于 越，周穎琳*，張新祥*

(北京分子科學(xué)國家研究中心，生物有機(jī)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871)

1 前言

質(zhì)譜(Mass Spectrometry，MS)具有定性能力強(qiáng)、靈敏度高、分析速度快等固有的優(yōu)點(diǎn)，是一種功能強(qiáng)大的檢測(cè)工具。自1942年第一臺(tái)商業(yè)化質(zhì)譜儀推出以來，質(zhì)譜技術(shù)便進(jìn)入了蓬勃發(fā)展的階段，各種各樣的離子源及質(zhì)量分析器被設(shè)計(jì)出來以拓展質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用范圍。迄今為止，質(zhì)譜技術(shù)，尤其是其與氣相色譜、液相色譜以及毛細(xì)管電泳聯(lián)用的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于生化分析[1-3]、臨床檢測(cè)[4]、環(huán)境科學(xué)[5]、石油化學(xué)[6]、食品安全[7]等各個(gè)研究領(lǐng)域。

在生化分析中，盡管質(zhì)譜技術(shù)能夠進(jìn)行快速鑒定及準(zhǔn)確定量，但是仍然存在一些問題。一方面，在生物體內(nèi)，生物分子如糖、脂肪酸，以及生物化學(xué)修飾如蛋白質(zhì)糖基化、堿基修飾，它們通常具有較大的極性，并且沒有易電離的官能團(tuán)，使得它們?cè)谫|(zhì)譜檢測(cè)中離子化效率較低。另一方面，一些化合物及化學(xué)修飾在生物體內(nèi)的豐度極低，受樣品中復(fù)雜基質(zhì)的干擾嚴(yán)重。這都使得這些生物分子及生物化學(xué)修飾無法獲得理想的質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度，在分析模型中難以檢出或無法檢出，從而在一定程度上限制了質(zhì)譜對(duì)它們的深入研究。因此，提高難電離及低豐度待測(cè)物的質(zhì)譜離子化效率是研究者們亟待解決的問題。

化學(xué)衍生法已被證明是一種提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度的有效方法。通過引入恰當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)改變目標(biāo)待測(cè)物的性質(zhì)，不僅能夠通過提高離子化效率改善質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度[8,9]，還可以起到輔助結(jié)構(gòu)解析[10,11]、減少基質(zhì)干擾[12]、促進(jìn)異構(gòu)體分離[13,14]及穩(wěn)定待測(cè)物[15]等作用。近年來，化學(xué)標(biāo)記試劑層出不窮，在代謝組學(xué)[16]、蛋白組學(xué)[17,18]、環(huán)境分析[19]、食品安全[20]、質(zhì)譜成像[21]等多個(gè)研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。其中，肼基標(biāo)記試劑是標(biāo)記試劑中常見的一類。它能夠與帶有醛基(羰基)或羧基官能團(tuán)的化合物反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)活性較氨基更高，反應(yīng)速度更快，還可以結(jié)合特定基團(tuán)的引入提高電噴霧離子化效率和毛細(xì)管電泳分離，從而備受研究者們青睞。

在過去的幾年中，本課題組以及其他研究者開發(fā)了多種基于肼基標(biāo)記試劑衍生-質(zhì)譜分析的方法，對(duì)多種重要的生物分子及化學(xué)修飾進(jìn)行高靈敏和選擇性分析。本文將從糖及蛋白質(zhì)糖基化分析、堿基修飾分析、脂肪酸分析三個(gè)方面對(duì)肼基標(biāo)記試劑在質(zhì)譜生化分析中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)。

