劉書琳，張宇鵬，余 聰，劉昊陽，李康銘，龐代文*,

(1.天津市生物傳感與分子識(shí)別重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南開大學(xué)化學(xué)學(xué)院，天津 300071；2.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

1 引言

病毒是一類結(jié)構(gòu)簡單、形體微小的細(xì)胞內(nèi)寄生物，主要依靠宿主細(xì)胞來完成它們的生命周期[1,2]。病毒在歷史上已經(jīng)引起多次全球性或地區(qū)性的病毒性疾病大爆發(fā)，對(duì)人類健康、社會(huì)經(jīng)濟(jì)及國家安全均造成了巨大危害[3,4]。因此，發(fā)展即時(shí)快速的病毒檢測方法對(duì)病毒性疾病的預(yù)防及治療具有非常重要的意義。

目前，檢測病毒的方法主要可以分為兩大類，即抗體檢測與病毒成分檢測。具體來講，一方面當(dāng)病毒感染機(jī)體，機(jī)體會(huì)針對(duì)病毒特異性地產(chǎn)生抗體，我們只需要檢測出特異性抗體，即可判定病毒的存在。另一方面大多數(shù)病毒是由核酸(RNA或DNA)、衣殼和包膜(適用于包膜病毒)組成，那么就可以通過檢測病毒表面蛋白或內(nèi)部蛋白等抗原來證明病毒的存在[5-7]。因此，目前病毒檢測方法主要針對(duì)抗體、抗原、核酸開展，抗體與抗原檢測主要基于免疫反應(yīng)分析方法實(shí)現(xiàn)，而核酸檢測主要基于核酸擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。

此文主要評(píng)述基于免疫反應(yīng)的比色、熒光、電化學(xué)、磁分析方法快速檢測病毒抗體及抗原，以及基于核酸擴(kuò)增技術(shù)快速即時(shí)檢測病毒核酸的最新研究進(jìn)展。同時(shí)，以實(shí)際應(yīng)用需求為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)討論目前用于即時(shí)快速診斷的病毒檢測器件。最后，總結(jié)了病毒即時(shí)快速檢測方法方面存在的問題和面臨的挑戰(zhàn)及其發(fā)展前景。

2 基于免疫反應(yīng)的分析方法

2.1 比色免疫分析法

圖1 比色免疫分析法檢測H5N1流感病毒的原理示意圖[8]Fig.1 Schematic illustration of the principle of the immunosensor for H5N1 virus detection [8]

比色法簡單來說是一種通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。由于比色法不需要昂貴的儀器及大量的分析試劑，且兼具簡單、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，目前已成為比較熱門的病毒分析檢測方法之一，并受到越來越多的人的關(guān)注，從而在病毒檢測方向具有廣泛的應(yīng)用。例如：Xu等建立了一種用于H5N1流感病毒超靈敏檢測的比色免疫分析方法[8]。在該方法中，首先通過免疫夾心法將病毒捕獲到基底表面并標(biāo)記上堿性磷酸酶(ALP)。然后利用ALP催化4-氨基苯基磷酸鹽(4-APP)生成4-氨基苯酚(4-AP)，從而將AgNO3還原成單體Ag沉積在金納米雙錐體(Au NBPs)表面形成Ag殼。不同厚度的Ag沉積將導(dǎo)致Au NBPs的表面等離子共振(LSPR)峰不同程度的藍(lán)移及溶液的不同顏色變化。借助肉眼可識(shí)別的溶液顏色變化或光譜儀對(duì)LSPR峰位移的檢測即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)病毒濃度的測定。Hu等基于納米金及熒光納米球優(yōu)異的性質(zhì)制得比色-熒光雙信號(hào)納米球，結(jié)合鏈酶親和素-生物素信號(hào)放大系統(tǒng)，建立了現(xiàn)場高靈敏定量檢測埃博拉病毒糖蛋白的免疫層析法[9]。該方法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)埃博拉病毒糖蛋白的可視化檢出以及熒光定量檢測。與其他方法相比，該方法具有靈敏度高、所需時(shí)間短、特異性強(qiáng)，抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可直接用于血漿等復(fù)雜樣本中埃博拉病毒糖蛋白以及埃博拉病毒粒子的定量檢測。

