張衛(wèi)瑋，李芬，鐘幸

(1.江西衛(wèi)生職業(yè)學院，南昌330052；2.江西省腫瘤醫(yī)院淋巴血液科，南昌330029；3.江西省惠民醫(yī)院，南昌330046)

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤， 其死亡率占女性癌癥相關死亡率的第二位,晚期乳腺癌預后較差，臨床上迫切需要尋找新的治療靶點[1-3]。DNA 損傷反應調節(jié)基因1 (regulated in DNA damage and development1，REDD1) 在正常組織中REDD1 低表達，而當組織缺氧、細胞應激、DNA 損傷可誘導REDD1 高表達[4]。 研究表明，REDD1 是一種新的癌基因，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、放化療敏感性密切相關,抑制REDD1 表達可促進中卵巢癌、腎癌、頭頸部鱗癌等細胞凋亡、抑制細胞增殖，然而其在乳腺癌中的作用及機制尚不明確[5-7]。 磷脂酞肌醇3 激酶(PI3K)在腫瘤細胞調節(jié)中起著重要作用[8,9]。 REDD1 是PI3K/AKT 通路的重要調控蛋白，REDD1 可磷酸化激活PI3K/AKT 通路， 抑制細胞凋亡、促進細胞增殖，幫助腫瘤細胞在不良環(huán)境中存活[10,11]。 本研究擬從REDD1 介導PI3K/AKT 通路調控乳腺癌細胞凋亡的角度，闡述REDD1 在乳腺癌中的生物學功能及機制，為乳腺癌提供潛在的新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料和組織標本 收集2017 年1 月-2018 年1 月江西省腫瘤醫(yī)院粗針穿刺活檢診斷為浸潤性乳腺癌患者的術后新鮮標本30 例（乳腺癌腫瘤組織及其相應的癌旁正常組織），檢測其組織中REDD1 蛋白、mRNA 表達水平。 本研究的倫理批準由江西腫瘤醫(yī)院倫理委員會提供。

1.1.2 細胞及主要試劑 人乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231 細胞由江西省腫瘤轉化醫(yī)學重點實驗室提供。 DMEM 細胞培養(yǎng)基、胎牛血清等購自ThermoFisher 公司。 兔抗人REDD1 單克隆抗體、 兔抗人PI3K 單克隆抗體、 兔抗人AKT 及pAKT 單克隆抗體、 兔抗人Caspase3 單克隆抗體、兔抗人Bcl-xl 抗體、 兔抗人β-actin 及HRP 偶聯(lián)的抗兔IgG 二抗均購自CellSignaling 公司。 RNA提取及RT-qPCR 試劑盒購自ThermoFisher 公司。siRNA 及Hiperfect 轉染試劑購自ThermoFisher 公司。 Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒購自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌細胞株MCF-7 和MDA-MB-231 細胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM, 于37℃含5%CO2的飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 待細胞生長覆蓋70%-80%瓶底面積時，用于實驗操作或傳代。

1.2.2 siRNA 轉染 將MCF-7 和MDA-MB-231 細胞按5×104/孔的密度分別接種于6 孔板中，待細胞融合度為30%-50%時， 使用Hiperfect 轉染試劑，分別轉染siRNA- REDD1/NC， 放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，進行后續(xù)實驗操作。

1.2.3 Western-blot 提取各處理組蛋白，等量蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳后， 穩(wěn)流將蛋白轉至甲醇預處理的PVDF 膜上，轉膜、封閉后按流程分別加入一抗(1:1000) 和二抗(1:5000)。 于MYECL Imager系統(tǒng)曝光。

1.2.4 RNA 提取和逆轉錄-定量PCR (RT-qPCR)總RNA 提取使用TRIzol， 逆轉錄及擴增反應采用RT-qPCR 試劑盒（SYBR Green）。 逆轉錄(20μl 體系)：42℃1h, 95℃10min。 qPCR (10μl 體系)：95℃3min，95℃15s，60℃30s，再循環(huán)擴增39 次。 基因相對表達水平采用2-ΔΔCq 計算方法。 引物序列如下:

1.2.5 細胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期各處理組細胞制成單細胞懸液，Cell Staining Buffer 洗2 次，加入100μl Binding Buffer、5μl Annexin V-FITC、10ul PI, 室溫避光30min， 檢測前加入400μl Binding Buffer，1h 內上機檢測細胞凋亡。 每組設3 孔平行樣。 使用FlowJo 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果

2.1 REDD1 在乳腺癌組織中高表達 在25 對乳腺癌及其癌旁組織，RT-qPCR 結果提示REDD1 mRNA 在乳腺癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織(圖1A)。 在5 對乳腺癌（T）及其癌旁正常組織（N），Western-blot 結果顯示REDD1 蛋白在乳腺癌組織中表達水平顯著高于癌旁正常組織(圖1B)。

圖1 REDD1 在乳腺癌組織中過表達。（A）RT-qPCR 檢測25 例乳腺癌組織及其癌旁正常組織中REDD1 mRNA 表達水平。（B）Western-blot 檢測5 例乳腺癌組織及其癌旁正常組織中REDD1蛋白表達水平

2.2 siRNA-REDD1 成功下調REDD1 表達水平為了進一步探索REDD1 生物學功能， 我們使用siRNA-REDD1/NC 轉染MCF-7 和MDA-MB-231細胞，siRNA-REDD1 成功下調REDD1 蛋白及mRNA 表達水平(圖2A&B)。

