李順基,肖育勁,陳 鵬,劉筆鋒*

(華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430074)

1 前言

微流控芯片技術(shù)起源于19世紀(jì)20年代Manz等人首次提出的微全分析系統(tǒng)概念[1]。因其具有將大型儀器微型化，提高分析檢測(cè)技術(shù)靈敏度及加快檢測(cè)速度等優(yōu)勢(shì)，在分析檢測(cè)領(lǐng)域得到快速發(fā)展[2]。1995年，首家從事微流控芯片技術(shù)的Cliper公司成立；2003年，微流控技術(shù)被Forbes評(píng)為影響人類未來15件最主要發(fā)明之一；2004年，美國(guó)Business 2.0雜志封面文章將微流控芯片技術(shù)列為“改變世界”的七種技術(shù)之一。自2006年起，微流控體外診斷公司開始成立并快速發(fā)展。2006年微點(diǎn)生物公司成立；2007年Alere收購(gòu)博適公司的Trage系列，成為當(dāng)時(shí)全球范圍內(nèi)心臟標(biāo)志物POCT診斷的龍頭企業(yè)。

微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于體外診斷(In-vitro Diagnosis,IVD)的優(yōu)勢(shì)在于能將檢測(cè)分析所需的樣本前處理、手工加樣、試劑混合等繁雜的操作集中在一個(gè)芯片上完成，并且能夠提供體外診斷檢測(cè)所需的密閉環(huán)境[3]。流體在微米級(jí)別的通道內(nèi)成層流狀態(tài)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微流體的精確控制，使檢測(cè)的結(jié)果更及時(shí)和準(zhǔn)確。在此維度下，流體的表面張力、毛細(xì)管力、流體粘度、剪切力成為流體的主要影響因素[4]。通過在微通道內(nèi)設(shè)計(jì)特有微混合器及通過彎曲的微通道形成Dean流可實(shí)現(xiàn)流體快速混合，混合速度可以達(dá)到微秒級(jí)別[5,6]。微流控芯片技術(shù)在臨床體外診斷檢測(cè)的發(fā)展中[7-10]，芯片結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)及相應(yīng)的信號(hào)檢測(cè)原理是微流控體外診斷檢測(cè)技術(shù)主要發(fā)展的兩個(gè)方面，前者主要決定了加工所需要的精度及復(fù)雜性，后者在一定程度上決定了芯片的結(jié)構(gòu)及所需要的檢測(cè)設(shè)備。本文將重點(diǎn)介紹微流控體外診斷檢測(cè)技術(shù)的芯片結(jié)構(gòu)及檢測(cè)技術(shù)原理的發(fā)展。

2 微流控芯片技術(shù)在體外生化診斷檢測(cè)中的應(yīng)用

體外生化診斷檢測(cè)原理主要基于酶動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，如谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、膽堿酯酶、葡萄糖、尿素等，依靠酶催化底物產(chǎn)生信號(hào)。微流控芯片高通量及微型化的特點(diǎn)，可以解決生化檢測(cè)項(xiàng)目多、樣本消耗量大、試劑成本高等問題。目前，商品化的微流控生化分析芯片主要以離心式微流控芯片為主。最具代表性的是Abaxis公司的Picolo芯片檢測(cè)系統(tǒng)(圖1(A))，將生物化學(xué)檢測(cè)中所涉及的全血標(biāo)本加樣、分離、定量、稀釋、反應(yīng)、檢測(cè)等基本操作步驟集成在微芯片上，以微通道網(wǎng)絡(luò)連接各個(gè)反應(yīng)腔室，通過離心力、毛細(xì)管力及虹吸閥等實(shí)現(xiàn)對(duì)流體的精確控制[11]。目前，微流控技術(shù)在體外生化診斷檢測(cè)方面的產(chǎn)品多數(shù)是基于Picolo芯片檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)計(jì)創(chuàng)新，包括天津微納芯、成都斯瑪特、Roche cobas系列等推出的微流控生化檢測(cè)芯片。

血?dú)夥治龊拖嚓P(guān)離子如K+、Na+的濃度是重癥患者日常監(jiān)護(hù)及急診的重要指標(biāo)。血?dú)夥治霭–O2、O2及血液pH的檢測(cè)，易受樣本運(yùn)輸環(huán)境、運(yùn)輸時(shí)間的影響。因此，微型化的微流控芯片產(chǎn)品快速發(fā)展起來，其中代表性產(chǎn)品是雅培基于生物電傳感技術(shù)的I-STAT系列，通過目標(biāo)檢測(cè)物對(duì)體系內(nèi)電流改變的大小來判斷結(jié)果，應(yīng)用于重癥患者的床旁快速檢測(cè)。

