王 楠，廖 莎，陳 璐，黃 超，曹森林，范利鋒，王 瑩

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰442000；2.湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院生命科學(xué)研究所，湖北 十堰442000）

乳腺癌是女性腫瘤中最常見的、死亡率最高的惡性腫瘤[1]，臨床主要通過外科手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療（簡稱化療）相結(jié)合的綜合治療方式來提高患者的生存率[2]，尤其是轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的最佳選擇[3]，但化療存在惡心嘔吐、食欲缺乏、毛發(fā)脫落等副作用，導(dǎo)致后期生存質(zhì)量嚴(yán)重下降[4]。體外研究表明，上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在乳腺癌轉(zhuǎn)移到其他器官的過程中起到重要作用，其作用機制為上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的生物特性[5]?；熞部赡軐?dǎo)致腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，促進其發(fā)生、發(fā)展[6]，故需找到一種溫和的治療方法來提高乳腺癌患者的生存率。人參為五加科植物，具有補氣養(yǎng)血、增強免疫力、維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定等作用[7]，人參有30多種人參皂苷單體，其中人參皂苷Rg1，Re，Rb1為主要效應(yīng)成分[8]。人參皂苷對多種腫瘤都有很好的治療作用，其中人參皂苷Rb1對白血病、胃癌和卵巢癌都有一定的治療效果[9]。Ⅰ型受體酪氨酸激酶樣孤兒受體（ROR1）是一種Ⅰ型跨膜蛋白，在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生過程中表達[10]。ROR1在正常組織(甲狀旁腺、胰島、食道、胃和十二指腸[11])等有表達，但在白血病中為過表達，在乳腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌[12]等實體腫瘤中尤為突出，且具有促進乳腺癌細(xì)胞增殖，抗凋亡和EMT[13]的作用，增強了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本研究中探討了人參皂苷Rb1能否通過影響人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞EMT及ROR1的表達來減緩乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試藥與儀器

細(xì)胞：人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

試藥：人參皂苷Rb1（批號為100712－201223，中國食品藥品檢定研究院）；RPMI1640培養(yǎng)基（批號為502315），胎牛血清（批號為403652），胰蛋白酶（批號為202314），均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號為601452，美國Sun－Shine公司）。

儀器：ClassⅡ型生物安全柜（瑞士Liestal公司）；600型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Labconco公司）；SE115B型電泳儀（美國Thermo公司）；5320R 4℃離心機，TA500型倒置顯微鏡，均購自德國徠卡公司；LDZX－50K型高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞復(fù)蘇后，將人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞株置含有10%胎牛血清、青霉素（每1 mL 100 U）和鏈霉素（100μg／mL）的RPMI1640培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)基，在細(xì)胞覆蓋率達70%時使用胰蛋白酶消化、傳代。

MTT法檢測細(xì)胞存活率：取對數(shù)生長期的人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞，胰蛋白酶消化2 min，輕微吹打，制作細(xì)胞懸液，2 000 r／min離心10 min，棄上清液，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，輕微吹打，使細(xì)胞懸浮，接種至96孔板，每孔100μL，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基，加入培養(yǎng)基稀釋的人參皂苷Rb1溶液，使溶液質(zhì)量濃度分別為500，250，125，62，31，15，7.5，3.75μg／mL，設(shè)置為人參皂苷Rb11～8組，另設(shè)空白對照組和陽性對照組（順鉑，10μg／mL），各組6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基，加入100μL 10%MTT的空白培養(yǎng)基（5 mg／mL MTT）中，培養(yǎng)4 h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜100μL，振蕩混勻10 min，采用酶標(biāo)儀分別于470 nm和590 nm波長處檢測吸光度值（A），重復(fù)3次，按公式計算細(xì)胞生長抑制率[IC50為15.42μg／mL]。