2.2 熒光免疫分析法

熒光免疫分析是將特異性的免疫學(xué)反應(yīng)與靈敏的熒光技術(shù)結(jié)合的一種方法。由于其具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、實(shí)用性好等優(yōu)點(diǎn)，近些年被廣泛應(yīng)于病毒的即時(shí)快速檢測中。例如：Wu等將免疫磁納米球及抗體修飾的量子點(diǎn)(QDs)分別用于目標(biāo)病毒的捕獲和識(shí)別，提出了一種一步法快速定量檢測H7N9病毒的方法[10]。該檢測方法的特異性好、可靠性高、抗干擾能力強(qiáng)，可以使用多種熒光檢測模式實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒快速檢測，如熒光光譜、顯微鏡分析和手持紫外燈測試等。此外，Wu等利用不同發(fā)射波長的QDs與磁性納米粒子制備了多色熒光磁性多功能納米球。以該納米球作為捕獲載體和信號(hào)單元，結(jié)合微流控技術(shù)，開發(fā)了一種可同時(shí)檢測和分離多種病毒的數(shù)字化單病毒免疫分析法[11]。該方法無需復(fù)雜信號(hào)放大手段即可實(shí)現(xiàn)對(duì)H9N2、H1N1和H7N9禽流感病毒數(shù)字化免疫分析(圖2)，其檢測限為0.02 pg/mL,并具有良好的特異性和抗干擾能力，在病毒性疾病的早期診斷方面顯示出廣泛的應(yīng)用前景。

圖2 數(shù)字化單病毒免疫分析法檢測多種禽流感病毒示意圖[11]Fig.2 Schematic diagram of the digital single virus immunoassay for multiplex avian influenza virus detection [11]

2.3 電化學(xué)免疫分析法

電化學(xué)免疫分析法是一種將免疫分析與電化學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合的檢測方法，在病毒的抗原及抗體檢測中同樣有著良好的應(yīng)用。例如：Shao等基于納米金-石墨烯納米片復(fù)合物的基質(zhì)作用、硅納米粒子的載體作用和“生物素-鏈霉親和素-生物素”結(jié)構(gòu)的橋連作用，構(gòu)建了一種用于超靈敏檢測偽狂犬病病毒(PrV)抗體的無酶三重?cái)U(kuò)增或多重?cái)U(kuò)增電化學(xué)發(fā)光(ECL)免疫傳感器(圖3)[12]。與酶聯(lián)免疫吸附法和熒光法相比，該法在50 ng/mL～1 pg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性檢測性能，已成功應(yīng)用于豬血清中PrV抗體的檢測。Cabral-Miranda等開發(fā)了一種利用電化學(xué)阻抗譜和方波伏安法對(duì)寨卡病毒(ZIKV)非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)和包膜蛋白(EDⅢ)的靈敏檢測的電化學(xué)傳感器。該生物傳感器不僅能檢測血清和唾液中的ZIKV特異性抗體，而且能快速識(shí)別ZIKV和登革病毒(DENV)特異性抗體。這種新型生物傳感器可以檢測血液和唾液中的ZIKV抗體，且檢測結(jié)果不受DENV特異性抗體的影響[13]。

圖3 用于檢測PrV抗體的ECL生物傳感器的示意圖[12]Fig.3 Schematic illustration of ECL biosensor for detection of PrV antibody [12]