血糖是糖尿病患者需要頻繁檢測(cè)的指標(biāo)，研究主要傾向于降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)便攜性。目前，成本低、檢測(cè)便攜的紙層析微流控芯片技術(shù)已成功應(yīng)用于葡萄糖快速檢測(cè)[12]。微流控技術(shù)的另一優(yōu)勢(shì)是可以利用電子傳感及酶學(xué)技術(shù)將檢測(cè)裝置設(shè)計(jì)成可穿戴或可植入設(shè)備，實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)的葡萄糖含量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，減輕頻繁檢測(cè)對(duì)患者帶來的痛苦[13]。

臨床生化檢測(cè)的檢測(cè)方法多依賴于化學(xué)物質(zhì)的相互反應(yīng)，其反應(yīng)的試劑種類多，相對(duì)于利用機(jī)械臂的大型分析儀器來說，微流控芯片具有體積小、通量高、試劑消耗量低等優(yōu)勢(shì)。

3 微流控芯片技術(shù)在體外核酸分子診斷檢測(cè)中的應(yīng)用

微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于核酸分子檢測(cè)，可以將核酸提取、擴(kuò)增及檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米大小的芯片上，實(shí)現(xiàn)核酸分子的自動(dòng)化檢測(cè)。隨著微流控芯片技術(shù)在臨床檢驗(yàn)診斷中的應(yīng)用和發(fā)展，基于核酸分子檢測(cè)的微流控產(chǎn)品也開始占領(lǐng)了部分市場(chǎng)。Cepheid公司在2005年發(fā)布的GeneXpert PCR分析儀，是世界上第一個(gè)將樣品制備、擴(kuò)增與檢測(cè)完全整合的定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))儀，使得不具備專業(yè)技術(shù)的人員也可以在各種環(huán)境下進(jìn)行復(fù)雜的分子檢測(cè)，同時(shí)基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，可以在30 min內(nèi)完成檢測(cè)。Cepheid公司單個(gè)芯片只能進(jìn)行單個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)，而GenePoc的Revogene系統(tǒng)[14]以及博暉創(chuàng)新的GenPlexTM微流控全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)將芯片設(shè)計(jì)成離心及陣列式微流控芯片，在單一芯片上可以進(jìn)行多個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)(圖1(B))。

傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增芯片技術(shù)需要良好的溫控系統(tǒng)，且95 ℃高溫下影響芯片的密封性及內(nèi)置試劑的性能[15]。為克服常規(guī)PCR高溫下的不利影響，核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)隨之發(fā)展起來。核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要包括賴解旋酶恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)(HDA)、實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(SAT)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、切口酶核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(NEMA)等。其中LAMP的靈敏度為傳統(tǒng)PCR技術(shù)的100倍，而且擴(kuò)增反應(yīng)可以在30～60 min內(nèi)完成。2016年，北京博奧生物依據(jù)LAMP技術(shù)開發(fā)的RTisochip-A核酸分析儀，是國(guó)內(nèi)第一家分子診斷的微流控產(chǎn)品，并獲得了CFDA的醫(yī)療器械批準(zhǔn)。同時(shí)，其在此次新冠疫情中研發(fā)的呼吸道多病毒(含新冠病毒)核酸檢測(cè)芯片試劑盒也獲得CE-IVD的認(rèn)證。目前，基于微流控芯片技術(shù)的研究焦點(diǎn)主要致力于發(fā)展快速、便捷、特異性及靈敏度高的核酸快速檢測(cè)芯片。Kattika等[16]基于RT-LAMP(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification)技術(shù)結(jié)合紙微流控芯片技術(shù)，利用蠟在紙質(zhì)材料上打印出微通道，完成了ZIKV(Zika virus)RNA的快速檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到1 copy/μL，并可借助智能手機(jī)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。本課題組同樣基于核酸LAMP技術(shù)，設(shè)計(jì)了多種微流控芯片[17,18]，包括離心及瓊脂糖凝膠快速檢測(cè)芯片，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種病原體快速檢測(cè)，靈敏度可以達(dá)到3 copies/μL。最近，Nicholas等[19]提出非目標(biāo)核酸擴(kuò)增的模塊化檢測(cè)平臺(tái)，具體原理是在游離核苷酸上標(biāo)記HRP，設(shè)計(jì)發(fā)夾引物結(jié)構(gòu)，當(dāng)目標(biāo)核酸存在時(shí)，會(huì)與聚合酶分子上的模板鏈結(jié)合，使聚合酶恢復(fù)活性，對(duì)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的末端引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過加入顯色底物進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，所制備的微流控檢測(cè)芯片可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病原微生物，整個(gè)檢測(cè)過程在2 h內(nèi)完成，靈敏度可達(dá)到10 amol(圖1(C))?；贚AMP技術(shù)及利用各種酶進(jìn)行延伸反應(yīng)的核酸檢測(cè)技術(shù)，還是需要對(duì)整個(gè)反應(yīng)過程進(jìn)行嚴(yán)格的溫度控制，有研究人員利用分子雜交技術(shù)結(jié)合光學(xué)衍射和特異性光譜信號(hào)轉(zhuǎn)化技術(shù)，設(shè)計(jì)出只需要在常溫下進(jìn)行核酸分子檢測(cè)的微流控芯片，可在3 min內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果[20,21]。

