吳婷婷，朱美紅，王國平，王伙根，張森林

（1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州310014；2.嘉興恒杰生物制藥股份有限公司，浙江 嘉興314005）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）也稱退行性骨關(guān)節(jié)病、骨質(zhì)增生，是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)楹诵模饕憩F(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛腫脹、活動受限、膝關(guān)節(jié)周圍骨贅形成為特點的疾病[1]。KOA發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床癥狀不盡相同，是常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，是造成成年人膝關(guān)節(jié)功能障礙、活動障礙及殘疾的主要誘因。目前，治療KOA的方案較多，主要有基于功能鍛煉為主的非藥物保守治療、基于非甾體抗炎的解熱鎮(zhèn)痛藥物治療、基于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉或糖皮質(zhì)激素為主的治療，以及手術(shù)治療等。以上治療手段主要用于控制癥狀，減輕關(guān)節(jié)疼痛，改善部分關(guān)節(jié)功能，提高患者的生活質(zhì)量，但無法改變病情進(jìn)程及關(guān)節(jié)軟骨病理狀態(tài)[2]。自20世紀(jì)70年代，歐美、日本等國家興起“氨糖”療法，氨糖作為治療骨關(guān)節(jié)炎的首選特異性藥物，被廣泛應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)疾病的治療與預(yù)防，并取得顯著的成效。氨糖產(chǎn)品包括單純的氨糖鹽酸鹽或硫酸鹽和加入了二甲基亞砜、硫酸軟骨素、膠原蛋白等成分[3]。Native CT－Ⅱ是一種從動物軟骨組織中提取的、完整保留膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的非變性Ⅱ型膠原蛋白，相對分子質(zhì)量在300 000。與目前市場上的膠原蛋白產(chǎn)品相比，其最大的區(qū)別在于目前的膠原蛋白產(chǎn)品實質(zhì)上都是大分子膠原蛋白經(jīng)酶解后，三、四級結(jié)構(gòu)已完全被破壞的膠原蛋白肽，平均相對分子質(zhì)量在10 000以下[4]。本研究中通過構(gòu)建單碘乙酸誘導(dǎo)的大鼠KOA模型，考察Native CT－Ⅱ?qū)OA的潛在治療價值，并對比市售氨糖硫酸軟骨素鈉治療效果的差異?，F(xiàn)報道如下。

1 動物、試藥與儀器

1.1 動物

72只SPF級健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量為（150±20）g，由浙江省醫(yī)科院實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK（浙2014－0001）。所有大鼠均于SPF級環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，12 h明／12 h暗，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后構(gòu)建KOA模型。

1.2 試藥

Native CT－Ⅱ（白色粉末），氨基葡萄糖硫酸軟骨素鈉[氨基葡萄糖鹽酸鹽－硫酸軟骨素鈉（3∶1）白色粉末]，均購自嘉興恒杰生物制藥股份有限公司；阿司匹林（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號為20180315）；單碘乙酸（上海阿拉丁生化科技公司，純度為98%）；戊巴比妥鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司）；酶聯(lián)免疫白細(xì)胞介素10(IL－10)、腫瘤壞死因子－α(TNF－α)、白細(xì)胞介素6(IL－6)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF－β)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP－13)、前列腺素E2(PGE2)、Ⅱ型膠原交聯(lián)羧基肽(CTX－Ⅱ)試劑盒，均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 儀器

全波長酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）；BS124S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精度為0.001 g）BW－GAL1404型步態(tài)實時檢測分析處理系統(tǒng)（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；3－18k型低溫高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司）；Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 動物分組與模型建立

將72只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為假手術(shù)組（A組）、模型組（B組）、氨基葡萄糖硫酸軟骨素鈉組（C組，GS 100 mg／kg）、Native CT－Ⅱ高劑量 組（D1組，Native CT－Ⅱ8 mg／kg）、Native CT－Ⅱ低劑量組（D2組，Native CT－Ⅱ4 mg／kg）、阿司匹林組（E組，Aspirin 75 mg／kg）。分籠飼養(yǎng)。

配制40 mg／mL單碘乙酸生理鹽水溶液（MIA溶液）適量，彎曲大鼠左膝關(guān)節(jié)，使關(guān)節(jié)間隙充分顯露后，除A組外各組大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射50μL MIA溶液誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎[5]；A組大鼠左膝關(guān)節(jié)注射50μL生理鹽水。次日，分別給予動物灌胃不同藥物，A，B組灌服等體積生理鹽水，每天1次，共5周。

2.1.2 觀察指標(biāo)

大鼠步態(tài)分析：給藥第5周后，采集無停頓通過走道時的步態(tài)數(shù)據(jù)，包括大鼠瞬時速度、左后足支撐力、左后步幅。步態(tài)實時檢測分析系統(tǒng)會對采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行自動分析，并得到一系列靜態(tài)、動態(tài)及協(xié)調(diào)性等參數(shù)，以判斷藥物對KOA的改善程度。