2 糖及蛋白質(zhì)糖基化分析

糖作為細(xì)胞識(shí)別的信息分子在生物體內(nèi)具有重要作用，如細(xì)胞相互作用[22]、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的形成[23]、免疫應(yīng)答[24]等。據(jù)估計(jì)，超過90%的人類蛋白質(zhì)都是糖基化的。糖基化作為蛋白翻譯過程中最廣泛也是最重要的修飾類型之一，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用，其水平與結(jié)構(gòu)的變化與風(fēng)濕病[25]、糖尿病[26]和癌癥[27,28]等疾病相關(guān)，被廣泛地視為潛在的生物標(biāo)志物。

由于糖自身極性很大且沒有發(fā)色基團(tuán)，無法直接使用熒光、質(zhì)譜等檢測(cè)方法進(jìn)行檢出。大部分糖的分析方法都要求對(duì)糖進(jìn)行衍生化。常見的糖衍生化方法有全甲基化/全乙?；⑦€原胺化、肼基化和邁克爾加成。盡管還原胺化在糖標(biāo)記中廣泛應(yīng)用，多種標(biāo)記試劑如2-氨基苯甲酰胺(2-Aminobenzamide，2-AB)[29]、2-氨基苯甲酸(2-Aminobenzoic acid，2-AA)[30]、1-氨基-3，6，8-三磺酸芘(1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonic acid，APTS)[31]等均已經(jīng)商品化。但是由于這一方法會(huì)產(chǎn)生大量劇毒副產(chǎn)物，反應(yīng)條件要求嚴(yán)格，還有可能會(huì)導(dǎo)致糖結(jié)構(gòu)中的唾液酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因此在一定程度上限制了還原胺標(biāo)記方法的應(yīng)用。

肼基相較于氨基具有更高的反應(yīng)活性，可以與糖的還原端形成穩(wěn)定的亞胺結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了標(biāo)記效率，縮短了標(biāo)記時(shí)間，并且避免了劇毒試劑的使用。因此，自1996年Shinohara等[32]首次使用肼基修飾的生物素對(duì)糖衍生化后，這一類標(biāo)記方法在糖分析中的研究與應(yīng)用逐漸增多[33,34]。Lattova等[35]使用苯肼對(duì)N-聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生化，并證明衍生產(chǎn)物使用高效液相色譜-質(zhì)譜(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS)進(jìn)行定量分析的可行性。Kapkova等[36]使用生物素氨基己酰肼對(duì)單糖、二糖、三糖、標(biāo)準(zhǔn)N-聚糖、酶解蛋白釋放的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果表明，衍生后的聚糖質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度得到了提高。根據(jù)糖的不同衍生后的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度比未衍生的高1～3個(gè)數(shù)量級(jí)。

盡管基于肼基標(biāo)記試劑的糖分析在HPLC-MS檢測(cè)中廣泛應(yīng)用，但是毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry，CE-MS)在糖分析中一直沒有得到充分的重視與應(yīng)用，而糖作為一類極性大、水溶性好、豐度低的生物樣品，恰恰是CE-MS分離分析的理想樣品。本課題組設(shè)計(jì)合成了一類新型肼基三嗪標(biāo)記試劑(圖1)，適用于CE-MS對(duì)糖進(jìn)行分離與分析[37]。肼基三嗪標(biāo)記試劑中的二乙氨基一方面能夠在酸性背景電解質(zhì)中帶電，效果最優(yōu)的T3能夠使得中性聚糖攜帶多個(gè)電荷，提高了聚糖的電泳遷移率，從而提高了分離效率；另一方面其具有非常高的離子化效率，可以使得質(zhì)譜的檢測(cè)靈敏度提高10倍以上，因此在CE-MS對(duì)糖的分析檢測(cè)中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。最近，Partyka等[38]也提出了一種應(yīng)用于CE-MS的多電荷糖標(biāo)記試劑，他們使用肽肼標(biāo)簽對(duì)N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記，衍生化后的N-聚糖在75 cm長(zhǎng)的分離毛細(xì)管中不到15 min即可獲得良好的分離，并可以獲得40 nmol/L的檢出限。

