鄭冰潔，胡長(zhǎng)敏，胡涌剛*，郭愛(ài)珍*,

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)是一種高度流行的病原體，能在多種家畜和野生動(dòng)物中傳播。Carter和Heddleston等對(duì)多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了分型鑒定[1-3]。Pm一共有5個(gè)莢膜血清型和16個(gè)脂多糖血清型，且不同血清型往往與特定疾病相關(guān)聯(lián)[4,5]。自2008年以來(lái)，病牛中分離到莢膜血清A型Pm的報(bào)道逐漸增多[6-8]。該P(yáng)m是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病、犢牛地方性肺炎以及牛運(yùn)輸熱病的主要病原體之一[9,10]，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，發(fā)展相應(yīng)的檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確鑒定并定量檢測(cè)牛源A型Pm對(duì)于探索其致病機(jī)理、助力流行病學(xué)調(diào)查、預(yù)防和控制牛源A型Pm引起的相關(guān)疾病、促進(jìn)健康養(yǎng)殖以及發(fā)展國(guó)民經(jīng)濟(jì)有十分重要的意義。

目前，牛源A型Pm的研究處在初級(jí)階段。分離培養(yǎng)是細(xì)菌分型鑒定的經(jīng)典方法，也是當(dāng)前鑒定A型Pm最常用的方法。該方法需要經(jīng)過(guò)病原菌分離培養(yǎng)、細(xì)菌形態(tài)和培養(yǎng)特性觀察、生化反應(yīng)鑒定、莢膜血清型特異性基因的PCR擴(kuò)增凝膠電泳等程序才能準(zhǔn)確確定其血清學(xué)分型[11,12]。分離培養(yǎng)法主要缺陷在于步驟繁瑣、通常需要耗時(shí)4～5 d，無(wú)法滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)、快速定量檢測(cè)的需要。最近，郭愛(ài)珍課題組[13]建立了基于DNA提取的鑒別診斷牛源A型Pm的多重PCR方法，該方法將檢測(cè)時(shí)間縮短到3～4 h以?xún)?nèi)，對(duì)牛源A型Pm的最低檢測(cè)濃度達(dá)到8.0×105CFU/mL。但是，該P(yáng)CR方法仍然需要通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室操作凝膠電泳實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)，無(wú)法滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)、快速定量檢測(cè)的需要。

免疫檢測(cè)方法與分子診斷方法相比具有價(jià)格低、能實(shí)現(xiàn)病原菌的直接檢測(cè)、能滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要等優(yōu)點(diǎn)。但是，現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有免疫方法用于牛源A型Pm檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。本課題組利用全菌蛋白免疫小鼠，首次篩選到了針對(duì)牛源A型Pm的單克隆抗體，并將抗體與磁珠偶聯(lián)制備了免疫磁珠，建立了一種基于磁珠的“雙抗夾心”免疫顯色方法，成功實(shí)現(xiàn)了牛源A型Pm的快速檢測(cè)。與傳統(tǒng)PCR方法相比，不需要制備PCR模板、不需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)時(shí)間縮短到1 h。該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果通過(guò)顯色可以直接觀察，特異性好，能滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)的需要。免疫磁珠檢測(cè)有效期可達(dá)半年之久，具有良好的批間穩(wěn)定性和批內(nèi)穩(wěn)定性，顯示出良好的商品化開(kāi)發(fā)前景和潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Multiskan 1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)，Thermo Fisher Scientific)；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；純水儀(美國(guó)，PALL)。

小鼠抗牛源A型Pm抗體由實(shí)驗(yàn)室制備，牛源A型Pm、牛源B型Pm、大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、牛支原體、沙門(mén)氏菌、溶血曼氏桿菌、變形桿菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存的臨床分離株。2-嗎啉乙磺酸(MES)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)(Sigma公司)。脫脂奶粉、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、大豆酪蛋白肉湯培養(yǎng)基(TSB)、類(lèi)胸膜肺炎微生物(PPLO)培養(yǎng)基(美國(guó)BD公司)。牛血清白蛋白(BSA)(Biosharp公司)。羧基修飾磁珠(直徑1 μm，濃度50 mg/mL)(德國(guó)Chemicell公司)。其它所有試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán))。水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)將純化保存的各菌株于TSA或PPLO培養(yǎng)基平皿上劃線接種，放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h左右，挑取單菌落接種于TSB或PPLO液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃、180 r/min，恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜。取適量各菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，剩余菌液用0.5%甲醛滅活18 h。菌液離心去除培養(yǎng)基，用pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌3次并重懸至合適濃度備用。