2.4 磁免疫分析法

在病毒分析檢測中，待測目標(biāo)物的識(shí)別和分離是準(zhǔn)確檢測的關(guān)鍵步驟。目前基于磁信號(hào)的分析方法主要包括磁信號(hào)的檢測技術(shù)和磁分離技術(shù)。例如：在磁信號(hào)檢測方面，Chen等結(jié)合磁分離技術(shù)和磁弛豫開關(guān)檢測技術(shù)，發(fā)展了一種一步法高靈敏檢測高致病性細(xì)菌和病毒的方法。該方法首先用抗體修飾兩種尺寸不同的磁球，識(shí)別待測物之后，借助大尺寸的磁球?qū)⒛繕?biāo)物捕獲分離富集起來，再將小尺寸的磁球作為信號(hào)單元用于免疫測定。該方法具有更高的靈敏度、更好的重復(fù)性和操作方便等優(yōu)點(diǎn)，為醫(yī)療現(xiàn)場檢測提供了一個(gè)很有前景的平臺(tái)[14]。在磁分離方面，Zhao等建立了一種基于免疫磁性納米顆粒和熒光QDs的高靈敏病毒即時(shí)快速檢測方法。利用免疫夾心策略，通過生物素化的抗體引入鏈酶親和素修飾的QDs，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)病毒高靈敏的檢測。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，具有很好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，在實(shí)際樣品的現(xiàn)場檢測中有著廣闊的應(yīng)用前景。并且由于檢測原理的普適性，該檢測方法還可以推廣至其它病毒的檢測[15]。

3 基于核酸擴(kuò)增的分析方法

3.1 基于聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)的檢測方法

Kary Mullis在1983年開發(fā)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)徹底改變了傳染病診斷領(lǐng)域。現(xiàn)有的病毒核酸檢測方法主要是通過PCR技術(shù)檢測含有DNA的病毒，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(RT-PCR)檢測含有RNA的病毒。與基于抗原的血清學(xué)檢測相比，這些檢測方法更加敏感，可以在臨床樣品中更早地檢測出病毒[16,17]。自PCR技術(shù)誕生以來，人們一直在努力對(duì)其改進(jìn)，這其中快速診斷一直是一個(gè)重要的研究方向。例如：Nagatani等發(fā)展了一種結(jié)合RT-PCR技術(shù)和微流控芯片技術(shù)來檢測流感病毒的試紙條[18]。該法使用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的引物和生物素化的引物來擴(kuò)增流感病毒的RNA，然后將逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的DNA和抗生物素抗體修飾的納米金混合以用于側(cè)流免疫測定，在1 min內(nèi)即可在測試線處觀察到由金納米顆粒駐留引起的紅色。此外，Zhu等開發(fā)了一種將RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光檢測相結(jié)合的微流控系統(tǒng)，可用于快速鑒定禽流感病毒[19]。該裝置主要由PCR擴(kuò)增所需的溫度控制單元、熒光檢測系統(tǒng)及微流控芯片組成。該系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)對(duì)溫度的高精度快速調(diào)控及PCR反應(yīng)過程中熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測，并在PCR完成后立即獲得結(jié)果。

3.2 基于等溫?cái)U(kuò)增的檢測方法

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、不需要特殊儀器、操作簡單等優(yōu)勢。近20多年來，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已經(jīng)在臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)、食品安全等不同領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用，特別是在致病菌、病毒等微生物的檢測中。其中，環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)已被用于多種病毒檢測，包括日冕病毒、鼻病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒和流感病毒等[20-23]。例如：Yao等開發(fā)了一種用于快速檢測流感病毒亞型的高通量微流控離心盤[24]。該光盤可實(shí)現(xiàn)檢測試劑預(yù)加載、試劑用量自動(dòng)控制及LAMP檢測，可以同時(shí)鑒定出6種高致病性流感病毒，包括A型H1、H3、H5、H7、H9和B型流感病毒。Li等開發(fā)了一種被稱為微型圓盤毛細(xì)管(mDC-LAMP)的新型系統(tǒng)，其結(jié)合了微型磁盤毛細(xì)管陣列以及LAMP技術(shù)，可對(duì)多種核酸進(jìn)行可視化監(jiān)控(圖4)[25]。該系統(tǒng)具有特異性高、靈敏度高、通量高、易于制造以及成本低等優(yōu)點(diǎn)，利于進(jìn)行現(xiàn)場多種核酸同時(shí)檢測。