圖1 肼基標(biāo)記試劑T3與糖的反應(yīng)示意圖及T3標(biāo)記后的聚糖的CE-MS提取離子流譜圖[37]Fig.1 Reaction between hydrazine labeling reagent T3 and glycans,and extracted ion current chromatograms of T3-labeled glycans obtained by CE-MS[37]

本課題組設(shè)計(jì)的肼基三嗪標(biāo)記試劑在糖的HPLC-MS檢測(cè)中也表現(xiàn)出優(yōu)異的效果。Zhang等[39]應(yīng)用T3標(biāo)記試劑，開發(fā)了一種基于衍生化預(yù)處理與HPLC-MS結(jié)合的靈敏、穩(wěn)定、高效的寡糖分析方法，實(shí)現(xiàn)了中草藥淫羊藿屬寡糖的圖譜分析。該方法的檢出限低至fmol量級(jí)，比已經(jīng)被廣泛應(yīng)用的糖標(biāo)記試劑1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的靈敏度更高，可以鑒定到66種寡糖化合物，并可以使用篩選出的13種寡糖化合物作為淫羊藿屬植物鑒定的潛在生物標(biāo)志物。該方法還可以應(yīng)用于咖啡粉的摻假鑒定中。利用該方法Zhang等完成了111種寡糖的同時(shí)檢測(cè)，確定了17種寡糖標(biāo)志物用于鑒定咖啡粉中的大豆和大米兩種主要的摻假物，并通過對(duì)商業(yè)咖啡粉樣品的測(cè)試，證明該方法是識(shí)別咖啡摻假的可靠而有效的方法[40]。與我們合作，Lubman等應(yīng)用T3標(biāo)記試劑開發(fā)了一種從患者血清中的結(jié)合珠蛋白中檢測(cè)生物標(biāo)志物巖藻糖基化聚糖的方法(圖2)[41]。衍生化之后，使用親水作用色譜-質(zhì)譜(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography-mass Spectrometry，HILIC-MS)聯(lián)用系統(tǒng)，可以從不到1 μL的患者血清中檢測(cè)出結(jié)合珠蛋白中的聚糖，如果不進(jìn)行衍生化，則無法檢測(cè)到聚糖。他們進(jìn)一步拓展了該方法的應(yīng)用，開發(fā)出一種區(qū)分糖蛋白每個(gè)位點(diǎn)上聚糖的核心巖藻糖基化和觸角巖藻糖基化的方法[42]。

圖2 基于T3標(biāo)記的血清中結(jié)合珠蛋白巖藻糖基化的檢測(cè)[41]Fig.2 Detection of haptoglobin fucosylation in serum based on T3 labeling[41]

為了提高糖分析中定量的準(zhǔn)確性，本課題組設(shè)計(jì)合成了質(zhì)量數(shù)相差20的氘代標(biāo)記試劑d20-T3，保證了兩種標(biāo)記試劑標(biāo)記的同一種目標(biāo)待測(cè)物即使在電噴霧離子源中帶上2個(gè)甚至3個(gè)電荷，在質(zhì)譜圖中得到的m/z值也不會(huì)發(fā)生重疊，從而降低了數(shù)據(jù)處理的難度。我們利用該氘代標(biāo)記試劑開發(fā)了一種基于質(zhì)譜的廉價(jià)、高效的相對(duì)定量方法，在人血清中成功實(shí)現(xiàn)了48種N-聚糖的準(zhǔn)確定量檢測(cè)[43]。Li等利用T3及d20-T3，探索了HILIC結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離-質(zhì)譜成像(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometric Imaging，MALDI-MSI)平臺(tái)對(duì)N-聚糖進(jìn)行定量分析的能力[44]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與直接MALDI-MS相比，HILIC-MALDI-MSI提供了更高的N-聚糖覆蓋率以及更好的定量精度，表明使用肼標(biāo)記試劑的HILIC-MALDI-MSI系統(tǒng)具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和高度可重復(fù)性，在比較糖組學(xué)研究中具有巨大的潛力。