1.2.2 免疫磁珠(IMB)的制備磁珠(Magnitic Beads)混勻取適量到離心管中，置于磁力架上磁性分離去除上清液，加入1 mL MEST緩沖液(100 mmol/L MES，pH=5.0，0.05%Tween 20)洗滌2次，去除上清液。迅速加入新鮮配制的200 μL EDC/NHS(10 mg/mL)，混勻后25 ℃搖床120 r/min活化30 min。磁性分離去除上清，PBS充分懸浮磁珠，洗滌3次。加入抗Pm單克隆抗體(McAb1)，25 ℃搖床振蕩孵育過(guò)夜。磁性分離去除上清，PBS洗滌3次除去未結(jié)合抗體。加入BSA與脫脂奶粉的混合封閉劑(Blocking Agent)，封閉磁珠表面未偶聯(lián)抗體的活化羧基基團(tuán)，25 ℃搖床振蕩封閉4 h。洗去封閉劑，PBS重懸免疫磁珠，存于4 ℃冰箱備用，長(zhǎng)期保存需在懸液中添加蛋白保護(hù)劑和抑菌劑。

1.2.3 酶標(biāo)抗體的制備0.5 mL超純水溶解5 mg HRP，加入1 mL 0.06 mol/L NaIO4，室溫下避光輕攪20 min。加入1 mL 0.16 mol/L的乙二醇，振蕩1 h終止氧化反應(yīng)。在活化HRP中加入5 mg的抗體(McAb2)，混勻后裝入透析袋，于0.05 mol/L，pH=9.6的碳酸鹽緩沖溶液中低溫透析過(guò)夜。透析后反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入0.2 mL 4 mg/mL的NaHB4，4 ℃反應(yīng)2 h。加入等體積的飽和(NH4)2SO4溶液沉淀結(jié)合物,離心棄上清。將沉淀物溶于PBS(0.02 mol/L，pH=7.4)中透析除去(NH4)2SO4，即得酶標(biāo)結(jié)合物。加甘油等保護(hù)劑后小量分裝，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 菌體的免疫檢測(cè)免疫磁珠用PBST洗滌3次，取適量加入到2 mL的離心管中，在陽(yáng)性管中加入500 μL一定濃度的牛源A型Pm菌液和500 μL HRP標(biāo)記的抗牛源A型Pm抗體(均用PBST緩沖液稀釋)，陰性管中加入500 μL PBST和500 μL酶標(biāo)抗體，充分混勻磁珠，25 ℃搖床振蕩孵育30 min。免疫磁珠與菌體和酶標(biāo)抗體結(jié)合反應(yīng)后，用PBST充分洗滌3次，磁性分離去除上清，每管各加100 μL TMB底物反應(yīng)A液與B液，與磁珠充分混合，顯色反應(yīng)8～10 min，加入100 μL 1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在磁性分離架上磁性分離，每管各取200 μL上清于96孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

本研究檢測(cè)牛源A型Pm流程如圖1所示：以表面修飾了羧基的Fe2O3@SiO2磁性微球?yàn)檩d體，利用EDC/NHS將磁珠活化直接與一抗進(jìn)行偶聯(lián)，然后封閉未結(jié)合的位點(diǎn)，制備免疫磁珠。將目標(biāo)分析物與免疫磁珠共同孵育，磁珠將菌體從反應(yīng)液中精準(zhǔn)捕獲。HRP標(biāo)記的抗體作為檢測(cè)抗體與菌體表面的另一抗原蛋白結(jié)合，形成免疫磁珠-目標(biāo)菌體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物。在加入TMB底物液后發(fā)生顯色反應(yīng)，通過(guò)顏色變化直接可判定結(jié)果。

