邵明昊 靳明明 周 萍 鄭超君 朱 巍 馬曉生 呂飛舟

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院脊柱外科，上海 200040)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是脊柱損傷最嚴(yán)重的并發(fā)癥，往往導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體嚴(yán)重功能障礙。全世界約有250萬(wàn)人患有SCI，且以每年約130 000例的速度增加[1]。SCI的病理過程分為原發(fā)性和繼發(fā)性損傷2個(gè)階段，而SCI后的繼發(fā)性損傷階段已被證明是關(guān)鍵的治療時(shí)期，此期間可以實(shí)施神經(jīng)保護(hù)治療以阻止神經(jīng)進(jìn)一步壞死、促進(jìn)功能恢復(fù)?，F(xiàn)有證據(jù)表明多種代謝因子在SCI繼發(fā)性損傷的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[2]。

腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是能量代謝的主要傳感器，通過與ATP、ADP、AMP等結(jié)合，在能量水平下降的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。與ATP結(jié)合時(shí)，AMPK活性被抑制，在能量釋放期間，細(xì)胞內(nèi)AMP水平升高，導(dǎo)致AMPK活化，并增加細(xì)胞分解代謝能力，產(chǎn)生更多ATP。作為調(diào)節(jié)因子，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子豐富時(shí)被激活[3]。

外5′-核苷酸酶(CD73)是一種大小約為70 kD的糖基化蛋白，位于外質(zhì)膜上，其功能是將AMP水解為腺苷和磷酸鹽[2，4，5]。超過85%的小鼠AMP在CD73的作用下迅速降解為腺苷，最終使細(xì)胞內(nèi)cAMP積累，同時(shí)抑制局部免疫反應(yīng)，因此認(rèn)為CD73與炎癥相關(guān)的腦發(fā)育疾病密切相關(guān)[1，6-8]。此前，課題組確定了CD73在神經(jīng)保護(hù)作用中的內(nèi)在作用，這種作用是通過介導(dǎo)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞極化發(fā)生的[9-12]。本研究旨在探討CD73對(duì)脊髓損傷后AMPK的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6 CD73基因敲除(KO)雄性小鼠由美國(guó)俄克拉何馬州醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)湯普森教授惠贈(zèng)，野生型(WT)雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自上海SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并按照其指導(dǎo)方針執(zhí)行。

1.1.2主要試劑與儀器 TruSeq鏈mRNA-LT樣品制備試劑盒(Illumina，San Diego，California，USA)；三唑試劑(Invitrogen，San Diego，CA，USA)；ImProm llTM逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega，Madison，WI，USA)二級(jí)抗體(Jackson Immunology Research，West Grove，PA，USA)；倒置顯微鏡(Ti2，尼康，日本)；凝膠成像系統(tǒng)(UVP LLC，Upland，CA，USA)；凝膠Pro分析儀軟件(Media controlnetics，Rockville，MD，USA)

1.2方法

1.2.1SCI小鼠建模 咬骨鉗切除小鼠T8～T9椎板，保護(hù)硬膜完整，Dumont型鑷子(尖部直徑為0.2 mm)造成脊髓壓迫，脊髓背側(cè)壓迫面積為0.2 mm，持續(xù)20 s。術(shù)后分別飼養(yǎng)，人工排空膀胱，2次/d。 對(duì)照組小鼠接受假手術(shù)椎板切除術(shù)，但脊髓無損傷。

1.2.2qPCR檢測(cè) 取小鼠脊髓，TRIzol法提取脊髓損傷組織總RNA并確定總RNA的純度和濃度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取適量cDNA配置PCR 反應(yīng)體系， 以 GAPDH 為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3RNA測(cè)序 使用TruSeq鏈mRNA-LT樣品制備試劑盒對(duì)WT和KO小鼠脊髓組織中RNA進(jìn)行Illumina RNA測(cè)序。Illumina HiSeq 2500對(duì)RNA序列庫(kù)測(cè)序，設(shè)置2×50 bp，各樣本讀數(shù)為7×107～1×108。隨后對(duì)RNA序列數(shù)據(jù)中的KEGG進(jìn)行綜合分析。