圖1 (A)Abaxis公司的Picolo芯片檢測(cè)過程(從左至右)[11]：全血加樣及稀釋液釋放；全血分離及稀釋液定量；血漿與稀釋液定量混合；充分混合均勻；利用離心力虹吸閥的作用，定量分配液體；進(jìn)行反應(yīng)及信號(hào)檢測(cè)。(B)GenePoc的revogene系統(tǒng)[14]：a.芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)：混合區(qū)采用磁珠混合，采用實(shí)時(shí)定量PCR原理進(jìn)行檢測(cè)；b.整體結(jié)構(gòu)。(C)酶-DNA分子復(fù)合物對(duì)病原體核酸的可視化和模塊化檢測(cè)芯片[19]：a.核酸信號(hào)擴(kuò)增檢測(cè)原理；b.模塊化檢測(cè)芯片整體結(jié)構(gòu)。Fig.1 (A)The Picolo chip detection process of Abaxis(from left to right)[11]:Whold blood samples and diluent release;whole blood separation and diluent quantification;plasma and diluent quantitatively mixed;fully mixed;using centrifugal force and siphon valve to dispense the liquid quantitatively;reaction and signal detection.(B)GenePoc’s revogen system[14]:a.The chip structure:mixing with magnetic beads,and the principle of real-time quantitative PCR is used for detection;b.The instrument.(C)Pathogen nucleic acid detection chip based on Enzyme-DNA molecular complex[19]:a.Nucleic acid signal amplification principle;b.Modular detection chip.

雖然基于微流控芯片技術(shù)的核酸快速檢測(cè)技術(shù)在不斷發(fā)展，但是真正應(yīng)用于臨床檢測(cè)的卻很少。正如，當(dāng)新冠病毒橫行之下，雖然基于LAMP技術(shù)的新冠核酸檢測(cè)文章層出不窮[22]，但是醫(yī)院檢驗(yàn)科所采用的最普遍，最可靠的檢測(cè)手段還是手工操作繁雜的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)，RT-PCR被認(rèn)為是新冠病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[23]。RT-PCR的完成過程需要嚴(yán)格的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，專業(yè)技術(shù)人員，同時(shí)存在氣溶膠污染、人員感染及不能同時(shí)檢測(cè)多種病原體等不足，而微流控快速檢測(cè)芯片將核酸提取，擴(kuò)增及檢測(cè)整合在一個(gè)芯片上，簡(jiǎn)化操作，降低污染，在醫(yī)療檢驗(yàn)和疾病防控上具有巨大的應(yīng)用前景。