圖1 基于磁珠的免疫分析法用于檢測(cè)牛源A型Pm流程圖Fig.1 Immunoassay based on magnetic beads for rapid detection of bovine capsular serotype A Pm

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

如圖2(a)所示，磁珠用量在5～25 μg的范圍內(nèi)，檢測(cè)信噪比(S/N)隨磁珠用量的增加而增加。原因是相同時(shí)間內(nèi)磁珠量越多，捕獲的菌體越多，磁珠過(guò)量時(shí)，單個(gè)微球捕獲的菌數(shù)減少，與酶標(biāo)二抗的結(jié)合效率降低，非特異性吸附增加，噪聲升高導(dǎo)致信噪比降低。數(shù)據(jù)表明，25 μg的磁珠用量可以使檢測(cè)的信噪比達(dá)到最大值。

圖2 免疫檢測(cè)條件的優(yōu)化(牛源A型Pm的檢測(cè)濃度為1.0×106 CFU/mL，以信噪比(S/N)的值來(lái)判定結(jié)果，S/N表示陽(yáng)性對(duì)照組的吸光值與相同條件下陰性對(duì)照組的吸光值的比值)。主要優(yōu)化了(a)磁珠用量，(b)封閉劑的選擇，(c)包被濃度的優(yōu)化，(d)酶標(biāo)抗體濃度的優(yōu)化Fig.2 Optimization of detecting conditions with the concentration of serotype A Pm at 1.0×106 CFU/mL(S/N represents the ratio of the absorbance of the positive control group to that of the negative control group under the same conditions).Effect of magnetic bead dosage on the detection of serotype A Pm(a).Effect of the blocking agent(b).And effect of coating concentration(c) and HRP-IgG concentration(d) on the detection of serotype A Pm(Error bars=± SD and n=5)

常用來(lái)作為封閉劑的惰性蛋白有BSA和脫脂奶粉(S.M.)，配制2%BSA、5%BSA、2%S.M.、5%S.M.、2%BSA+S.M.及5%BSA+S.M.作為封閉劑來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖2(b)表明2%脫脂奶粉的封閉效果最好，因此選用2%的脫脂奶粉為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的封閉劑。

如圖2(c)所示，優(yōu)化了捕獲抗體在1～90 μg/mL范圍內(nèi)的信噪比，抗體濃度從1 μg/mL增至30 μg/mL時(shí)，信噪比隨濃度的增加而增加，表明低于該濃度時(shí)磁珠與抗體結(jié)合還未飽和；當(dāng)高于30 μg/mL時(shí)信噪比出現(xiàn)稍微平穩(wěn)的趨勢(shì)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇30 μg/mL作為捕獲抗體包被磁珠的包被濃度。

同樣，為了獲得酶標(biāo)二抗最佳用量，對(duì)HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體的濃度從0.05～0.75 μg/mL進(jìn)行了優(yōu)化。圖2(d)表明，信噪比隨著酶標(biāo)抗體濃度的增加而上升，在0.25 μg/mL時(shí)檢測(cè)的信噪比達(dá)到最大值，繼續(xù)提高濃度其比值開(kāi)始下降。這可能是由于當(dāng)濃度高于0.25 μg/mL后，酶標(biāo)抗體的非特異性吸附加劇，陰性信號(hào)的值升高的趨勢(shì)比陽(yáng)性信號(hào)升高趨勢(shì)要快，最終使信噪比降低。0.25 μg/mL作為酶標(biāo)抗體的最優(yōu)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 工作曲線、檢測(cè)限、重現(xiàn)性

在最優(yōu)檢測(cè)條件下，按上述方法進(jìn)行免疫分析，以吸光度作為縱坐標(biāo)，以牛源A型Pm稀釋濃度的自然對(duì)數(shù)值(lnc)作為橫坐標(biāo)。如圖3所示，菌濃度在1.0×105～1.0×107CFU/mL的范圍內(nèi)，其吸光度線性良好得到線性方程:y=0.61991×lnx+0.2488(R2=0.99)，檢測(cè)限(S/N=3)為1.0×105CFU/mL。結(jié)果表明：本研究提出的免疫檢測(cè)方法靈敏度明顯高于PCR檢測(cè)方法(檢測(cè)限為8.0×105CFU/mL)[13]，具有良好的應(yīng)用前景。