使用三唑試劑從不同治療組小鼠脊髓組織中提取總RNA，經(jīng)ImProm llTM逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA。SYBR試劑對(duì)mRNA進(jìn)行定量分析。以GAPDH為內(nèi)參。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。

1.2.4免疫組化和免疫熒光測(cè)定 術(shù)后第3天提取脊髓組織樣本，將部分樣品浸泡在1%牛血清白蛋白和0.3%Triton X-100中1 h以阻止非特異性反應(yīng)。分別以抗CD73、抗Neun、抗IL-1β、抗TNF-α、抗Caspase-3抗體4℃孵育過夜。PBS清洗后用相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，Dy488和Dy594結(jié)合二抗(1∶1 000)，以進(jìn)行免疫組化和免疫熒光評(píng)估。成像使用倒置顯微鏡，組織切片分別行HE、Nissl、IHC和TUNEL染色。

1.2.5Western blot分析 用RIPA緩沖液提取不同治療組小鼠脊髓組織總蛋白，BCA法分析其濃度。采用SDS-PAGE分離蛋白樣品，然后將其轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜。5%脫脂牛奶在TBST中孵育 1 h，以阻止非特異性反應(yīng)。4℃下將膜與抗體(1∶1 000)孵育過夜。在室溫下將HRP結(jié)合的二抗添加到膜中孵育1 h，并用電化學(xué)發(fā)光法使膜可見。使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行成像分析，凝膠Pro分析儀軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行測(cè)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 5.02軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)檢驗(yàn)用于確定兩組間相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SCI組織中炎癥和凋亡相關(guān)因子增加 qPCR結(jié)果表明，脊髓損傷后炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α和Caspase-3表達(dá)提高(圖1)。HE和Nissl染色結(jié)果表明脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞紊亂、腫脹和尼氏體減少更為明顯(圖2A、B)。IHC也證實(shí)，與正常對(duì)照組相比，SCI組小鼠IL-1β、TNF-α和Caspase-3表達(dá)上調(diào)(圖2C)。

圖1 SCI小鼠中炎癥因子和凋亡相關(guān)因子表達(dá)Fig.1 Expressions of inflammatory and apoptosis-related factors in SCI ratsNote:Compared with Sham group,***.P<0.001.

圖2 SCI小鼠中脊髓組織損傷情況(×400)Fig.2 Spinal cord tissue damage in SCI rats(×400)Note:A.HE staining；B.Nissl staining；C.IHC staining.

2.2CD73缺失導(dǎo)致脊髓組織損傷加重 SCI后脊髓組織中CD73的表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均上調(diào)(圖3)。TUNEL染色結(jié)果表明，與野生型小鼠相比，SCI后CD73-KO小鼠脊髓組織神經(jīng)元凋亡增加(圖4)。

圖3 CD73對(duì)SCI的影響Fig.3 Effect of CD73 on SCINote:Compared with Sham group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖4 KO和WT小鼠SCI 7 d后TUNEL染色結(jié)果Fig.4 Result of TUNEL staining of KO and WT mice after 7 d of SCI

2.3SCI引起CD73-KO和WT小鼠代謝改變 WT和CD73 KO小鼠的RNA測(cè)序結(jié)果顯示，WT和假手術(shù)動(dòng)物間存在1 649個(gè)mRNAs差異表達(dá)，與CD73 KO小鼠間有94個(gè)mRNAs差異表達(dá)。主要改變途徑包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)、鐵離子穩(wěn)態(tài)、凋亡和AMPK途徑，其中mTOR途徑的下游靶點(diǎn)4Ebp1差異顯著，而AMPK途徑也被顯著激活。表明小鼠SCI后發(fā)生了代謝改變，CD73的敲除與以上代謝改變有關(guān)。