4 微流控芯片技術(shù)在體外免疫診斷檢測(cè)中的應(yīng)用

相對(duì)于核酸分子及生化檢測(cè)，微流控芯片技術(shù)在體外免疫診斷檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì)。因?yàn)槊庖邫z測(cè)主要是基于抗原抗體的特異性生物識(shí)別機(jī)制進(jìn)行檢測(cè)，本身具有較高的特異性。有研究發(fā)現(xiàn)，在微流通道內(nèi)，當(dāng)流體動(dòng)力強(qiáng)度在0.1～10 pN時(shí)可以分裂抗原抗體的非特異性結(jié)合，而在6～250 pN時(shí)仍然可以保留抗原抗體的特異性結(jié)合[24-26]，同時(shí)微流控技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行的微流控分析所需試劑量極小，大大降低了抗體等昂貴免疫試劑的消耗。此外，微納尺度的流體操控與集成，不僅提高了抗原與抗體反應(yīng)的速度、有效縮短了反應(yīng)時(shí)間，并極大地簡(jiǎn)化了免疫分析的操作過程。因此，微流控免疫分析技術(shù)在提高體外診斷檢測(cè)的特異性、靈敏度、精確性等檢測(cè)性能方面具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。本文將從以下幾個(gè)方面對(duì)微流免疫分析檢測(cè)的產(chǎn)業(yè)化及學(xué)術(shù)研究進(jìn)展進(jìn)行介紹。

4.1 微流控免疫分析手工替代的應(yīng)用發(fā)展

在免疫分析手工替代中，具有代表性的成果是2009年在《lab on a chip》雜志上公布的離心式免疫分析芯片[27]：采用光學(xué)敏感蠟作為閥門，通過控制光照來控制閥門的開合，通過離心提供流體動(dòng)力，借助通道的結(jié)構(gòu)及對(duì)離心力的精確計(jì)算來控制流體的運(yùn)動(dòng)，在30 min內(nèi)就可以自動(dòng)化完成酶聯(lián)免疫檢測(cè)(圖2(A))?；谶@種離心力提供動(dòng)力的微泵微閥式芯片產(chǎn)品也是目前產(chǎn)業(yè)化的方向，例如三星的Samsung IB10及上海典奧生物的Gyrolab xPlore全自動(dòng)納升級(jí)免疫分析平臺(tái)等。2015年，Choi等[28]利用微流通道內(nèi)靜置的液相相互不溶的原理，設(shè)計(jì)了更加簡(jiǎn)化的檢測(cè)芯片，借助磁微粒的磁性作用，通過磁鐵提供動(dòng)力進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析，完成了貝類毒素的檢測(cè)(圖2(B))。隨著芯片內(nèi)微泵微閥的發(fā)展，液壓、虹吸、壓電驅(qū)動(dòng)及電磁驅(qū)動(dòng)控制的微泵微閥種類也越來越多。Lee團(tuán)隊(duì)[29-32]利用電磁驅(qū)動(dòng)的氣動(dòng)閥微泵，設(shè)計(jì)了自動(dòng)樣品混合及試劑添加的芯片，依次完成C反應(yīng)蛋白(CRP)、甲胎蛋白(AFP)及糖化血紅蛋白(HbA1c)等項(xiàng)目的檢測(cè)。2018年，Saska等[33]將微流控免疫分析應(yīng)用于病理組織的免疫染色上，密閉的環(huán)境及全自動(dòng)化操作，減少人為染色造成的誤差及染劑對(duì)工作人員的長(zhǎng)期損害。

4.2 微流控免疫痕量物質(zhì)分析及高通量檢測(cè)的應(yīng)用發(fā)展

微流控免疫分析高度集成及微型化的特點(diǎn)可以用于痕量抗原或抗體的檢測(cè)。對(duì)于痕量物質(zhì)的檢測(cè)，一般通過芯片的設(shè)計(jì)對(duì)痕量物質(zhì)進(jìn)行富集之后再進(jìn)行檢測(cè)。2014年，Sui等[34]設(shè)計(jì)的人字形富集微流控芯片(圖2(C))，對(duì)空氣中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行富集，富集之后進(jìn)行細(xì)菌裂解再進(jìn)入另一個(gè)雙層的微流控芯片上進(jìn)行檢測(cè)，其優(yōu)勢(shì)是可以檢測(cè)出空氣中含量低，但是感染性極強(qiáng)的結(jié)核分枝桿菌。2015年，Wang等[35]設(shè)計(jì)了魚骨形微混合器進(jìn)行樣本與標(biāo)記物的混合，同時(shí)在檢測(cè)區(qū)域設(shè)計(jì)了微柱結(jié)構(gòu)來增加抗原抗體捕獲面積，進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度；并進(jìn)一步結(jié)合圓盤式芯片，實(shí)現(xiàn)在單個(gè)芯片上對(duì)三個(gè)甚至更多樣本進(jìn)行檢測(cè)，并成功實(shí)現(xiàn)了鼠傷寒沙門桿菌的檢測(cè)分析。