大鼠血清炎性因子含量測定：麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈取血，靜置45 min以上，于4℃、3 000 r／min條件下離心15 min，分離得血清，分裝－80℃凍存。采用ELISA試劑盒測量血清IL－10，TNF－α，IL－6，TGF－β，MMP－13，PGE2，CTX－Ⅱ水平。

大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理形態(tài)觀察：10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠，取出左側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，生理鹽水沖洗血水，置4%多聚甲醛固定48 h，然后置含EDTA的脫鈣液中脫鈣60 d，取出軟骨進(jìn)行HE染色，并觀察各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨病理形態(tài)變化。

2.1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料采用±s表示，多樣本采用單因素方差（One－way ANOVA）分析，組間比較采用Bonferroni校正的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 結(jié)果

2.2.1 對大鼠步態(tài)的影響

給藥第5周后，通過步態(tài)實時檢測分析，獲得大鼠行進(jìn)的足跡信息；通過測量分析各組大鼠無停頓通過走道時的步態(tài)數(shù)據(jù)，判斷Native CT－Ⅱ的藥效。結(jié)果表明，與A組相比均下降，且與B組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），證明KOA引起動物的行走障礙經(jīng)藥物治療5周后，在步態(tài)各項指標(biāo)中均表現(xiàn)出明顯的修復(fù)作用，各組藥物對瞬時速度的改善尤為明顯，與B組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），其中，D1組藥效明顯優(yōu)于C組；在左后步幅指標(biāo)中，D2組與C組藥效相當(dāng)，對大鼠左后步幅均有明顯改善，與B組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；對大鼠左后足支撐力指標(biāo)的分析表明，只有D1組有明顯改善作用，與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見圖1。

2.2.2 對大鼠血清中炎性因子的影響

與A組相比，B組大鼠血清IL－6，PGE2，TNF－α，TGF－β，MMP－13，CTX－Ⅱ含量顯著升高（P＜0.05）；IL－10顯著降低（P＜0.01）。連續(xù)給藥5周后，與B組相比，C，D1，D2，E組的CTX－Ⅱ含量顯著降低（P＜0.01）；僅D1組和E組TGF－β顯著降低（P＜0.01），與模型組比較，其余各組呈降低的趨勢，卻無顯著差異（P＞0.05）；IL－6，PGE2，TNF－α，MMP－13，Native CT－Ⅱ均有較好改善。與B組比較，給藥5周后，D1，D2，E組的IL－10含量顯著提升，（P＜0.01）。詳見圖2。

2.2.3 對單碘乙酸誘導(dǎo)大鼠KOA軟骨病理學(xué)的影響

各組大鼠關(guān)節(jié)組織染色切片，顯微鏡光鏡100倍視野下用國際骨關(guān)節(jié)炎研究學(xué)會（OARSI）軟骨組織病理學(xué)評分系統(tǒng)，由2名獨立觀察者對軟骨組織病理學(xué)進(jìn)行分級評分[6]。A組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨具有完整光滑表面，且未觀察到軟骨損傷、滑膜侵襲或骨破壞，未觀察到炎性細(xì)胞浸潤。B組大鼠的膝關(guān)節(jié)病理組織學(xué)圖片可見滑膜組織增生，炎性細(xì)胞聚集于滑膜組織周圍，并向關(guān)節(jié)腔侵襲，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞和骨侵蝕，與A組比較，病理學(xué)評分有顯著差異（P＜0.01）；與模型組相比，E組可顯著緩解KOA大鼠滑膜組織的增生，明顯減少炎性細(xì)胞在滑膜組織周圍的聚集，未觀察到明顯的軟骨損傷和骨侵蝕（P＜0.01）；C，D1，D2組可不同程度地緩解KOA大鼠的癥狀，減少骨侵蝕，抑制滑膜增生，但仍可觀察到軟骨損傷（P＜0.01，P＜0.05）。病理組織學(xué)分析結(jié)果表明，Native CT－Ⅱ?qū)τ贙OA大鼠的膝骨關(guān)節(jié)具有保護(hù)作用，但不及阿司匹林。詳見圖3和表1。