2.4CD73 KO小鼠AMPK的激活與細(xì)胞凋亡有關(guān) 與假手術(shù)組相比，CD73 KO小鼠的p-AMPK和p-ACC表達(dá)升高(圖5)，表明SCI后AMPK通路的激活與p-mTOR和4Ebp1低表達(dá)相關(guān)。提示SCI通過AMPK/mTOR途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，損傷神經(jīng)元活性。

圖5 Western blot檢測(cè)p-AMPK、p-ACC、p-mTOR和4Epb1表達(dá)Fig.5 Expressions of p-AMPK,p-ACC,p-mTOR and 4Epb1 detected by Western blot

3 討論

SCI或外傷性腦損傷常導(dǎo)致神經(jīng)病理狀態(tài)和隨之而來的功能恢復(fù)[10]。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)在的基因調(diào)控反應(yīng)，維持正常條件下細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[8，13]。神經(jīng)元凋亡是加重SCI的原因之一，既往研究表明，細(xì)胞因子的積累能夠激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[11,12]。本研究中，TNF-α、IL-1β、IL-6均在SCI組織中明顯增加，可引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)；進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，Caspase-3和PARP在SCI小鼠中表達(dá)升高，說明SCI小鼠的脊髓組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況更加嚴(yán)重。TUNEL結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡多發(fā)生于神經(jīng)元細(xì)胞，且KO小鼠中細(xì)胞凋亡更加嚴(yán)重。為課題組進(jìn)一步探究CD73在抑制神經(jīng)元凋亡中的具體機(jī)制提供思路。

已有研究表明AMPK與AMP密切相關(guān)。在動(dòng)物體內(nèi)，AMPK的活性主要受細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值調(diào)節(jié)。體內(nèi)多種條件，如缺血、缺氧、葡萄糖缺乏、饑餓、電刺激和熱休克，以及一氧化氮、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的抑制劑，包括亞砷酸、抗霉素A、二硝基苯酚和疊氮化合物都可導(dǎo)致AMP/ATP比值上升，引發(fā)AMPK磷酸化[14，15]。CD73是一種糖基磷脂酰肌醇蛋白，在催化AMP生成磷酸和腺苷的過程中起重要作用。CD73在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中含量豐富，局灶性腦缺血上調(diào)CD73的膠質(zhì)表達(dá)[15]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CD73缺陷小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能障礙，與神經(jīng)炎癥相關(guān)的組織遭到破壞，細(xì)胞凋亡增加。本研究觀察到WT、假手術(shù)動(dòng)物和CD73 KO小鼠間mRNAs的差異表達(dá)存在于炎癥反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)、鐵離子穩(wěn)態(tài)、凋亡和AMPK途徑。其中以mTOR途徑的下游靶點(diǎn)4Ebp1差異最為顯著，而AMPK途徑也被顯著激活。提示CD73對(duì)神經(jīng)元凋亡的抑制作用可能通過AMPK途徑發(fā)揮作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)，AMPK/mTOR信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡有關(guān)[10，15]。本研究發(fā)現(xiàn)激活A(yù)MPK可抑制mTOR磷酸化，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。結(jié)果表明CD73 KO小鼠模型AMPK磷酸化水平顯著升高，mTOR水平相應(yīng)降低等都與細(xì)胞凋亡相關(guān)，表明CD73下調(diào)可能激活A(yù)MPK、抑制mTOR和4Ebp1信號(hào)從而增加細(xì)胞死亡。結(jié)果提示CD73/AMPK/mTOR/4EBP1通路在SCI中發(fā)揮作用，CD73的調(diào)節(jié)可能是抗凋亡的生存機(jī)制，為SCI治療提供參考。

綜上，SCI小鼠模型中，CD73能夠抑制脊髓繼發(fā)性損傷。下調(diào)CD73可通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)更嚴(yán)重的神經(jīng)元凋亡。CD73可能是SCI治療的靶點(diǎn)之一。