目前，微陣列式芯片[36,37]也是實(shí)現(xiàn)芯片高通量檢測(cè)的有效方法之一(圖2(D))。2018年，Ning等[38]利用可調(diào)節(jié)顏色的光學(xué)晶體微珠作為固相載體，通過不同的顏色來實(shí)現(xiàn)不同項(xiàng)目的檢測(cè)；利用篩網(wǎng)進(jìn)行光學(xué)晶體微珠的攔截，完成了AFP、癌胚抗原(CEA)、免疫球蛋白G(IgG)的陣列式聯(lián)合檢測(cè)，但是在同等體積下，微珠所能包含的數(shù)量及種類有限，微珠與微珠之間的相互作用，也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。經(jīng)典的微陣列芯片是可拆裝的交叉垂直微流芯片，即先通過橫向的微流通道進(jìn)行捕獲抗體的固定，再通過垂直的微流通道進(jìn)行樣本檢測(cè)，橫向通道數(shù)量為檢測(cè)項(xiàng)目個(gè)數(shù)，垂直通道的數(shù)量為檢測(cè)樣本個(gè)數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)陣列式高通量檢測(cè)，而且通道隔開防止了樣本的交叉污染[39]。除此之外，可以在芯片上預(yù)先包被上捕獲抗體，通過彎曲的通道完成陣列式檢測(cè)。胡等[40]將捕獲抗體修飾在錫箔紙材料上面，裁剪成單條，再通過柱閥控制的彎曲通道完成多項(xiàng)目同時(shí)檢測(cè)。2020年，Hedde等[41,42]依據(jù)陣列式免疫芯片技術(shù)，制備了便攜式快速免疫檢測(cè)芯片，可以同時(shí)對(duì)多種呼吸道病毒進(jìn)行檢測(cè)，為臨床新冠病毒感染提供鑒別診斷依據(jù)。

圖2 (A)光敏蠟為控制閥門，借助離心力的作用提供流體動(dòng)力，完成酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)的全自動(dòng)化[27]。(B)不相容流體靜置，形成兩種水相，完成貝類毒素免疫檢測(cè)[28]。(C)空氣中肺結(jié)核菌自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)及結(jié)核菌富集結(jié)構(gòu)(SHM)[34]。(D)利用氣泵閥控制流體的流動(dòng)，完成陣列芯片的免疫檢測(cè)過程及相應(yīng)結(jié)果示意圖[37]。Fig.2 (A)Used photosensitive wax as the control valve and completed the full automation of enzyme-linked immunoassay detection based on centrifugal force[27].(B)The incompatible fluid is allowed to stand still to form two water phases to complete the shellfish toxin immunoassay[28].(C)Microfluidic platform for direct capture and Analysis of airborne mycobacterium tuberculosis[34].(D)The air pump valve is used to control the flow of fluid to complete the immune detection process of the array chip[37].