細(xì)胞抑制率（%）＝給藥組吸光度／對照組吸光度×100%

細(xì)胞劃痕法檢測人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞遷移能力：指定時間內(nèi)，用不同質(zhì)量濃度的人參皂苷Rb1（3.75～500μg／mL）處理細(xì)胞，并確定后續(xù)試驗的最佳質(zhì)量濃度。將細(xì)胞以高密度接種于培養(yǎng)板，粘附，過夜。分別加入質(zhì)量濃度為60，120，240μg／mL的人參皂苷Rb1、陽性對照藥物阿霉素75 nmol／L和空白對照，24 h后觀察細(xì)胞遷移。在劃痕（0 h）和24 h后使用TA500型倒置顯微鏡獲得刮擦的圖像。檢查劃痕間隙，并將間隙差異標(biāo)準(zhǔn)化為劃痕的0 h間隙距離。

人參皂苷Rb1干預(yù)后人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞ROR1 mRNA表達水平檢測：提取各組人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為總RNA 1μL，10mM dNTP混合物1μL，Oligo（dT）20（50μmol／L）1μL，DEPC水9μL，混勻后65℃加熱5 min，迅速置冰上冷卻，瞬時離心后加入，第一鏈合成緩沖液4μL，0.1 mmol／L DDT 2μL，核酸酶抑制劑1μL，充分混勻，37℃孵育2 min，加 入1μL（200 U）M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻，37℃孵育50 min后再70℃加熱15 min，終止反應(yīng)。實時定量PCR試劑盒測定相關(guān)mRNA表達水平，PCR引物序列，ROR1正向引物5′－ATAGGCTCTATATATGCGAGTACG－3′，反向引物5′－TACCATCAGCAGAAGCATATTCAC－3′。實時定量反應(yīng)體系為SYBR Green qPCR SuperMix 16.00μL，上游引物（5μmol／L）3.50μL，下游引物（5μmol／L）3.50μL，模板DNA 3.00μL，DEPC水6.5μL，總共32.5μL。反應(yīng)條件：95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，10 s；共40個循環(huán)。每個樣品做3個復(fù)孔，通過相對基因定量方法（2－ΔΔCT法）計算、分析mRNA表達水平。

人參皂苷Rb1干預(yù)后人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞ROR1蛋白表達水平檢測：在無菌操作臺上去除細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)基，加入1 mL PBS溶液和100μL蛋白酶K溶液，刮培養(yǎng)皿底部10 min，使細(xì)胞懸浮于溶液中，將液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，用超聲細(xì)胞破碎儀(3 000 r／min，2 min)使細(xì)胞破碎，4℃離心20 min，取上清液，置1支新的1.5 mL EP管中。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測細(xì)胞中的ROR1蛋白水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以X±s表示，通過單因素方差分析并采用LSD－t法進行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對細(xì)胞存活率的影響

隨著人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度的增加，人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞存活率逐漸降低。與空白對照組比較，陽性對照組和人參皂苷Rb1組（1～8組）人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞存活率與人參皂苷Rb1的質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)，人參皂苷Rb11組（500.00μg／mL）與陽性對照組比較，對人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞存活率的影響無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 不同質(zhì)量濃度人參皂苷Rb1對人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞生長的影響（n＝3）

2.2 對細(xì)胞遷移能力的影響

與空白對照組比較，給予人參皂苷Rb1和阿霉素處理后，人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞的遷移能力降低，隨著人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度的增加，人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞的遷移能力逐漸降低（P＜0.05），且呈明顯的量－效關(guān)系。人參皂苷Rb1高劑量組和陽性對照組對人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞遷移能力的影響效果無顯著差異（P＞0.05）。詳見表2和圖1。

圖1 人參皂苷Rb1對人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞遷移能力的影響

表2 不同質(zhì)量濃度人參皂苷Rb1對人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞遷移能力、ROR1 mRNA表達和ROR1蛋白表達的影響（n＝3）

2.3 干預(yù)后細(xì)胞ROR1 mRNA表達水平檢測結(jié)果

與空白對照組比較，人參皂苷Rb1各劑量組和陽性對照組，人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞ROR1 mRNA表達水平降低，隨著人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度的增加，人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞ROR1 mRNA表達水平逐漸降低（P＜0.05），且呈明顯的量－效關(guān)系。人參皂苷Rb1高劑量組和陽性對照組對人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞ROR1 mRNA表達水平的影響無顯著差異。結(jié)果見表2。