圖1 各組大鼠步態(tài)分析

圖2 各組大鼠血清中各炎性因子含量變化

圖3 各給藥組對單碘乙酸所致KOA大鼠膝關(guān)節(jié)HE染色結(jié)果的影響

表1 對單碘乙酸所致KOA大鼠膝關(guān)節(jié)OARSI病理學(xué)評價（X±s，分，n＝5）

3 討論

KOA的治療原則一般為緩解疼痛，延緩病情進(jìn)展，盡量避免膝關(guān)節(jié)畸形，改善肢體功能，提升生存質(zhì)量[7]。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生時，炎性反應(yīng)貫穿始終。期間，以IL－1，TGF－β，IL－6，TNF－α為主的促炎性因子增多，引起軟骨基質(zhì)降解和軟骨細(xì)胞損傷；而抗炎細(xì)胞因子IL－4，IL－10，IL－13等分泌減少，抗炎細(xì)胞因子可增強(qiáng)軟骨組織的修復(fù)能力，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，降低軟骨組織的損傷[8－10]。同時，KOA的主要病理特征是大的關(guān)節(jié)軟骨損傷，其特征是軟骨穩(wěn)態(tài)、滑膜激活和軟骨下骨重建的進(jìn)行性喪失。MMP－13是靶向軟骨降解的主要酶，與其他MMP相比，MMP－13的表達(dá)更局限于結(jié)締組織，不僅可降解軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白，還可降解軟骨中的蛋白多糖，Ⅳ型和Ⅸ型膠原蛋白，骨黏連蛋白和基底膜蛋白聚糖，故MMP－13在KOA的軟骨降解中扮演著重要角色[11]。

非變性Ⅱ型膠原蛋白的作用機(jī)制是口服后在胃蛋白酶和胃酸作用下，其三螺旋結(jié)構(gòu)分解螺旋為可溶性大分子結(jié)構(gòu)，經(jīng)腸道內(nèi)的抗原肽細(xì)胞APC在細(xì)胞內(nèi)將外源性抗原非變性Ⅱ型膠原蛋白加工、處理，并形成MHC－抗原肽復(fù)合體，然后遞呈在APC的表面，激活調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗炎性因子IL－4和IL－10，下調(diào)T淋巴細(xì)胞攻擊關(guān)節(jié)內(nèi)膠原活性，從而減輕疼痛和改善炎癥[12－13]。20世紀(jì)90年代，已有Ⅱ型膠原蛋白改善關(guān)節(jié)炎的研究[14]，近年來國內(nèi)也開展了Ⅱ型膠原蛋白的相關(guān)研究[15]。Native CT－Ⅱ是一種從動物軟骨組織中，采用低溫提取技術(shù)，得到的完整保留大分子膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的非變性Ⅱ型膠原蛋白，相對分子質(zhì)量為300 000。與目前市場上的膠原蛋白產(chǎn)品相比，其最大的區(qū)別在于現(xiàn)的膠原蛋白產(chǎn)品實質(zhì)上都是大分子膠原蛋白經(jīng)酶解后，三、四級結(jié)構(gòu)已完全被破壞的膠原蛋白肽，平均相對分子質(zhì)量在10 000以下。

KOA癥狀與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎不同，臨床多采用阿司匹林治療，故以阿司匹林為第1組陽性藥，目的是以此檢測方法的正確性；氨基糖硫酸軟骨素鈉是目前市售的生物多糖的非處方藥，而Native CT－Ⅱ是生物多糖，故設(shè)置氨基糖硫酸軟骨素鈉為第2組陽性藥，目的在于比較兩類多糖藥效的不同。Native CT－Ⅱ干預(yù)5周后，3D步態(tài)分析結(jié)果表明，B組大鼠往往因疼痛形成特有的疼痛步態(tài)，如步態(tài)瞬時速度緩慢，患足支撐時相時間縮短及患足步幅變窄等，其原因是KOA大鼠通過放慢行動速度來減少單支撐相時間，增加雙支撐相時間。Native CT－Ⅱ給藥組可增加大鼠的行進(jìn)速度，進(jìn)而說明Native CT－Ⅱ可緩解KOA引起的疼痛。血清學(xué)指標(biāo)檢測顯示，B組大鼠血清中促炎因子TNF－α，IL－6，TGF－β，PGE2的含量顯著升高，特定切割破壞Ⅱ型膠原蛋白網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)的MMP－13含量，以及Ⅱ型膠原蛋白代謝產(chǎn)物CTX－Ⅱ的含量均顯著升高，證明KOA模型制作成功。經(jīng)Native CT－Ⅱ干預(yù)5周后，D1組大鼠血清TNF－α，IL－6，TGF－β，PGE2含量均顯著降低，IL－10含量顯著升高，MMP－13和CTX－Ⅱ濃度下降，表明大鼠軟骨降解的癥狀得到了改善。同時，病理學(xué)結(jié)果表明，給藥組較模型組大鼠骨關(guān)節(jié)病理組織損傷有恢復(fù)的趨勢。

綜上所述，Native CT－Ⅱ?qū)蔚庖宜崴麓笫驥OA具有良好的改善作用，其作用機(jī)制可能與降低血清 中TNF－α，IL－6，TGF－β，MMP－13，PGE－2，CTX－Ⅱ的水平，升高IL－10水平有關(guān)。