4.3 微流控免疫分析床旁快速檢測(cè)的應(yīng)用發(fā)展

床旁快速檢測(cè)芯片是微流控免疫分析最主要的發(fā)展方向。微流控芯片與免疫分析相結(jié)合的優(yōu)勢(shì)滿足了床旁快速檢測(cè)快速、便捷的需求。目前，基于熒光微球作為檢測(cè)信號(hào)的微流控免疫芯片，主要有美艾爾利爾(Alere)和微點(diǎn)生物芯片。2007年，Alere依靠從博適公司收購(gòu)的Trage系列占領(lǐng)了當(dāng)時(shí)POCT領(lǐng)域的霸主地位。Alere的芯片結(jié)構(gòu)(圖3(A))保留了紙層析芯片中過濾全血的裝置，在隨后的改進(jìn)中，設(shè)計(jì)了倒梯形結(jié)構(gòu)進(jìn)行全血血細(xì)胞的過濾，在通道里設(shè)計(jì)親疏水性結(jié)構(gòu)進(jìn)行流體的控制。國(guó)內(nèi)微點(diǎn)生物借鑒類似結(jié)構(gòu)也開發(fā)了快速檢測(cè)試劑卡，并應(yīng)用于肌鈣蛋白的快速檢測(cè)。Se-Hwan Paeka團(tuán)隊(duì)[43,44]利用紙芯片組合方式，在側(cè)流層析旁邊加上層析結(jié)構(gòu)，用于底物的加入，在硝酸纖維素膜上實(shí)現(xiàn)以辣根過氧化物酶為標(biāo)記的免疫層析檢測(cè)，使紙層析芯片擺脫了長(zhǎng)期只能利用膠體金、磁珠、熒光微球等直接信號(hào)標(biāo)記物的限制，但其紙層析芯片結(jié)構(gòu)單一、組裝復(fù)雜，而且對(duì)比于傳統(tǒng)熒光試紙條，檢測(cè)過程相對(duì)復(fù)雜。近年來，磁微流控芯片是微流控芯片研究的重要組成部分之一[45]，2014年，深圳市華邁興微成立，其設(shè)計(jì)的微流控芯片集磁微粒分離、化學(xué)發(fā)光技術(shù)于一體，在單一芯片內(nèi)利用磁微粒分離樣本，通過控制磁微粒的移動(dòng)來實(shí)現(xiàn)不同區(qū)域的不同生物化學(xué)反應(yīng)。但是在單一芯片上較難實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)目的檢測(cè)，雖然后來根據(jù)微粒大小的不同可以使其在磁場(chǎng)中具有不同的移動(dòng)速度，實(shí)現(xiàn)了三個(gè)心梗項(xiàng)目的同時(shí)檢測(cè)，但是從原理上分析，其檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性將降低，而且檢測(cè)項(xiàng)目的個(gè)數(shù)也會(huì)有限制。微流控快速檢測(cè)芯片的另一個(gè)典型代表是博識(shí)生物依據(jù)理邦巨阻磁敏技術(shù)開發(fā)的M16快速檢測(cè)試劑卡芯片，用磁微粒標(biāo)記抗體，通過捕獲的磁微粒的多少來間接評(píng)估所含目標(biāo)物的濃度水平，并進(jìn)一步設(shè)計(jì)陣列式微芯片，實(shí)現(xiàn)多項(xiàng)目并行檢測(cè)，但是彼此之間的間距小，磁場(chǎng)容易受到影響，增加項(xiàng)目數(shù)量也會(huì)有交叉影響，檢測(cè)信號(hào)的敏感性越高，相互之間的影響就越大。微流控芯片在床旁快速檢測(cè)免疫分析方面的理論研究已經(jīng)相對(duì)成熟，但是精確、復(fù)雜、多功能微流控通道的制備，依賴于高精密的加工儀器與設(shè)備，使其產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)成本高，成品率低。

4.4 微流控免疫分析免標(biāo)記抗體信號(hào)檢測(cè)及新信號(hào)檢測(cè)的應(yīng)用發(fā)展

在快速免疫檢測(cè)分析中，一般需要對(duì)二抗進(jìn)行信號(hào)標(biāo)記，在進(jìn)行抗體信號(hào)標(biāo)記過程中，難免會(huì)使抗體的特異性及穩(wěn)定性發(fā)生改變，因此利用抗原抗體自身的結(jié)合反應(yīng)作為信號(hào)檢測(cè)，省去二抗的標(biāo)記步驟成為研究的熱點(diǎn)。借助光學(xué)干涉儀與生物芯片結(jié)合進(jìn)行生物信號(hào)檢測(cè)時(shí)，依靠抗原抗體的特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)生的免疫復(fù)合物對(duì)干涉信號(hào)的影響來完成蛋白質(zhì)等分子的檢測(cè)[46]。例如，Michailia等[47]依據(jù)傅里葉光學(xué)檢測(cè)原理，利用BB-MZI(Broad-band Mach-Zehnder Interferometer)干涉儀結(jié)合生物芯片完成了四種過敏原蛋白的檢測(cè)。Kerwin等[48]在PDMS微流通道內(nèi)制作微柱陣列，制備了側(cè)向位移檢測(cè)芯片，通過在聚丙烯微球表面進(jìn)行基團(tuán)的修飾，使生物分子在聚丙烯微球表面上進(jìn)行反應(yīng)，生物分子含量的多少，決定了聚丙烯微球的大小及其表面所帶電荷的多少，當(dāng)微球從微柱陣列通過時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同的側(cè)向位移，根據(jù)微球側(cè)向位移的大小來推算生物分子的含量，在芯片上完成了白蛋白及人血清白蛋白的含量的檢測(cè)(圖3(B))。雖然這些方法可以節(jié)省材料，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，但是應(yīng)用于復(fù)雜的臨床檢測(cè)樣本時(shí)，人血清中復(fù)雜的成分，包括脂質(zhì)體，細(xì)胞碎片等對(duì)光學(xué)干涉儀都會(huì)有較大的影響，側(cè)向位移檢測(cè)則更受影響。因此，研究工作者將目標(biāo)聚焦于更小及更靈敏的信號(hào)標(biāo)記物，包括拉曼光譜、等離子共振體(SPR)、電傳感等檢測(cè)信號(hào)。拉曼光譜是分子的“指紋光譜”，可以將穩(wěn)定的小分子作為信號(hào)標(biāo)志物，減少對(duì)抗原抗體特異性結(jié)合的影響。Wang等[49]利用4-MBA(4-巰基苯甲酸)作為標(biāo)記物，完成H5N1的檢測(cè)。等離子共振體主要依靠芯片底部金屬薄膜對(duì)流道內(nèi)的生物反應(yīng)的感應(yīng)變化來檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)，Chang等[50]依據(jù)SPR角度變化原理，在底層表面鍍上一層金膜，在金屬膜表面包被了特異性抗體對(duì)H7N9流感病毒進(jìn)行特異性捕獲，實(shí)現(xiàn)了流感病毒的快速檢測(cè)。