2.4 干預(yù)后細(xì)胞ROR1蛋白表達水平檢測結(jié)果

與空白對照組比較，人參皂苷Rb1各劑量組和陽性對照組，人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞ROR1蛋白表達水平降低，隨著人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度的增加，人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞ROR1蛋白表達水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈明顯的量－效關(guān)系。人參皂苷Rb1高劑量組和陽性對照組對人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞ROR1蛋白表達水平的影響無顯著差異。結(jié)果見表2。

3 討論

乳腺癌的分子異質(zhì)性導(dǎo)致亞命名，而這些亞命名對預(yù)后、治療反應(yīng)和／或疾病進程具有信息意義[14]。乳腺癌可通過多種轉(zhuǎn)移侵入機制進入其他組織器官，加重病情，但多數(shù)研究結(jié)果表明，EMT在乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到了重要作用[15]。發(fā)生EMT時，腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮伍g充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附力和極性喪失，且伴有神經(jīng)型鈣黏蛋白和波形蛋白的表達水平增加，上皮型鈣黏蛋白表達水平降低，導(dǎo)致細(xì)胞遷移能力和侵襲能力增加，促進原發(fā)腫瘤的傳播[16]。

ROR1在胚胎發(fā)育中表達，在許多上皮性腫瘤和某些B細(xì)胞惡性腫瘤中表現(xiàn)出高水平和均勻的細(xì)胞表面表達。許多腫瘤中ROR1的表達與預(yù)后不良密切相關(guān)[17]，其在腫瘤中的重要作用促使早期的治療研究，包括抗ROR1抗體、抗體藥物結(jié)合物（抗體與細(xì)菌毒素融合）的開發(fā)、嵌合抗原受體T細(xì)胞治療及小分子抑制劑等[14]。給予iRNA干擾具有轉(zhuǎn)移傾向的乳腺癌細(xì)胞系中ROR1 mRNA的表達，或干擾ROR1蛋白的合成后，能抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，同時減少EMT相關(guān)基因的表達水平，表明ROR1可能是乳腺癌的治療潛在靶點。

人參中的人參皂苷種類有30多種，其中人參皂苷Rb1為其重要組成成分，可抑制體外細(xì)胞的遷移能力，降低EMT標(biāo)志物的表達，防止乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可激活雌激素反應(yīng)細(xì)胞中相關(guān)通路蛋白的表達，降低乳腺癌細(xì)胞活性，促進其凋亡，同時可抑制乳腺癌患者體內(nèi)相關(guān)促癌因子的表達，降低乳腺癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率[18]。

本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1可抑制人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞的生長，在給予人參皂苷Rb1干預(yù)后，人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞的生長受到抑制，且隨著人參皂苷Rb1干預(yù)劑量的增加，對人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞的抑制率逐漸升高。通過細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，隨著人參皂苷Rb1劑量的增加，細(xì)胞遷移距離逐漸降低，表明人參皂苷Rb1可能通過抑制人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化來抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，達到防止乳腺癌細(xì)胞進一步擴散的目的。ROR1可促進人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞的繁殖及遷移能力，干預(yù)后，ROR1 mRNA和蛋白表達均受到抑制，表明ROR1可能是人參皂苷Rb1的一個作用靶點，通過作用ROR1基因的表達來抑制人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞的繁殖，達到防止乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，為乳腺癌的治療提供了新思路，與細(xì)胞遷移力和MTT實驗的結(jié)果相一致。因此，人參皂苷Rb1可能是通過抑制人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞遷移和ROR1的表達來抑制乳腺癌的發(fā)生。

綜上所述，人參皂苷Rb1可能通過抑制人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞EMT和ROR1表達來減緩乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，為乳腺癌的治療提供了新的研究方向。