圖4 mDC-LAMP陣列的程序設(shè)計(jì)。(a)模具套件的簡圖，包括圓形模具和放射狀星形模具。R：半徑；L：長度。(b)圓型模具與輻射型星模具相結(jié)合生產(chǎn)疏水處理預(yù)制支架。(c)毛細(xì)血管用特定的LAMP引物組固定，并切割成短的毛細(xì)血管用于mDC-LAMP陣列組裝。(d)組裝mDC-LAMP陣列，包括PDMS支架和短毛細(xì)管。(e)mDC-LAMP檢測示意圖，包括：(i)DNA提取和LAMP混合物制備；(ii)LAMP混合物裝載和LAMP擴(kuò)增；(iii)通過小型便攜式紫外線檢測設(shè)備、照相機(jī)或肉眼進(jìn)行檢測[25]Fig.4 Design and procedure of the mDC-LAMP array.(a) Blueprint of the mold kit,including the circle mold and the actinomorphic star mold.R:radius;L:length.(b) Combination of the circle mold and the actinomorphic star mold for producing the precast PDMS support with hydrophobic treatment.(c) Capillaries were fixed with specific LAMP primer sets and cut into short capillaries for mDC-LAMP array assembling.(d) Assembled mDC-LAMP array including the PDMS support and short capillaries.(e) Schematic illustration of mDC-LAMP analysis,including:(i) DNA extraction and LAMP mixture preparation;(ii) LAMP mixture loading and LAMP amplification;(iii) visual inspection with a small portable UV detection device,camera,or the naked eye [25]

4 即時(shí)快速檢測器件

目前，針對(duì)病毒的即時(shí)快速檢測器件主要可以歸納為層析試紙條及便攜式生物芯片兩種。

4.1 層析試紙條

在現(xiàn)代的病毒檢測中，以試紙條技術(shù)為基礎(chǔ)的快速檢測技術(shù)經(jīng)過了長時(shí)間的發(fā)展和改進(jìn)已經(jīng)越來越完善和成熟，可以顯著提高診療效率，更好支撐感染性疾病診斷以及醫(yī)院感染控制等工作，在病毒的現(xiàn)場快速檢測方面的應(yīng)用日趨廣泛。例如：Chaivisuthangkura等基于免疫夾心法開發(fā)了一種用于快速檢測傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)的試紙條。首先將靶向識(shí)別IMNV病毒表面衣殼蛋白N端的IMN7抗體修飾的納米金噴涂在結(jié)合墊上，靶向IMNV病毒表面衣殼蛋白C端的IMC6抗體以條帶狀固定在膜上作為檢測線，二抗以條帶狀固定在膜上作為質(zhì)控線。當(dāng)含有病毒的待測物流過分析區(qū)域時(shí)，會(huì)與結(jié)合墊上IMN7抗體修飾的納米金結(jié)合，在檢測線處被IMC6抗體識(shí)別富集顯色，未結(jié)合病毒的IMN7抗體修飾的納米金繼續(xù)前行與質(zhì)控線上的二抗結(jié)合富集顯色[26]。該試紙條可以在15 min內(nèi)完成檢測，且不需要任何特殊設(shè)備或技能熟練的操作人員，因而在現(xiàn)場檢測方面具備良好的應(yīng)用前景。Brangel等基于層析試紙條技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)血清中埃博拉病毒多種抗體的同時(shí)檢測，進(jìn)一步結(jié)合試紙條檢測技術(shù)與電子技術(shù)開發(fā)了一種可以直接用智能手機(jī)作為檢測器的即時(shí)快速病毒檢測方法。該方法可以高靈敏且高特異性的檢測患者愈后體內(nèi)埃博拉病毒特異性抗體(圖5)[27]。

圖5 側(cè)向流動(dòng)試紙條檢測原理。在樣品墊上，含有病毒抗體的血清將通過毛細(xì)作用流過分析區(qū)域，目標(biāo)抗體與二抗修飾的納米金結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物將與預(yù)先印好的含有病毒蛋白的檢測線結(jié)合，導(dǎo)致納米金聚集顯色。同樣，血清中埃博拉病毒的多種抗體也可以通過該方法被同時(shí)檢測[27]Fig.5 Lateral flow point-of-care test for Ebola virus IgG detection.Lateral flow strip illustration:serum applied onto the sample pad migrates through the analytical area,and subsequently forms complexes between the labeled gold nanoparticles(Au NPs) and the target analytes.Specifically,targeted IgG serum antibodies against single or multiple recombinant Ebola viral proteins bind to preprinted test lines,forming a visual red-purple line.A control line is used to validate assay function for the detection of antihuman antibody-Au NPs conjugates [27]