圖3 (A)艾利爾Trage系列芯片：整體芯片結(jié)構(gòu)及芯片檢測(cè)布局。(B)側(cè)向位移免疫微流控芯片[48]：a.微球形成的原理；b.芯片檢測(cè)的原理。Fig.3 (A)Alere Trage series chip:overall chip structure and layout.(B)Lateral displacement immune microfluidic chip[48]:a.Principle of microsphere formation;b.Principle of chip detection.

5 總結(jié)及展望

微流控技術(shù)作為交叉學(xué)科融合的技術(shù)應(yīng)用于體外診斷，對(duì)體外診斷技術(shù)具有革命性的沖擊。目前產(chǎn)品開發(fā)及研究，主要集中在是生化、核酸及免疫的床旁快速檢測(cè)領(lǐng)域。微流控技術(shù)在我國(guó)雖起步較晚，但是微流控芯片技術(shù)被寫入了十三五規(guī)劃。新冠疫情下，我國(guó)科技部發(fā)布現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)應(yīng)急項(xiàng)目，征集可以實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)，結(jié)果出”核酸快速檢測(cè)產(chǎn)品。同樣，在新冠疫苗出現(xiàn)后對(duì)人體內(nèi)抗體水平及抗體效價(jià)的評(píng)估都需要依靠免疫檢測(cè)技術(shù)。因此，一種便攜、快速、準(zhǔn)確、特異性及靈敏度高的核酸及蛋白快速檢測(cè)技術(shù)是時(shí)代迫切需求的，微流控技術(shù)無疑是優(yōu)選方案之一。

微流控芯片的優(yōu)勢(shì)是在一個(gè)微小芯片上可以集成多個(gè)功能單元，包括微泵、微閥、微噴頭、微反應(yīng)器等。目前的加工工藝，即使在專門的實(shí)驗(yàn)室也很難實(shí)現(xiàn)在微小的芯片上進(jìn)行多個(gè)微泵微閥的加工。因此，基于微流控芯片技術(shù)的產(chǎn)品很多，但是精度要求過高，試劑卡性能參次不齊，真正應(yīng)用于臨床上的芯片產(chǎn)品卻不多。近年來新型軟光刻、激光雕刻、數(shù)控機(jī)床、模型注塑、3D打印技術(shù)及雙光子納米級(jí)3D打印技術(shù)的發(fā)展有望推動(dòng)微流控芯片產(chǎn)業(yè)化快速發(fā)展。微流控芯片技術(shù)的發(fā)展主要依賴于芯片加工技術(shù)、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及信號(hào)檢測(cè)方式的創(chuàng)新及改進(jìn)。高度集成的微流控芯片可以同時(shí)處理大量平行樣品，分析樣品所需的試劑體積僅幾微升至幾十微升，被分析物質(zhì)的體積甚至在納升或皮升級(jí)。因此，隨著微流芯片加工及相應(yīng)檢測(cè)技術(shù)的不斷提升，其在體外診斷檢測(cè)中具有良好的發(fā)展前景。