王鵬程，唐 淵

（1.廣東省珠海市口腔醫(yī)院，廣東 珠海519000；2.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學藥學院，重慶400038）

骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種以骨體積減少、骨小梁退化、骨力學性能下降和骨折易感性為特征的全身性疾病[1]。目前，臨床治療OP的藥物有雌激素類藥物、鈣劑維生素D、磷酸鹽、氟化物等，均有副作用，限制了臨床的使用[2－4]。中醫(yī)認為，OP是由肝血虛和腎氣虛導(dǎo)致的并發(fā)癥[5－6]，故補腎補血是中醫(yī)治療OP的主要方法。芪芎通絡(luò)膠囊有益氣活血、化痰通絡(luò)功效，主要用于治療氣虛血瘀痰阻證，癥見半身不遂、口舌歪斜、言語蹇澀或不語、偏身麻木、眩暈等，同時具有改善OP的作用。骨保護素（OPG）存在于骨組織中，其表達水平降低，可減少骨組織形成，引起嚴重的OP。核因子κB受體激活劑配體（RANKL）促進破骨細胞前體細胞增殖、分化成破骨細胞，并增強其骨吸收活性；阻斷RANK基因表達，則可抑制破骨細胞活性，改善OP的形成[7]?？诜S甲酸可促進破骨細胞形成，使得骨吸收大于骨形成，形成維甲酸性O(shè)P，其是動物實驗中常用的OP模型[8－9]。本研究中采用維甲酸灌胃方式制備小鼠OP模型，研究芪芎通絡(luò)膠囊對維甲酸導(dǎo)致小鼠OP的改善作用及作用機制，為臨床治療OP提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：TI－U型正置顯微鏡(尼康映象儀器銷售＜中國＞有限公司)；Micro CT（上海徠卡儀器有限公司）；680型酶標儀（伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品＜上海＞有限公司）；S7220－B型組織切片機（沈陽恒松科技有限公司）；5810R型離心機（艾本德中國有限公司）；CP225D型電子天平(德國賽多利斯集團，精度為0.01 mg)。

試藥：維甲酸（上海生工生物有限公司，批號為A506728）；仙靈骨葆膠囊（國藥集團同濟堂制藥有限公司，批號為A14001226041）；芪芎通絡(luò)膠囊（吉林萬通藥業(yè)股份有限公司，批號為14000219623）；血清鈣檢測試劑盒（批號為C004－3－1），血清磷檢測試劑盒（批號為C006－1－1），均購自南京建成生物工程研究所；OPG抗體（北京博奧森生物技術(shù)公司，批號為bs－20624R）；RANKL抗體（Cell Singaling Technology，批號為3959）。

動物：清潔級雌性昆明小鼠，9周齡，購自中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心（動物使用合格證號為1103221911003384）。飼養(yǎng)條件為溫度（24±1）℃，相對濕度45%～65%，光照12 h黑暗12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開展實驗，期間小鼠自由進食和飲水。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥

將48只小鼠隨機分為對照組（A組）、模型組（B組）、仙靈骨葆組（C組）和芪芎通絡(luò)膠囊高、中、低劑量組（D1組，D2組，D3組），每組8只。由于中藥粉末和維甲酸不易溶于水，采用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)配置成混懸液。除A組外，各組小鼠于每天9：00給予105 mg／kg維甲酸灌胃，14 d后用Quantum FX型小動物CT測定小鼠骨密度，確定造模是否成功。A組每天9：00繼續(xù)給予上述劑量維甲酸，C組18：00灌胃給予仙靈骨葆膠囊1.5 g／kg，D1組，D2組，D3組分別給予芪芎通絡(luò)膠囊高、中、低劑量（按生藥量計為1.8，0.9，0.45 g／kg）治療，A組和B組小鼠給予等體積的0.5% CMC－Na，持續(xù)14 d。實驗開始時和結(jié)束時，稱定動物的體質(zhì)量。

1.2.2 股骨計量學指標

取左側(cè)股骨，去除附著的軟組織，測定股骨計量學指標。股骨濕重和干重：用電子天平稱量股骨濕重和干重（mg）；股骨長度：用游標卡尺測量股骨長度（mm）；股骨直徑：分別于股骨的近端1／3點、中點、遠端1／3點，用游標卡尺量取最大外徑及最小外徑，取6個值的平均值，得股骨直徑（mm）。

1.2.3 血清鈣、磷分析和臟器指數(shù)

實驗結(jié)束時摘眼球取血，以1 000 g離心15 min，分離血清，按試劑盒說明書操作，檢測血清鈣、血清磷的含量。取血完成后處死小鼠，取肝、脾、胸腺，并稱定質(zhì)量，計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)（mg／g）＝臟器質(zhì)量（mg）／體質(zhì)量（g）。

1.2.4 骨密度分析

取小鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，運用Micro CT掃描股骨，采用Materialise軟件計算骨密度。

1.2.5 免疫組化分析

取左側(cè)股骨，用4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片，進行免疫組化實驗，以DAB顯色呈棕黃色為陽性，采用image J軟件進行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPadPrism 7軟件分析。數(shù)據(jù)以X±s表示，兩組間比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量和臟器指數(shù)

實驗?zāi)┢?，與A組相比，B組動物體質(zhì)量、胸腺指數(shù)和肝臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。與B組相比，C組、D1組、D2組、D3組的實驗?zāi)┢隗w質(zhì)量和肝臟指數(shù)均呈升高趨勢，且C組和D1組胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05），C組和D1組的脾臟指數(shù)呈下降趨勢。詳見表1。