此外，本課題組在此標(biāo)記試劑的基礎(chǔ)上，保持其肼基三嗪的母核結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)并合成了一系列取代基不同的肼基三嗪標(biāo)記試劑，進(jìn)一步提高質(zhì)譜的檢測(cè)靈敏度，并擴(kuò)展該類標(biāo)記試劑的應(yīng)用范圍(圖3)[45]。在對(duì)麥芽七糖的檢測(cè)中，效果最佳的標(biāo)記試劑n-Pr2N標(biāo)記之后的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)比已經(jīng)商品化的2-AB糖標(biāo)記試劑標(biāo)記之后的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)提高了10倍，且標(biāo)記反應(yīng)完成之后只需將反應(yīng)體系旋干再溶解即可直接進(jìn)樣。相比2-AB還原胺化后所需要柱純化等復(fù)雜操作，肼基標(biāo)記在反應(yīng)后處理方面更加快速簡(jiǎn)便。對(duì)生物樣品中使用PNGase F酶解下來的N-聚糖進(jìn)行n-Pr2N標(biāo)記，N-聚糖的信號(hào)強(qiáng)度平均提升了100倍，并且可以檢測(cè)到更多種類的N-聚糖，表明肼基三嗪類標(biāo)記試劑是糖分析及蛋白質(zhì)糖基化分析的有力工具。

圖3 一系列肼基標(biāo)記試劑結(jié)構(gòu)示意圖及其標(biāo)記麥芽七糖的提取離子流譜圖[45]Fig.3 Structures of a series of hydrazine labeling reagents and extracted ion current chromatograms of maltoheptaose labeled by different labeling reagents[45]

3 堿基修飾分析

核酸(DNA和RNA)中除了經(jīng)典堿基，即腺嘌呤(Adenine，A)、鳥嘌呤(Guanine，G)、胞嘧啶(Cytosine，C)、胸腺嘧啶(Thymine，T)和尿嘧啶(Uracil，U)外，還包含許多修飾堿基[46]。這些堿基修飾雖然相對(duì)豐度極低，但在生物體中發(fā)揮著基因選擇性表達(dá)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種重要的生物學(xué)功能，并與腫瘤等許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是近年來精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[46,47]。目前，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)是堿基修飾分析的主流方法[48-52]。因?yàn)閴A基修飾在生物體內(nèi)的含量通常極低，例如在哺乳動(dòng)物中，5-醛基胞嘧啶(5-Formylcytosine，5fC)的含量約占胞嘧啶的百萬分之一到二十[48]，所以常需要通過化學(xué)衍生法等樣品前處理過程，以滿足低豐度堿基修飾以及少量樣品中堿基修飾的定量檢測(cè)要求。