4.2 便攜式生物芯片

由于具有小體積、高通量、高靈敏、快速檢測的特點(diǎn)，生物芯片在病毒的核酸檢測領(lǐng)域具有許多成功的應(yīng)用。例如：Ye等利用芯片技術(shù)開發(fā)了一種便攜式微流控等溫核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，用于在現(xiàn)場即時(shí)、快速、準(zhǔn)確地檢測非洲豬瘟病毒(ASFV)(圖6)[28]。該系統(tǒng)具有檢出限低、靈敏度高、穩(wěn)定性與特異性好，同時(shí)兼具耗時(shí)較短的優(yōu)點(diǎn)，在ASFV流行病的監(jiān)測和控制中具有極好的應(yīng)用前景。Ngo等設(shè)計(jì)了一種無標(biāo)記DNA生物芯片傳感器[29]。該傳感器固定在等離子納米芯片上，基于DNA雜交時(shí)表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)強(qiáng)度會(huì)降低這一原理實(shí)現(xiàn)檢測。該芯片的制造相對(duì)簡單，成本低廉且具有較好的可重復(fù)性，因此該DNA生物傳感器具有使用簡單，測定時(shí)間短等優(yōu)勢，在現(xiàn)場即時(shí)檢測及診斷疾病方面具有優(yōu)良的應(yīng)用前景。Petkovic等開發(fā)了一種使用磁性納米粒子進(jìn)行免疫檢測的集成芯片裝置[30]。該設(shè)備的關(guān)鍵部分包含磁力驅(qū)動(dòng)的流體混合系統(tǒng)及用于裝載試劑和樣品的自動(dòng)液體處理系統(tǒng)。該設(shè)備可在15 min內(nèi)檢測出稀釋的馬血清樣品中的亨德拉(Hendra)病毒抗體，檢出限約為0.48 ng/mL。該設(shè)備有望應(yīng)用于病毒以及其它生物化學(xué)物質(zhì)的現(xiàn)場檢測。

圖6 (A)微流控芯片平臺(tái)的示意圖；(B)芯片及其樣品添加區(qū)域、通道和反應(yīng)區(qū)域的詳細(xì)視圖；(C)可隨時(shí)使用的微流控芯片的照片；(D)便攜式手持熒光檢測設(shè)備的照片[28]Fig.6 (A) Schematic of the microfluidic chip platform;(B) Detailed view of the chip with its sample adding area,channels,and reaction area;(C) Photograph of the microfluidic chip ready to use;(D) Photograph of the portable hand-held fluorescence detection equipment [28]

5 總結(jié)

病毒作為一種在許多情形下對(duì)人類生產(chǎn)生活以及生命健康威脅巨大的微生物，對(duì)它的防范一直以來都是重中之重，而對(duì)病毒的檢測則是其中十分重要的一環(huán)。對(duì)于病毒的防治來說，開發(fā)具有更加優(yōu)異指標(biāo)的檢測方法一直是一項(xiàng)重要且艱巨的任務(wù)。本論文主要介紹了一系列面向現(xiàn)場的病毒快速檢測方法。基于免疫反應(yīng)原理與核酸擴(kuò)增技術(shù)，從比色、熒光、電化學(xué)、磁等方面對(duì)病毒的抗體、抗原、核酸即時(shí)快速檢測方面最新研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。進(jìn)一步，我們以實(shí)際應(yīng)用需求為出發(fā)點(diǎn)，討論了目前用于即時(shí)快速診斷的病毒檢測器件。隨著生物學(xué)方法與其它技術(shù)如納米技術(shù)、電化學(xué)傳感技術(shù)等更多的結(jié)合，越來越多新的性能優(yōu)異的檢測方法一定會(huì)不斷涌現(xiàn)。這些方法會(huì)在原有方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升靈敏度、選擇性、特異性以及檢測速度等關(guān)鍵指標(biāo)，在現(xiàn)場快速檢測中會(huì)有更加優(yōu)異的表現(xiàn)，從而使我們得以更好的防范、應(yīng)對(duì)病毒帶來的威脅。