圖 2 MCF-7 和 MDA-MB-231 細 胞 分 別 轉 染siRNA-REDD1/NC。（A）RT-qPCR 檢測轉染后REDD1 mRNA表達水平（B）Western-blot 檢測轉染后REDD1 蛋白表達水平

2.3 下調REDD1 促進乳腺癌細胞凋亡 使用siRNA-REDD1/NC 分別轉染MCF-7 和MDA-MB-231 細胞后， 流式AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡率（±s）。 結果顯示(圖3A)，MCF-7 細胞中對照組（REDD1-NC）凋亡率為(16.5±5.08)%，而REDD1 下調組凋亡率明顯升高，為(29±2.08)%；同樣，在MDA-MB-231 細胞中，對照組凋亡率為(17.4±1.38)%，而REDD1 下調組凋亡率(36.7±1.25)%。同時，我們檢測了凋亡蛋白cleaved caspase3(斷裂caspase3)和凋亡抑制蛋白Bcl-xl 表達水平，結果顯示（圖3B），REDD1 下調組抗凋亡蛋白BCL-xl 下降，cleaved-capase3 上升。

圖 3 MCF-7 和 MDA-MB-231 細 胞 分 別 轉 染siRNA-REDD1/NC。（A）AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測各組細胞凋亡率。（B）Western-blot 檢測MCF-7 細胞中凋亡相關蛋白cleaved-caspase3 和BCL-xl

2.4 下調REDD1 抑制PI3K/AKT 通路蛋白表達水平 為了探討下調REDD1 促進細胞凋亡的分子作用機制，使用siRNA-REDD1/NC 轉染MCF-7 細胞后行western-blot 檢測PI3K、AKT、pAKT 蛋白表達水平。結果顯示，siREDD1 組PI3K、pAKT 蛋白表達水平低于NC 組，AKT 蛋白表達無差異。 提示下調REDD1 可抑制PI3K/AKT 通路磷酸化激活(圖4)。

圖4 MCF-7 細胞轉染siRNA-REDD1/NC，Western-blot檢測凋亡相關蛋白PI3K/AKT 通路蛋白表達

3 討論

DNA 損傷反應調節(jié)基因1 ( regulated in DNA damage and development 1，REDD1 )是Shoshani 等在研究神經(jīng)膠質瘤細胞乏氧時發(fā)現(xiàn)的、 因細胞缺氧誘導表達的一種基因。 在人體正常組織中，REDD1 廣泛低表達， 然而在腫瘤組織中，REDD1常呈現(xiàn)高表達，REDD1 高表達有助于幫助腫瘤細胞在組織乏氧、能量壓力、DNA 損害等的不良環(huán)境中存活[12]。 然而，REDD1 在腫瘤中可兼具抑癌、促癌功能， 表現(xiàn)在不同腫瘤、 不同環(huán)境中的功能不同。 研究表明REDD1 過表達可介導PI3K/AKT 促進前列腺細胞凋亡抵抗[10]，而另有研究卻顯示乏氧狀態(tài)可誘導REDD1 高表達、抑制mTOR，抑制前列腺癌細胞增殖[13]。 在卵巢癌中，REDD1 是ras 介導的人卵巢上皮是細胞癌變轉化的重要因子，REDD1 高表達可促進卵巢上皮細胞增殖、 抑制細胞凋亡[12,14]。 沉默REDD1 可抑制細胞自噬提高膀胱癌化療敏感性[15]。 然而，在乳腺癌中的作用及機制尚不明確。

本研究首先檢測了乳腺癌組織及癌旁組織中REDD1 表達水平，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中REED1 在基因及蛋白水平上均明顯高于癌旁正常組織， 提示REDD1 在乳腺癌中的作用可能為癌基因, 與孫麗麗等在卵巢癌中的研究結果一致[16]。進一步功能學研究顯示，使用siRNA 下調REDD1 表達后，乳腺癌MCF-7 和MDA-MB-231 細胞凋亡率明顯升高，凋亡蛋白cleaved-caspase3 升高，而凋亡抑制蛋白Bcl-xl 下降，抑制REDD1 表達可促進乳腺癌細胞凋亡，提示REDD1 可能參與調控乳腺癌細胞凋亡途徑。 然而，本研究未構建REDD1 過表達模型，具有一定的局限性，后續(xù)研究將進一步完善。

在乳腺癌中，P13K/AKT 信號通路激活與腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、轉移等惡性表型密切相關。癌基因過表達或抑癌基因突變均可上調PI3K/AKT通路表達，促進乳腺癌細胞惡性表型[17-20]，PI3K 抑制劑LY294002 可顯著性下調PI3K/AKT 通路從而抑制乳腺癌生長[21-23]。 本研究結果顯示,下調RED D1 表達可抑制PI3K/AKT 通路磷酸化激活， 促進乳腺癌細胞凋亡， 說明REDD1/PI3K/AKT 是調控乳腺癌細胞凋亡途徑的通路之一，但PI3K/AKT 通路是否為REDD1 主要的分子調控通路，還需要進行阻斷-恢復實驗進一步論證。

綜上，REDD1 在乳腺癌中高表達， REDD1 介導PI3K/AKT 通路調控乳腺癌細胞凋亡途徑，REDD1 可能為乳腺癌潛在新的靶基因。