本課題組使用肼基三嗪標(biāo)記試劑i-Pr2N，針對(duì)不同的堿基修飾建立了高靈敏的HPLC-MS/MS檢測(cè)方法(圖4)。5fC和5-羧基胞嘧啶(5-Carboxylcytosine，5caC)是兩種豐度極低的修飾堿基，利用標(biāo)記試劑i-Pr2N中肼基的高反應(yīng)活性，能夠?qū)?fC和5caC進(jìn)行快速標(biāo)記，尤其是5fC和標(biāo)記試劑之間的衍生反應(yīng)非?？?，僅通過振蕩旋干便可以完成反應(yīng)，無需額外的反應(yīng)時(shí)間。衍生化后的5fC和5caC的檢測(cè)靈敏度提高了100倍以上，檢出限分別低至10 amol和25 amol。一方面，衍生反應(yīng)引入了易于離子化的叔胺基團(tuán)；另一方面，三嗪基團(tuán)的引入提高了5fC和5caC的疏水性，根據(jù)小分子化合物電噴霧電離的機(jī)制，疏水性的提高能夠使得質(zhì)譜離子化效率得到提升。使用建立的方法，能夠在約600 ng的DNA樣品中進(jìn)行5fC和5caC的檢出，展現(xiàn)出該方法應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)的可能性[53]。5-羥甲基胞嘧啶(5-Hydroxymethylcytosine，5hmC)是一種癌癥標(biāo)志物，本課題組建立了一種基于MnO2氧化和i-Pr2N標(biāo)記的方法，實(shí)現(xiàn)了少量的DNA樣品中5hmC的定量分析。該方法使5hmC的檢測(cè)靈敏度提高了178倍，檢測(cè)限低至14 amol，可以在340 pg基因組DNA(相當(dāng)于57個(gè)細(xì)胞中的基因組DNA含量)中量化5hmC水平。利用該方法首次實(shí)現(xiàn)了不依賴于二代測(cè)序技術(shù)對(duì)血清中游離DNA(Cell-free DNA，cfDNA)中5hmC的定量檢測(cè)，為探究珍貴樣品中的5hmC功能和基于5hmC的非侵入性疾病診斷提供了一種新的檢測(cè)手段，在臨床檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景[54]。

圖4 胞嘧啶修飾的標(biāo)記策略及i-Pr2N標(biāo)記后的提取離子流譜圖[53-54]Fig.4 Labeling strategies of modified cytosines and extracted ion current chromatograms of modified cytosines labeled by i-Pr2N[53-54]

除了i-Pr2N衍生化外，Hong等[55]使用吉拉德試劑T(Girard reagent T，GirT)對(duì)5-醛基尿嘧啶(5-Formyluracil，5fU)進(jìn)行標(biāo)記，與未標(biāo)記的相比靈敏度提高約20倍，檢出限為3～4 fmol。Yuan等使用一系列吉拉德試劑(GirD，GirT和GirP)對(duì)5fC和5caC進(jìn)行標(biāo)記，檢測(cè)靈敏度提高52～260倍。其中GirP的效果最好，5fC和5caC的檢出限可分別達(dá)到30 amol和420 amol，利用建立的檢測(cè)方法在擬南芥和水稻基因組DNA中鑒定發(fā)現(xiàn)了5fC和5caC[56]。隨后，他們對(duì)方法進(jìn)行改進(jìn)，使用GirP化學(xué)衍生結(jié)合管內(nèi)固相微萃取實(shí)現(xiàn)了DNA和RNA中6種醛基化修飾的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度提高了307～880倍[57]。他們還利用MnO2氧化和丹磺酰肼(Dansylhydrazine，DNSH)衍生的策略建立了一種測(cè)定DNA和RNA中5hmC和5fC的新方法[58]。在該方法中，DNA和RNA中5hmC氧化衍生化產(chǎn)物的檢出限分別為 40 amol 和30 amol，與未標(biāo)記的相比，檢測(cè)靈敏度分別提高了363倍和380倍。在優(yōu)化條件下，20 ng DNA和100 ng RNA 足以分析其中的5hmC。

4 脂肪酸分析

脂肪酸在生命過程中起著多種關(guān)鍵作用，可以通過氧化過程提供能量，參與分子信號(hào)傳導(dǎo)并調(diào)節(jié)生物學(xué)過程，還與多種疾病相關(guān)，包括腫瘤，糖尿病和心臟病，是一種潛在的生物標(biāo)志物[59-62]。然而，由于脂肪酸的離子化效率非常低，種類和結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，而且進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析時(shí)，在碰撞誘導(dǎo)解離中由于其剛性結(jié)構(gòu)而不能產(chǎn)生理想的產(chǎn)物離子，對(duì)其檢測(cè)造成了困難?；瘜W(xué)衍生法普遍應(yīng)用于改善脂肪酸的質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度[63-65]，肼基標(biāo)記試劑是其中一種常用的標(biāo)記試劑。