圖3 吸光度與菌濃度的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship between the absorbance and the concentration of serotype A Pm ranging from 1.0×105 CFU/mL to 1.0×107 CFU/mL(Error bars=±SD and n=5)

為了檢驗(yàn)本方法的重現(xiàn)性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)1.0×106CFU/mL的牛源A型Pm做了10組重復(fù)性檢測(cè)，通過(guò)數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)得出這10組值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.38%，表明該檢測(cè)方法有良好的重復(fù)性。

2.4 檢測(cè)方法的特異性

本研究提出的免疫檢測(cè)方法分別用于檢測(cè)常見(jiàn)牛源病原體，包括金黃色葡萄球菌(S.aureus)、溶血曼氏桿菌(M.haemolytica)、大腸桿菌(E.coli)、變形桿菌(Proteobacteria)、鏈球菌(Streptococcus)、牛支原體(Mycoplasmabovis)、沙門(mén)氏菌(Salmonella)、牛源B型Pm、牛源A型Pm及混合菌液，檢測(cè)濃度均為1.0×106CFU/mL。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示：本研究提出的免疫檢測(cè)方法對(duì)這幾種牛病常見(jiàn)病原菌沒(méi)有明顯的交叉反應(yīng)，只對(duì)牛源A型Pm呈現(xiàn)顯著陽(yáng)性結(jié)果，其他各病原菌檢測(cè)的吸光度與PBS陰性對(duì)照組的吸光度相近。這一結(jié)果表明本方法的檢測(cè)特異性良好。

圖4 免疫分析法檢測(cè)牛源A型Pm的特異性試驗(yàn)Fig.4 The specificity of the immunoassay.Each strain and the mixture at the same concentration of 1.0×106 CFU/mL,and the negative control(PBS) was tested using this immunoassay(Error bars=± SD and n=5)

2.5 模擬實(shí)際樣品的檢測(cè)

養(yǎng)牛場(chǎng)中采集到的牛鼻拭子(nose swab)、咽拭子(throat swab)、氣管拭子(tracheal swab)和肺組織(lung tissue)樣品作為實(shí)際檢測(cè)樣本，拭子樣品用PBS稀釋10倍，肺組織塊加入適量PBS搗碎研磨之后，4 000 r/min離心10 min，取上清液用。在樣品中添加牛源A型Pm作為陽(yáng)性對(duì)照，以處理后未加菌體的樣品作為陰性對(duì)照。將準(zhǔn)備好的待檢菌液和酶標(biāo)抗體與免疫磁珠充分混勻，反應(yīng)體系中菌濃度1.0×106CFU/mL，酶標(biāo)抗體濃度0.25 μg/mL。25 ℃搖床振蕩孵育30 min。反應(yīng)后，用PBST充分洗滌3次，磁性分離去除上清，每管各加100 μL TMB底物反應(yīng)A液與B液，與磁珠充分混合，顯色反應(yīng)8～10 min，加入100 μL 1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在磁性分離架上磁性分離，每管各取200 μL上清于96孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光值。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程1 h左右即可完成。從圖5中結(jié)果可見(jiàn)，陽(yáng)性和陰性樣品差異明顯，表明該方法在實(shí)際樣品中也能進(jìn)行牛源A型Pm的檢測(cè)。

3 結(jié)論

根據(jù)牛源A型Pm的流行現(xiàn)狀及國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的迫切需要，本研究利用實(shí)驗(yàn)篩選得到的抗牛源A型Pm特異性抗體，結(jié)合磁珠易于分離的特點(diǎn)，建立了一種特異性檢測(cè)牛源A型Pm的免疫診斷方法。該免疫檢測(cè)方法具有成本低、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單快速、可用于現(xiàn)場(chǎng)定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。此外，本方法制備的免疫磁珠可保存半年以上，具有開(kāi)發(fā)成商品化試劑盒的潛在價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。