞培養(yǎng)皿作用30 min后，進行雙光子共聚焦顯微成像.如圖7所示，配合物穿過細胞膜，著色絲狀線粒體，并在線粒體區(qū)域發(fā)出很強的熒光.為了進一步確定其靶向性，用Mito trackerTM(商業(yè)染料，特異性識別線粒體)進行了共定位實驗.共定位實驗顯示，配合物ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2的細胞靶向與Mito tracker高度重合，這可能是因為配合物的陽離子部分與負電位的線粒體相結合.因此ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2可作為一種線粒體雙光子熒光探針.

3 結束語

筆者合成了ZnL12(NO3)2和ZnL12[Eu(TTA)4]2，系統(tǒng)研究了它們的光學性質(zhì)，闡明陰離子對光學性質(zhì)的影響.利用熒光對比法測試了它們的雙光子吸收性質(zhì)，Z-掃描技術測試了它們的三光子吸收性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)它們在近紅外區(qū)有較大的多光子吸收截面.生物學測試表明，它們都具有低毒性和良好的生物相容性，在較短時間內(nèi)進入細胞靶向絲狀線粒體，發(fā)出很強的熒光，可用作線粒體的雙光子熒光探針.該文的研究結果為細胞靶向的多光子熒光探針合理設計提供了新思路.