Zhang等使用肼基三嗪標(biāo)記試劑T3，開發(fā)了一種定量檢測(cè)脂肪酸的HPLC-MS/MS方法，并建立了適用于任何脂肪酸的通用的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple Reaction Monitoring，MRM)條件，方便定量分析，擴(kuò)大了該方法的應(yīng)用范圍[66,67]。該方法還使用氘化衍生試劑d20-T3作為內(nèi)標(biāo)，以盡量減少基質(zhì)效應(yīng)，保證了方法的準(zhǔn)確性和可靠性。衍生化后的脂肪酸的檢測(cè)靈敏度顯著提高了1 000倍，可以檢測(cè)到低至10 fg的脂肪酸。將該方法用于血漿樣品的研究，發(fā)現(xiàn)血漿中的幾種脂肪酸能夠區(qū)分幼鼠和老年鼠，有望作為衰老過程的潛在生物標(biāo)志物[66]。Li等[68]將該方法拓展應(yīng)用至小分子藥物Triptolide對(duì)肝臟和腎臟的毒性研究中，發(fā)現(xiàn)暴露于Triptolide的小鼠肝臟和腎臟組織中的多種脂肪酸的濃度均發(fā)生了顯著變化。

此外，Han等[69]使用3-硝基苯肼(3-Nitrophenylhydrazine，3NPH)對(duì)短鏈脂肪酸進(jìn)行標(biāo)記，采用同位素內(nèi)標(biāo)法實(shí)現(xiàn)了對(duì)10種短鏈脂肪酸的同時(shí)分離與準(zhǔn)確定量。衍生后的產(chǎn)物具有很好的穩(wěn)定性，并且不需要反應(yīng)后的處理，適用于高通量分析。該方法的檢出限低至0.15～15 fmol，日內(nèi)精密度和日間精密度均≤8.8%(n=6)。

最近，Zhao等[70]使用丹磺酰肼及其13C同位素試劑對(duì)包括脂肪酸在內(nèi)的羧基代謝物進(jìn)行標(biāo)記，建立了一種針對(duì)羧基代謝物的準(zhǔn)確相對(duì)定量方法，并構(gòu)建了由193種內(nèi)源性人類代謝物組成的標(biāo)記羧基標(biāo)準(zhǔn)庫用于代謝物的鑒定，涵蓋了超過55種代謝途徑。通過對(duì)30個(gè)尿液樣品的代謝組比較以及兩種尿酸的絕對(duì)定量，證明了使用此方法對(duì)復(fù)雜實(shí)際樣品中的羧基代謝組進(jìn)行全面分析的可能性。

5 總結(jié)與展望

肼基標(biāo)記試劑的應(yīng)用范圍非常廣，除了上文中提到的在糖及糖基化分析、堿基修飾分析及脂肪酸分析中的應(yīng)用外，還可以應(yīng)用于其他的含有醛基或羧基的目標(biāo)待測(cè)物的檢測(cè)中，如類固醇[21]、脂肪醛[71]、類花生酸等等[72]，因此可以廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)、環(huán)境分析、醫(yī)藥檢測(cè)、食品分析等多種研究領(lǐng)域，具有極大的應(yīng)用潛力。但是，隨著科學(xué)研究的不斷深入，低樣品消耗量、低豐度目標(biāo)待測(cè)物檢測(cè)的需求日益迫切。此外，基于化學(xué)衍生-質(zhì)譜分析的方法也存在一定局限性，如副產(chǎn)物的形成和過量衍生化試劑的干擾。因此，針對(duì)目標(biāo)待測(cè)物設(shè)計(jì)開發(fā)具有更高檢測(cè)靈敏度、更好選擇性、更快反應(yīng)速度、沒有副產(chǎn)物的衍生化試劑，甚至新的衍生化反應(yīng)，以便更好地應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析檢測(cè)中，仍然是研究者們努力的方向。