2.2 股骨指標

與A組相比，B組小鼠股骨濕重和股骨干重均顯著降低（P＜0.05），股骨長度和股骨直徑呈降低趨勢。與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組股骨濕重和干重顯著增加（P＜0.05），股骨長度和股骨直徑有增加趨勢。詳見表2。

2.3 血清鈣、磷分析

與A組相比，B組小鼠血清鈣含量顯著降低（P＜0.05），血清磷含量顯著升高（P＜0.05）。與B組相比，C組血清鈣含量顯著升高（P＜0.05），血清磷含量顯著下降（P＜0.05）；D1組血清鈣含量顯著升高（P＜0.05），D1組、D2組、D3組血清磷含量顯著降低（P＜0.05)。詳見表3。

表1 各組小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)比較（X±s，n＝8）

表2 各組小鼠股骨指標比較（X±s，n＝8）

表3 各組小鼠血清鈣、血清磷含量比較（X±s，n＝8）

2.4 骨密度

與A組相比，B組小鼠的骨密度顯著降低（P＜0.05）；與B組相比，C組和D1組骨密度顯著升高（P＜0.05）。D2組和D3組骨密度呈升高趨勢。詳見圖1。

圖1 小鼠骨密度檢測

2.5 對骨組織中OPG／RANKL蛋白表達比值的影響

圖2 骨組織中OPG／RANKL蛋白表達比值

圖3 骨組織中OPG和RANKL蛋白表達情況

OPG／RANKL蛋白的表達比值改變是影響骨質(zhì)疏松癥的重要作用機制之一。OPG主要表達在破骨細胞的細胞膜、細胞質(zhì)或細胞核上，RANKL主要表達在細胞膜表面，免疫組化檢測以DAB顯色呈棕黃色。與A組相比，B組小鼠股骨中OPG／RANKL蛋白的表達比值顯著下降（P＜0.05）；與B組相比，C組、D1組、D2組，D3組股骨中OPG／RANKL蛋白的表達比值顯著升高（P＜0.05）。詳見圖2和圖3。

3 討論

OP常發(fā)生在老年人群體中，其主要特征為骨骼強度降低，導(dǎo)致骨折復(fù)發(fā)率增加[9]。研究發(fā)現(xiàn)，地黃、淫羊藿、黃芪、丹參、知母、補骨脂、吳茱萸等中藥不僅單味使用具有抗絕經(jīng)期OP的作用，配伍使用也有一定療效[10－11]。維甲酸可損傷性腺功能，減少雌激素分泌，使破骨細胞數(shù)量增加，骨吸收增加，骨量丟失，造成骨密度下降，可用于制備典型的動物OP模型[12]。本研究結(jié)果顯示，維甲酸造模后小鼠的體質(zhì)量、骨密度及血清鈣含量均顯著下降，血清磷含量升高，OPG／RANKL蛋白表達比值明顯下降。D1組、D2組、D3組，尤其D1組對模型小鼠OP相關(guān)指標具有明顯改善作用，可發(fā)揮抗OP作用。

OPG和RANKL信號通路是破骨細胞的重要調(diào)控通路，其表達比例是影響骨吸收的重要因素。骨組織中OPG的過度表達可增加破骨細胞的生成量，減少骨組織形成，引起OP[13]。RANKL與破骨細胞前體細胞表面RANK上的TRAF6特異性結(jié)合后，激活NF結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、c－Jun氨基末端激酶，活化T細胞核因子、蛋白激酶B等，促進破骨細胞前體細胞增殖、分化成破骨細胞，增強其骨吸收活性[14]。OPG下調(diào)和RANKL上調(diào)，將促進破骨細胞骨吸收活性，導(dǎo)致OP[15]。本研究結(jié)果顯示，芪芎通絡(luò)膠囊能上調(diào)股骨組織中OPG蛋白表達，下調(diào)RANKL蛋白表達，可抑制破骨細胞的活性，導(dǎo)致骨吸收減少，減緩骨密度的降低，減少鈣質(zhì)流失，發(fā)揮抗OP作用。

芪芎通絡(luò)膠囊是中藥復(fù)方制劑，由黃芪、三七、川芎、薟草、膽南星5味中藥組方，具有益氣活血、化痰通絡(luò)功效，主要用于輕中度動脈粥樣硬化性血栓性腦梗死氣虛血瘀痰阻證。方中，黃芪補氣血、健脾胃，常用來治療骨痛和腰膝酸軟，可改善鈣的吸收，其所含黃芪甲苷可上調(diào)OP模型鼠血清中OPG蛋白的表達、降低RANKL蛋白的表達；三七中有效成分三七總皂苷臨床廣泛用于骨折的愈合、軟組織的損傷及骨關(guān)節(jié)的損傷等，可促進成骨細胞增殖、上調(diào)骨組織中OPG蛋白的表達；川芎可有效治療甲狀腺功能亢進性O(shè)P，與丹參合用，能升高OP模型鼠血清鈣含量，增加股骨骨密度[16]。

薟草、膽南星入肝經(jīng)，具有補血作用； 薟草入腎經(jīng)，具有強筋骨作用。

本研究結(jié)果表明，芪芎通絡(luò)膠囊可能通過上調(diào)OPG／RANKL蛋白比值，調(diào)節(jié)血清鈣、血清、磷含量，改善骨密度狀況，發(fā)揮抗OP作用，但仍有待在不同種屬動物、不同OP模型中作進一步研究。